文摘

背景。放射治疗是治疗肿瘤的主要策略之一,它不可避免地造成损害相关的组织和器官治疗期间。辐射诱导心脏病(RIHD)指辐射诱导心血管副作用由胸放疗引起的。目前,没有统一的标准治疗RIHD。方法。在我们的研究中,通过管理的4 Gy辐射剂量,我们建立了一个辐射受伤的心肌细胞模型,并探讨了监管之间的关系tanshinone花絮和p38 MAPK在心肌细胞损伤。我们评估细胞损伤和扩散使用单独分析和乳酸脱氢酶(LDH)释放试验。抗氧化活性和氧化应激的措施进行了使用超氧化物歧化酶(SOD)和活性氧(ROS)。凋亡的细胞凋亡率和相对表达的蛋白质进行了使用流式细胞术和免疫印迹。评估p38和p53表达和磷酸化水平,免疫印迹。结果。实验结果表明,tanshinone花絮恢复细胞增殖在辐射诱导的心肌细胞损伤 ),和LDH的释放水平降低( )。同时,tanshinone花絮可以减少ROS生成引起的辐射( )和上调SOD水平( )。再次,tanshinone花絮减少辐射诱导心肌细胞凋亡( )。最后,tanshinone花絮下调辐射诱导p38 / p53超表达( )。结论。的治疗效果tanshinone花絮”对辐射诱导心肌损伤可能是通过调节p38 / p53通路。

1。介绍

大多数肿瘤患者接受放射治疗作为治疗肿瘤,其中超过一半接受放射治疗的肿瘤(1]。虽然放疗在肿瘤的治疗效果是有效的,正常的组织或器官的损害辐射(引起了人们广泛的关注2]。胸部放射治疗引起心肌组织损害,心脏瓣膜,冠状动脉,统称为RIHD [3,4]。的主要损伤机制RIHD从急性,慢性现在依然没有答案5]。目前,有几乎没有选择关于RIHD的治疗方法,也没有特定的药物来预防或治疗RIHD。因此,RIHD的预防和管理已经成为一个需要解决的临床问题,RIHD可以恶化癌症患者的结果以及经济负担(6,7]。

研究发现,ROS生成后辐射诱发细胞内大分子的破坏,包括脂质过氧化反应、酶失活与DNA修复酶之间的相互作用和转录因子。破坏细胞和细胞内大分子可能会导致炎症反应,压力或细胞凋亡和坏死,激活自噬等生理机制(4,8,9]。因此,减少ROS生产和炎症反应是非常重要的治疗辐射伤害(10]。根据我们小组的一项研究,辐射引起细胞凋亡增加,生长抑制ROS分泌,p38 MAPK,及其在心肌细胞磷酸化和心脏成纤维细胞,这种影响随辐射剂量(11,12]。P38 MAPK的最重要成员家庭在控制炎症反应,各种组织和细胞中普遍存在的监管非常重要的氧化应激、炎症反应和细胞凋亡。它已经表明,p38 MAPK信号通路可以降低bcl - 2并激活伯灵顿,从而发挥主要作用的过程中细胞凋亡(13]。然而,p38 MAPK信号通路在放射性心脏损伤仍是未知的。

Tanshinone花絮Danshe的主要活性成分。研究表明,tanshinone花絮有多个生物活性,特别是在抗氧化压力和衰减炎症反应,并用于治疗心脏病。它可以改善和调节心肌代谢障碍引起的组织缺氧(14]。此外,保护作用的tanshinone花絮也出现在心肌缺血;它还可以抑制血管血管平滑肌的增殖和血管内膜的增生,抑制心肌细胞Ca2 +涌入(15]。根据我们的调查结果,tanshinone花絮可以抵抗辐射的负面影响心肌细胞和心肌成纤维细胞,减少ROS的分泌,减少细胞凋亡,心肌细胞,恢复细胞活力,从而保护(11,12]。但是没有进一步的研究之间的关系tanshinone花絮和p38 MAPK信号通路。

所以我们将继续进一步研究p38的角色/ p53信号RIHD通过建立心肌细胞辐射损伤模型和监管关系tanshinone花絮和p38 / p53通路。

2。材料和方法

2.1。文化,辐射诱导损伤模型,分组

H9c2细胞系是获得中国科学院(中国上海)。在37°C,孵化器有限公司大气的95%和5%2被用来培养的细胞。DMEM(基底媒体,中国上海),10%胎牛血清(ABWbio,乌拉圭)和双抗生素被用来准备完整的培养基。当细胞数量达到了80 - 90%的文化区域,细胞用于实验。

