文摘
背景。长非编码rna (lncRNAs)在生理和病理活动重要的监管职能在骨肉瘤发展。重要的是要阐明的表达模式,揭示出其潜在的机制新发现lncRNAs。方法。在此,我们筛选差异表达lncRNAs使用lncRNA微阵列在骨肉瘤肿瘤细胞系。候选人lncRNA进一步验证了存在,基因表达与临床病理特征评估协会《京都议定书》全书的基因和基因组(KEGG)路径分析。针对microrna被确认使用母星分析,竞争内源性RNA(龙头)网络建立了字符串。超表达和沉默RNA的检测到存在。骨肉瘤细胞增殖测定CCK-8化验,迁移和入侵与Transwell试验评估。集落形成试验观察。流式细胞仪进行细胞周期。免疫印迹检测有丝分裂执行标记和apoptosis-related蛋白质。裸鼠肿瘤形成实验被用来评估骨肉瘤发展在活的有机体内。Cooverexpressing miR-34b-3p RAD51逆转miR-34b-3p-induced增殖的变化,细胞周期,H2A的表达。X, apoptosis-related的蛋白质。结果。HCG9被确认为osteosarcoma-associated lncRNA。骨肉瘤组织和细胞系表达高水平的HCG9比正常组织和成骨细胞,和高表达HCG9进一步证明是与转移和骨肉瘤在临床情况下的成绩。击倒HCG9抑制增殖、迁移和入侵骨肉瘤细胞。HCG9 miR-34b-3p被确认为目标,RAD51 miR-34b-3p的作为一个潜在的目标。Cooverexpressing miR-34b-3p HCG9部分抑制HCG9-stimulated扩散,骨肉瘤细胞的迁移和入侵在体外和延迟肿瘤进展在活的有机体内。结论。我们发现lncRNA HCG9通过抑制miR-34b-3p促进了骨肉瘤细胞的增殖。我们的研究提供了新颖的生物标志物和潜在治疗骨肉瘤治疗的目标。
1。介绍
骨肉瘤是最常见的原发性骨恶性肿瘤,主要发生在青少年1]。尽管诊断发展,化疗和手术技术,骨肉瘤的预后仍然贫穷。局部骨肉瘤的长期存活率为77%,而这种疾病变得更致命的转移发生时,长期存活率下降26%。据美国癌症协会尽管底层骨肉瘤的分子机制尚不清楚,已经扩展到广泛的努力探索更具针对性和局部治疗骨肉瘤(2]。与不断增长的知识分子发病机理、基因治疗已经成为控制,有针对性,具体治疗骨肉瘤(3,4]。
超过90%的人类基因组不编码蛋白质,公认为“非编码rna”(ncRNAs) [5]。长非编码rna (lncRNAs)是一类ncRNAs包含超过200个核苷酸。越来越多的证据表明,lncRNA特异表达基因的表达与肿瘤进展相关(6- - - - - -8]。第一项研究在骨肉瘤是由李lncRNA et al .,发现超过400调节和798下调lncRNAs lncRNA微阵列表达,在骨肉瘤为骨肉瘤(提供有价值的潜在生物标记物9]。高和丽安报道,lncRNA MALAT1是一个独立的骨肉瘤的预后因子10),另一个lncRNA段H19,也被证明是与骨肉瘤发展(11]。HCG9也被称为人类白细胞抗原复杂组9基因研究报道,HCG9有关肺鳞状细胞癌(12和鼻咽癌13]。然而,HCG9在骨肉瘤中的作用仍然是未知的。
lncRNAs的主要功能之一是充当竞争内源性rna(龙头)调节lncRNA / microrna的mRNA相声(14]。龙头、假说提出了Salmena et al。15]。他们猜测lncRNAs完成通过部分互补microrna的结合位点,从而导致信使rna调控的microrna的活动减少。自那时以来,许多研究人员已经验证了这个理论16]。在骨肉瘤特别是锅等人报道,lncRNA FBXL19-AS1擦掉mir - 346对骨肉瘤细胞增殖(17]。郑等人连接lncRNA SNHG3 / mir - 151 - a - 3 - p / RAB22A功能轴调节骨肉瘤侵袭和迁移18]。然而,许多潜在lncRNA / microrna的法规尚未被识别。
在这项研究中,我们进行了lncRNA微阵列分析和确认HCG9 lncRNAs在骨肉瘤组织中表达的差异之一。据我们所知,这是第一个报告将HCG9与骨肉瘤发展相关联。我们建立了一个龙头、网络,针对microrna miR-34b-3p查明。HCG9之间的交互和miR-34b-3p与生物信息学分析和分子生物学分析验证,我们还报道,RAD51是潜在的下游mRNA的目标mir - 334 b - 3 - p。HCG9击倒和超表达在骨肉瘤细胞的影响在体外和肿瘤进展在活的有机体内被评估。我们的研究结果提供了新颖的生物标志物的骨肉瘤和显示底层机制的理论基础。