模拟辐射诱导的心肌损伤,H9c2细胞被辐照的剂量使用西门子4 Gy博智高能直线加速器(德国西门子公司(Siemens AG)、埃朗根)。辐射剂量的选择,我们称为先前的研究的结果我们组(11,12]。辐照后,完成介质取代tanshinone花絮(最终浓度,10μg / mL,上海第一化工公司、上海、中国)和p38 MAPK受体激动剂,茴香霉素(最终浓度4μg / mL,猫。IA0770 Solarbio,北京,中国)。48小时后,细胞用于实验之前没有改变介质。

实验小组如下:对照组,4 Gy集团4 Gy +受体激动剂组,4 Gy + tanshinone花絮”集团和4 Gy + tanshinone花絮+受体激动剂组。

2.2。单独分析

细胞与胰蛋白酶消化细胞悬浊液和计算做准备。1000个细胞被播种在每个60毫米。24小时后细胞粘附,辐射生成细胞模型,进行药物治疗,然后,细胞继续培养两周按常规的协议。两周后,丢弃旧媒介后,细胞被固定使用甲醇与染色染色法染色之前解决方案(猫。北京DM0002 Leagene生物技术)。最后,细胞殖民地(≥50细胞)的数量统计,和克隆形成率计算。

2.3。细胞凋亡检测

我们选择使用双相障碍评估凋亡细胞凋亡检测设备(猫。559763年,BD Pharmingen)和实验进行了完全按照指示使用。4 Gy的剂量照射细胞和药物治疗;这是用来做实验经过48小时的日常文化。使细胞悬液后,5μ添加了L PE和7-AAD试剂,紧随其后的是15分钟反应受光。最后,结果被流式细胞分析仪(BD LSRFortessa)在1 h。

2.4。LDH和SOD测定和ROS流仪分析

细胞有x射线辐照剂量的4 Gy,给予药物治疗,然后经常培养48 h在实验之前使用。接下来,蛋白质从细胞中提取。SOD活性和LDH释放量检测工具。细胞实验处理0.1更易·L1DCFH-DA。荧光DCFH DCFH-DA可以通过活性氧氧化。然后,ROS水平通过流式细胞仪测定。我们使用相关工具来完成上述每个化验(南京建成生物工程研究所、南京、中国)。积极的和消极的控制被添加到分组根据指令ROS的工具包。ROS的具体分组实验如下:消极的控制,积极控制,控制集团4 Gy集团4 Gy +受体激动剂组,4 Gy + tanshinone花絮”集团和4 Gy + tanshinone花絮+受体激动剂组。

2.5。免疫印迹分析

首先,裂解缓冲和phenylmethylsulfonyl被用来从每组的细胞中提取蛋白质。一个聚乙二烯二氟化物膜被用于捕获蛋白质电泳(sds - page)隔开。阻塞后5%的脱脂牛奶,主要抗体(兔子)孵化的膜。二次抗体(山羊anti-rabbit)然后用薄膜在室温下孵化。最后,膜的可视化是一个成像系统(6100年ChemiScope Clinx科学仪器有限公司)。兔抗体对GAPDH(猫。10494 - 1 - ap),伯灵顿(猫。50599 - 2 - ig)、bcl - 2(猫。26593 - 1 - ap), p38(猫。14064 - 1 - ap), p53(猫。10442 - 1 - ap),和Caspase-3(猫。19677 - 1 - ap)从Proteintech购买集团(武汉、湖北、中国)。和兔抗体p-p38(猫。9211)和p-p53(猫。2521)从细胞信号技术购买(丹弗斯,麻萨诸塞州,美国)。我们添加了tanshinone花絮”组和p38受体激动剂组分组,为了确定的独立影响tanshinone花絮和心肌细胞受体激动剂。具体分组如下:对照组,tanshinone活动花絮,受体激动剂组,4 Gy集团4 Gy +受体激动剂组,4 Gy + tanshinone花絮”集团和4 Gy + tanshinone花絮+受体激动剂组。确定条带的灰度值模式,我们使用图像J(版本1.53),以及由此产生的灰值被规范化。 GAPDH was used as reference.