2。材料和方法
2.1。lncRNA微阵列芯片和生物信息学分析
lncRNA基因表达在骨肉瘤组织和paracarcinoma组织进行了分析。GSE21257数据集从GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/)是用作参考。单变量Cox回归分析被用来识别差异表达lncRNAs。一个最低 - - - - - -褶皱的变化肿瘤组织和正常组织之间的基因表达 筛选。癌症细胞系百科全书数据库被用来作为参考来验证HCG9表达癌细胞。
骨肉瘤的生存信息用于生成kaplan meier单独生存分析和log-rank测试HCG9表达之间的相关性和存活率。京都基因和基因组的百科全书(KEGG)通路进行分析建立HCG9之间的关系和骨肉瘤的临床病理特征。
龙头、网络评估蛋白质之间的相互作用生成的字符串(2017版)标准的总和 。蛋白质的可视化交互(PPI)网络得到Cytoscape软件(版本3.6.1)。分子复杂的检测(MCODE,版本1.31)采用识别重要的模块和顶级基因在PPI网络。
2.2。组织收集
总数47病人肿瘤切除手术从第二湘雅医院招募。15对骨肉瘤和paracarcinoma组织收集病人的同意所有的调查研究中。患者术前知情并签署书面同意。所有程序和组织收集协议的机构审查委员会批准第二湘雅医院。组织标本保存在液氮或固定在10%福尔马林实验的执行。
2.3。细胞培养和转染
成骨细胞细胞系hFOB1.19和骨肉瘤U2OS细胞行,mg - 63和MNNG /居屋计划都写明ATCC(马纳萨斯,弗吉尼亚州)购买的。在杜尔贝科修改鹰的培养基培养细胞(DMEM) (Gibco)含10%胎牛血清在5%的股份有限公司2气氛在37°C。细胞转染,HCG9 overexpressing质粒,HCG9小干扰rna (siRNAs)和消极的控制从热费希尔科学公司购买miR-34b-5p模仿和消极控制购买试剂盒。转染是使用Lipofectamine执行2000(热费希尔科学、沃尔瑟姆,MA)根据制造商的协议。细胞收获在48小时posttransfection表征。
2.4。Transwell化验
细胞迁移和入侵都与Transwell系统评估。对于迁移试验, 细胞在100年被停职μL血清DMEM和播种的心房8μ米孔隙大小Transwell板(美国康宁公司)。入侵检测,参议院的8μ米孔隙大小Transwell板与人工基底膜板™矩阵(BD生物科学、钙、美国),和 细胞被播种,在无血清DMEM培养。
对于这两个化验,总成交量为500μL含10%胎牛血清的DMEM (Gibco)添加到下室。在文化24 h后,底部的迁移和入侵细胞表面和4%多聚甲醛固定,结晶紫沾1%。细胞与直立蔡司显微镜观察。染色洗用33%乙酸,吸收在590 nm分析标(热费希尔科学)。
2.5。细胞计数Kit-8 (CCK-8)测定
细胞增殖与CCK-8评价试验(Dojindo、日本)。野生型控制和转染细胞收获和播种到96孔板。每组三个技术重复进行。细胞粘附和24小时后的文化,10μL CCK-8的解决方案是添加到每个在37°C和孵化4 h。细胞增殖是评估标(Bio-Rad实验室、大力神、CA)在450海里。
2.6。集落形成
野生型和转染细胞被播种在6-well板密度800细胞/。10天后在文化、细胞被固定为4%多聚甲醛结晶紫染色和1%。染色洗用33%乙酸,吸收在590 nm分析标(热费希尔科学)。
2.7。定量实时聚合酶链反应(存在)
总RNA与骨肉瘤肿瘤组织,paracarcinoma软组织,细胞系使用试剂盒®试剂(表达载体、钙、美国)。互补脱氧核糖核酸合成使用PrimeScript™RT试剂盒(ComWin生物技术,北京)。引物HCG9和miR-34b-5p获得热费希尔科学。引物序列见表1。与SYBR PCR进行绿色主人混合(ComWin生物技术,北京)使用荧光定量PCR系统(美国热费希尔科学)。使用2的相对表达水平计算- - - - - -ΔΔCt方法,GAPDH和U6被用作内部参考mrna和microrna。
2.8。免疫印迹
细胞或组织细胞溶解在里帕裂解缓冲(Beyotime生物科技、上海、中国)10分钟在冰上。蛋白质浓度测定用BCA蛋白质化验设备。等量的蛋白质被加载并使用SDS-polyacrylamide凝胶电泳分离。被转移到硝化纤维膜的蛋白质。膜被封锁在一个1 x PBS缓冲包含5%脱脂乳和0.1% Tween-20 (PBST)在室温下1 h,随后沾主要抗体在一夜之间在4°C,包括β肌动蛋白(鼠标,1:5000;猫# 66009 - 1 - ig;美国Proteintech), H2A。X(鼠标,1:1000;猫# ab26350;英国Abcam)、RAD51(兔子,1:1000;猫# ab133534;英国Abcam)、p53(鼠标,5μg / mL;猫# ab26;英国Abcam)、bcl - 2(兔子,1:1000;猫# 12789 - 1 - ap;美国Proteintech)、伯灵顿(兔子,1:1000;猫# 50599 - 2搞笑;美国Proteintech)和Caspase-3(兔子,1:1000;猫# 19677 - 1 - ap;美国Proteintech)。与PBST洗3次后,膜与辣根peroxidase-conjugated山羊anti-rabbit孵化(1:6000; cat# SA00001-2; Proteintech, USA) or goat anti-mouse antibodies (1 : 5000; cat# SA00001-1; Proteintech, USA) for 1.5 h at room temperature. After 1 min incubation with enhanced chemiluminescence (SuperECL Plus, Advansta, USA), the signal intensity was detected by X-ray.
2.9。细胞周期分析
细胞在不同转染组与PBS收集和清洗。与冰冷的70%(固定后 )乙醇24 h, PBS的样本再洗,然后孵化与核糖核酸酶(100μg / mL) 30分钟。样本沾π(最后50浓度μ30分钟的g / mL),流式细胞术分析进行确定细胞周期的分布。
2.10。在活的有机体内肿瘤发生
雄性BALB / C裸小鼠(6周的年龄)从湖南SJA购买实验动物有限公司有限公司(长沙,中国)和安置在动物设施在第二个湘雅医院。所有实验协议动物伦理委员会批准的机构在第二个中南大学湘雅医院。肿瘤的形成, 200年MNNG / HOS细胞被停职μL PBS和注入皮下区域。慢病毒载体HCG9和miR-34b-3p由GeneChem(中国上海)和前通过侧尾静脉注射接种的肿瘤细胞被注入。肿瘤体积测量游标卡尺在天4、7、11、14、17、21、24、28。在28天参与,小鼠安乐死和肿瘤的解剖测量体重。
2.11。Ki67染色
肿瘤样本收集和固定在10%福尔马林在室温下过夜。样本逐渐脱水乙醇和嵌入在石蜡块。部分5μm收集、deparaffinized和水化。三羟甲基氨基甲烷缓冲液中的抗原被沸腾的检索( )使用船15分钟。样品被封锁在1%牛血清白蛋白溶液(Sigma-Aldrich)和染色与主Ki67抗体(兔子,1:500;ab15580;Abcam)一夜之间在4°C。样本与PBS洗涤后,用辣根过氧化物酶染色(合)(山羊;猫# ab6721;英国Abcam)二级抗体1:在室温下250浓度为1小时。彩色样本安装和直立蔡司显微镜下观察。
2.12。统计分析
所有数据了 ,和所有的实验都重复独立至少3次。学生的 - - - - - -测试和单向方差分析被用来比较两组之间的数据和在三组,分别使用GraphPad Prism 8.0。 被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。HCG9基因表达在骨肉瘤组织和细胞升高
我们分析了lncRNA芯片数据和评估相关使用Cox比例风险回归为每个lncRNA骨肉瘤。六个基因呈现统计上显著的表达式( )在骨肉瘤组织中与paracarcinoma组织和筛选,MALAT1, HCG9, FAM99A, FAM87B DLEU2, C8orf49(图1(一))。二次结构识别使用AnnoLnc执行注释,HCG9决心作为本研究(图我们的目标1 (b))。我们分析了HCG9基因表达在癌症细胞系百科全书(CCLE)数据库,发现HCG9基因表达升高在各种癌症细胞系(图1 (c))。因此,我们进一步验证HCG9基因表达在骨肉瘤和paracarcinoma组织收集的患者。中存在的结果表明HCG9基因表达显著调节骨肉瘤肿瘤组织比paracarcinoma组织(图1 (d))。