2.6。统计分析

分析了这些结果使用SPSS 20.0 (IBM . n:行情))和作为 。在两组之间的对比,单向方差分析(方差分析)。它被认为是显著时 是使用。

3所示。结果

3.1。Tanshinone花絮废除辐射诱导心肌细胞增殖的抑制作用

H9C2细胞的增殖和损伤评估单独分析和LDH释放试验,结果如图1和2(一个)。4 Gy集团对照组比较,H9C2细胞单克隆率降低( )而LDH的释放水平增加( )。当发现治疗后tanshinone活动花絮,细胞单克隆H9C2细胞增长速度( ),和LDH释放拒绝( )。这表明tanshinone花絮抑制辐射诱导心肌细胞损伤,增强细胞的增殖能力。当进一步管理p38 MAPK受体激动剂治疗,发现细胞克隆细胞率显著降低( ),和LDH水平也显著增加( ),表明p38 MAPK加重损伤和抑制细胞增殖。

(一)
(一)
(b)
(b)
图1
在心肌细胞增殖效应的辐射和tanshinone花絮。(a)单独试验的结果表明,辐射可以抑制正常心肌细胞生长,而tanshinone花絮”可以在一定程度上消除这种抑制作用。(b)细胞克隆实验的结果表示为殖民地的细胞的数量。 , ,和 。
(一)
(一)
(b)
(b)
图2
辐射和tanshinone花絮”对心肌细胞的影响被测量检测LDH释放(a)和SOD活性(b)。 提出了为每个结果( )。 , ,和 。LDH:乳酸脱氢酶;SOD:超氧化物歧化酶。
3.2。Tanshinone花絮可以减少辐射诱导心肌细胞氧化应激

探索是否tanshinone花絮有能力发挥抗氧化活性,我们执行ROS和SOD活性测量,如图2 (b)和3。实验结果表明,ROS增加H9c2细胞( ),而SOD降低4 Gy集团( ),而LDH增加以同样的方式( )。治疗后与tanshinone活动花絮,细胞的抗氧化能力明显恢复。Tanshinone花絮增加SOD水平( );与此同时,ROS ( )和LDH ( )降低了。当进一步处理p38 MAPK受体激动剂,LDH ( ),ROS ( ),和SOD ( )所有显著上升,这表明p38 MAPK使细胞耐氧化和氧气变得非常活跃,但与此同时,细胞损伤也加剧。

(一)
(一)
(b)
(b)
图3
影响辐射和tanshinone花絮在心肌细胞氧化应激。(a)每个分组的ROS概要细胞是由流式细胞术。(b)为ROS染色表示为积极的利率 。所有的结果了 ( )。 和 。ROS:活性氧;NC:负控制;PC:积极的控制。
3.3。Tanshinone花絮可以减少心肌细胞的凋亡由辐射引起的

细胞凋亡测定表明,tanshinone花絮抑制辐射诱导心肌细胞凋亡( )。然而,在p38 MAPK受体激动剂的使用,细胞凋亡率再次显著增加( )。结果显示免疫印迹分析,4 Gy辐照后,伯灵顿的表情在心肌细胞升高,有显著减少bcl - 2和bcl - 2、Bax水平( )。当它被发现后tanshinone花絮治疗管理,bcl - 2 /伯灵顿比率升高( )。这表明tanshinone花絮抑制细胞凋亡。最后,bcl - 2、Bax升高4 Gy + tanshinone +受体激动剂组( )。上述结果如图4和5。

(一)
(一)
(b)
(b)
图4
在心肌细胞凋亡效应的辐射和tanshinone花絮。(一)每组使用流式细胞仪检测细胞凋亡。(b)结果表示为 ( )。 。
(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
(f)
(f)
(g)
(g)
(h)
(h)
图5
p38的表达/ p53通路和凋亡相关蛋白。(a)这是一个典型的免疫印迹的形象。(b) P38的表达水平。(c) p-p38 / p38的比例。(d)的比值p-p53 / p53。(e)伯灵顿表达水平。(f) bcl - 2表达水平。(g)的比率bcl - 2 /伯灵顿。(h) Caspase-3表达水平。GAPDH是用作参考。 The results are expressed as 。 和 。
3.4。Tanshinone花絮下调辐射诱导p38 /在心肌细胞p53通路过度

我们发现p53和p38的磷酸化在心肌细胞辐射后,与对照组相比,( )。它表明,p38 / p53通路被激活在辐射损伤。后管理tanshinone活动花絮,p38和p53磷酸化水平下调,表明tanshinone花絮监管影响p38 / p53通路在辐射损伤 )。比较4 Gy +受体激动剂组和4 Gy + tanshinone花絮+受体激动剂组透露,tanshinone花絮会抑制p38的表达/ p53激活受体激动剂( )。上述结果如图5。

4所示。讨论

接受放射治疗的胸肿瘤可引起RIHD。目前研究方向主要集中在炎症反应、氧化应激和细胞凋亡16,17]。LDH被认为是细胞损伤的指标。我们发现,在目前的研究中,当tanshinone花絮治疗管理辐射受伤的心肌细胞,细胞克隆细胞能力明显恢复,而LDH水平降低了。这表明,辐射诱导心肌细胞损伤降低了tanshinone活动花絮,恢复细胞的可行性。