HCG9基因表达也评估了在人类胎儿成骨细胞细胞系hFOB1.19和骨肉瘤U2OS细胞行,mg - 63和MNNG /居屋,表达式是增强在所有三个骨肉瘤细胞系相比hFOB1.19细胞。MNNG /居屋计划展示了最高HCG9基因表达。因此,MNNG / HOS细胞被选为以下实验研究中(图1 (e))。我们分析了整体存活率通过绘制kaplan meier生存情节和log-rank测试值一分为二HCG9基因表达,和 被认为是具有统计学意义。接受者操作特性曲线(ROC)策划,和曲线下的面积(AUC)进行了分析验证HCG9基因表达和预后之间的关系(补充图。1)。AUC 0.72 2年的准确性。kaplan meier情节表明,整体存活率显著降低( )HCG9高表达组与低表达组(图1 (f)),这表明HCG9与骨肉瘤患者的预后相关。
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3.2。HCG9介导的骨肉瘤细胞增殖和细胞凋亡
我们下一个调查HCG9如何表达骨肉瘤细胞的增殖和凋亡的影响。我们建立了一个HCG9基因可拆卸的殖民地(sh-HCG9)和验证HCG9的基因表达中存在。在sh-HCG9 HCG9基因表达显著抑制细胞比野生型细胞(图的控制2(一个))。sh-HCG9 MNNG /居屋的入侵和迁移能力受损细胞。入侵和迁移细胞的数量显著降低在sh-HCG9组比对照组(数字2 (b)和2 (c))。击倒HCG9也抑制MNNG / HOS细胞增殖和集落形成,随着CCK-8化验结果和集落形成结果表明显著降低扩散率和菌落计数sh-HCG9组比对照组(数字2 (d)和2 (e))。sh-HCG9诱导细胞逮捕,如细胞周期分析所示,G0 / G1期显著增强,G2 / M期显著抑制sh-HCG9组(图2 (f))。sh-HCG9也提升proapoptotic蛋白表达,包括伯灵顿,Caspase-3、p53、抑制凋亡蛋白bcl - 2(图2 (g))。这些结果表明枯竭HCG9显著地抑制增殖和入侵,诱导细胞逮捕,促进了骨肉瘤细胞的凋亡表型。
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3.3。HCG9表达与骨肉瘤患者的病理特征
我们分析了HCG9和筛选HCG9-associated基因表达矩阵的表达式( )。使用KEGG通路分析,我们发现HCG9的高表达与骨肉瘤的转移(补充图。2)。HCG9和临床病理特征之间的关系,比如年龄、性别、转移、年级,和病理状态提出了补充图。2 b- - - - - -2 f。高HCG9表达与肿瘤转移相关(补充图。二维)和年级(补充图。2 e)而不是其他病理特征,如年龄(补充图。2 b)、性别(补充图。2摄氏度)。我们收集44骨肉瘤病例从第二湘雅医院和HCG9和临床病理特征之间的关系进行验证。皮尔逊卡方测试进行评估价值。重大协会之间确定HCG9基因表达和远处转移( )(补充图。二维)和临床分期( )(补充图。2 e)。这些结果表明,HCG9基因表达在骨肉瘤转移和临床进展至关重要。
3.4。HCG9消极监管miR-34b-3p调解骨肉瘤细胞增殖和细胞凋亡
我们使用母星V2.0预测HCG9的潜在目标,和miR-34b-3p HCG9被认定为唯一目标。总数量104 mrna miR-34b-3p查明作为潜在的目标;因此,电抗器,网络建立和呈现在图3(一个)。针对mrna的分布在染色体被Cytoscape可视化(图3 (b))。字符串分析(http://string-db.org/)上执行miRNA-targeted基因,40 PPI网络是由节点和46个边缘。通过执行MCODE,确定了两个模块(图3 (c))。模块1包括AHCTF1 XPO1、ITGB3BPP PPP1CC,免疫响应基因,和模块2包括CDH2,满足,和NOTCH2与DNA损伤反应(19,20.]。基因本体论(去),生物过程(BP)和KEGG浓缩分析显示,调节基因丰富的细胞器和细胞周期通路分工和microrna的表达下调基因富集在癌症和Notch信号通路(补充图。3)。miR-34b-3p的基因表达显著下调骨肉瘤组织和细胞系相比paracarcinoma组织和成骨细胞细胞系,分别(数字3 (d)和3 (e))。击倒的HCG9显著增强miR-34b-3p基因表达,暗示HCG9消极监管miR-34b-3p(图3 (f))。过度的miR-34b-3p明显调节miR-34b-3p的表达水平(图3 (g))。
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验证miR-34b-3p的监管作用在骨肉瘤细胞增殖,迁移和入侵,我们建立了HCG9 miR-34b-3p overexpressing MNNG / HOS细胞。HCG9超表达显著增强细胞增殖在24 h(文化)和cooverexpressing HCG9和miR-34b-3p部分逆转这样的效果(图4(一))。HCG9提倡克隆形成能力,而cooverexpressing HCG9和miR-34b-3p部分减少了殖民地的数量相比HCG9组(数字4 (b)和4 (c))。Cooverexpressing miR-34b-3p也抑制MNNG / HOS细胞入侵和迁移被HCG9刺激过度(数字4 (d)和4 (e))。细胞周期和apoptosis-related蛋白质也影响HCG9和miR-34b-3p表达式。Overexpressing HCG9鼓励细胞有丝分裂细胞流式细胞术结果显示数量的G2 / M周期HCG9组明显高于对照组。Cooverexpressing HCG9 miR-34b-3p废除这样的效果(图4 (f))。RAD51是调节细胞周期的关键酶和蜜饯G2 / M期,而H2A。X保留了细胞周期阻滞。Overexpressing HCG9提升RAD51表达和抑制H2A。X表达式,表明HCG9诱导有丝分裂和骨肉瘤细胞的增生。Cooverexpressing miR-34b-3p部分逆转这样的效果(图4 (g))。Caspase-3 Proapoptotic蛋白质伯灵顿,p53被HCG9抑制过度和逆转miR-34b-3p / HCG9 cooverexpression。凋亡蛋白bcl - 2是相反的方式(图的影响4 (h))。这些结果表明,HCG9增强骨肉瘤细胞的增殖和抑制细胞凋亡抑制miR-34b-3p表达式。Overexpressing miR-34b-3p部分逆转HCG9-stimulated增生。
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3.5。通过下调miR-34b-3p诱导细胞周期阻滞RAD51
我们下一个评估miR-34b-3p的潜在目标。RAD51调节细胞周期、DNA损伤检查点和这些通路显著调节在临床骨肉瘤组织样本(补充图。3)。miR-34b-3p之间潜在的结合位点和RAD51预测使用母星(图5(一个))。我们建立了miR-34b-3p overexpressing和miR-34b-3p / RAD51 cooverexpressing骨肉瘤细胞评估RAD51的参与。miR-34b-3p明显的表达调节的miR-34b-3p超表达组和部分逆转miR-34b-3p / RAD51 cooverexpression组(图5 (b))。CCK-8化验结果表明,miR-34b-3p过度抑制细胞增殖,与对照组相比,而miR-34b-3p / RAD51 cooverexpression骨肉瘤细胞的增殖(图中恢复过来5 (c))。RAD51 miR-34b-3p-mediated细胞周期也起到一定的作用,和miR-34b-3p过度诱导细胞周期阻滞,因为它减少了在G2 / M期细胞数量与对照组相比,虽然miR-34b-3p / RAD51 cooverexpression恢复G2 / M期(图5 (d))。由miR-34b-3p RAD51蛋白表达显著抑制过度和恢复miR-34b-3p / RAD51 cooverexpression。细胞周期阻滞H2A标志。X是相对的(图的影响5 (e))。miR-34b-3p增强proapoptotic蛋白质的表达,包括伯灵顿,Caspase-3, p53、bcl - 2抑制抗凋亡蛋白的表达。miR-34b-3p / RAD51 cooverexpression部分逆转miR-34b-3p的这样的效果(图5 (f))。这些结果表明,miR-34b-3p RAD51可以作为潜在的目标,发挥了至关重要的作用在HCG9 / miR-34b-3p功能轴。
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3.6。HCG9促进骨肉瘤发展而miR-34b-3p HCG9-Stimulated骨肉瘤改善进展在活的有机体内