细胞,抗氧化作用是一个重要的自我保护的机制,细胞可以利用抗氧化剂造成的损害和/或亲电试剂。有许多抗氧化剂对抗细胞内ROS的蛋白质,而这些酶包括硫氧还蛋白还原酶(TrxR)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、和硫氧还蛋白(硫氧还蛋白),其他(18]。SOD是一个至关重要的抗氧化酶,保安对氧化损伤生物年龄。因此,激活细胞内SOD对细胞内ROS的控制是至关重要的。目前,许多研究发现,辐射损伤会导致ROS高程异常,在这项研究中,同样证实而SOD可以保护细胞不受氧化应激(19,20.]。后tanshinone花絮”管理,ROS在心肌细胞减少,伴随着SOD升高,说明细胞抗氧化能力的提高。Tanshinone花絮”防辐射诱导的心肌细胞损伤上述研究。

p38 MAPK扮演着重要的角色在细胞增殖、分化、炎症和细胞凋亡21,22]。先前的研究已经表明,人们可以使磷酸化凋亡蛋白如bcl - 2, MCL1,和Bclxl,从而允许这些蛋白质降解[23- - - - - -26]。与此同时,人们可以使磷酸化伯灵顿,伯灵顿无法绑定到bcl - 2 (27]。上述研究可以确定中发挥的重要作用p38的过程中细胞凋亡。可以在磷酸化激活p53 p38现场46岁,随后,另一个proapoptotic蛋白质,彪马被激活,从而发挥proapoptotic效应(28- - - - - -30.]。在目前的研究中,人们/ p53通路被激活后心肌细胞的辐射,而伯灵顿bcl - 2表达增加和减少,这说明p38 / p53在细胞凋亡发挥了作用。当tanshinone花絮”管理,p38 / p53表达减少,和bcl - 2、Bax增加,细胞凋亡率降低了。同样,比较4 Gy +受体激动剂组和4 Gy + tanshinone花絮+受体激动剂组,我们发现p38 / p53表达减少和bcl - 2 /伯灵顿后增加管理tanshinone花絮”,这与细胞凋亡实验的结果是相一致的。我们证明了p38 / p53通路下调了tanshinone花絮保护辐射诱导的心肌损伤。

在以前的研究中,tanshinone花絮有许多对心肌保护作用。例如,tanshinone花絮可以减弱心室重构在大鼠心脏衰竭(31日]。Tanshinone花絮能够保护心脏功能,调节血管生成在小鼠心肌缺血32]。结合之前的研究由我们集团tanshinone花絮可以保护心肌细胞减少辐射诱导细胞凋亡的差别通过对这些p38 / p53通路。并预测,p38 MAPK可以作为治疗方法针对抑制减少辐射损伤和提供新策略来预防和治疗RIHD。

缩写

7-AAD: 7-Aminoactinomycin D
方差分析: 方差分析
伯灵顿: b细胞淋巴瘤2-associated X蛋白
BCA: Bicinchoninic酸
基类库: b细胞淋巴瘤
半胱天冬酶: 半胱氨酰特定天冬氨酸蛋白酶
DCFH-DA: 2,7-Dichlorodi-hydrofluorescein二乙酸
DMEM: 杜尔贝科鹰介质的修改
背景: 脱氧核糖核酸
GAPDH: Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶
LDH: 乳酸脱氢酶
MAPK: 增殖蛋白激酶
MCL1: 髓细胞白血病1
体育: 藻红蛋白
彪马: P53调节细胞凋亡的调制器
RIHD: 辐射诱导心脏病
ROS: 活性氧
SOD: 超氧化物歧化酶
SPSS: 统计产品服务解决方案。

数据可用性

本研究中所有生成的数据或分析包括在发表的这篇文章。

的利益冲突

作者声明没有利益冲突。

作者的贡献

谢平和易建联李提出,设计整个研究,给当实验进行指导。王帮王、李马和Bo-wen执行的主要实验任务和参与写作的手稿。王Fentang高,剑锋,胡安,天成张收集的数据,建议,修订后的手稿在其写作。弘益Cai提供并指导使用放射性仪器和教postradiation并发症的相关知识。郝郭在实验中做了一些工作。帮王先生和李马贡献同样co-first文章的作者。谢平和易建联李贡献同样cocorresponding文章的作者。

确认

中国国家自然科学基金的资助(81860047)支持这项研究。