我们评估的角色HCG9和miR-34b-3p调节骨肉瘤发展在活的有机体内使用裸鼠模型。相比肿瘤控制,HCG9超表达显著聚合肿瘤生长,和coexpressing miR-34b-3p部分减毒HCG9-stimulated肿瘤生长,肿瘤体积和重量分析(即可见一斑6(一)- - - - - -6 (c))。免疫组织化学染色结果显示过度Ki67-positive细胞HCG9 overexpressing集团和HCG9 / miR-34b-3p cooverexpressing集团部分Ki67-positive细胞数量减少(图6 (d)),表明miR-34b-3p减轻肿瘤侵犯HCG9刺激。基因的表达HCG9、miR-34b-3p RAD51存在验证overexpressing效率进行评估。HCG9过度抑制miR-34b-3p和提升RAD51,而cooverexpressing HCG9 / miR-34b-3p逆转这样的效果(图6 (e))。免疫印迹结果进一步证实,RAD51蛋白表达的积极影响HCG9过度和逆转HCG9 / miR-34b-3p cooverexpression。H2A。X蛋白表达是相反的方式(图的影响6 (f))。HCG9过度诱导凋亡表型的肿瘤组织,因为它抑制proapoptotic伯灵顿,Caspase-3, p53表达和促进凋亡bcl - 2表达。Cooverexpressing HCG9 / miR-34b-3p部分屏蔽(图凋亡的影响6 (g))。的在活的有机体内结果证实,HCG9加剧肿瘤进展和miR-34b-3p逆转这样的效果。
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4所示。讨论
远处转移往往与手术后骨肉瘤。据报道,转移发生在超过85%的患者骨肉瘤(21),转移大大加重骨肉瘤的预后(22]。最近的研究表明,lncRNAs表现出重要的监管职能调节骨肉瘤转移(23]。在我们目前的研究中,我们开发了一个全基因组方法链接lncRNA HCG9骨肉瘤的临床病理特征,尤其是转移。我们发现高HCG9与转移和严重的癌症相关成绩。骨肉瘤细胞的增殖、迁移和入侵响应HCG9基因表达的改变。利用生物信息学技术,我们建立了HCG9龙头、网络和目标microrna的决心。据我们所知,这是第一个研究报道HCG9的至关重要的监管作用,在骨肉瘤发展其潜在机制。
lncRNA特异表达基因的表达在肿瘤组织中普遍存在。尤其是对骨肉瘤,越来越多的研究已经报道各种lncRNAs表示不同肿瘤组织和paracarcinoma组织(9]。核糖核酸微阵列是一种强大的工具屏幕lncRNA表情异常在肿瘤和paracarcinoma组织,为基因治疗提供潜在的候选人(24]。由微阵列分析了超过25000 lncRNAs,成千上万的osteosarcoma-associated基因被确定(25]。其中确定lncRNAs,少量的肿瘤抑制的作用和致癌lncRNAs骨肉瘤被阐明。例如,MALAT1是首次发现癌症相关的基因,它通常是研究骨肉瘤。王等人报道,lncRNA MALAT1骨肉瘤肿瘤组织中高度表达,促进肿瘤转移(26]。人类负重外骨骼,等致癌lncRNAs段H19 SNHG12,和热空气还演示了他们的监管职能在促进肿瘤细胞增殖,抑制细胞凋亡,加重肿瘤恶化[27- - - - - -30.]。在此,我们筛选6 osteosarcoma-related lncRNA微阵列基因,MALAT1, HCG9, FAM99A, FAM87B DLEU2, C8orf49。MALAT1和DLEU2已经被证明能够促进骨肉瘤在先前的研究进展31日,32]。FAM99A、FAM87B C8orf49尚未在骨肉瘤的研究和报道很少在其他癌症。由于资金和时间的限制,我们并没有进行深入的研究。在未来的研究中,我们将进一步确定它们是否与骨肉瘤相关联。HCG9已经在乳腺癌和胃癌简要报告(33,34但从未在骨肉瘤。通过分析CCLE,我们发现HCG9与各种癌症进展。进一步的生物信息学分析表明,高HCG9表达与骨肉瘤的进展有关。因此,我们最后选择HCG9作为我们的研究对象。其他验证是由比较HCG9表达式在临床骨肉瘤与paracarcinoma组织样本,和HCG9异常升高表达在肿瘤样本证实。击倒的HCG9显著抑制骨肉瘤细胞增殖,迁移和入侵,展示HCG9的致癌作用。据我们所知,HCG9是第一次被报道与骨肉瘤发展有关,和我们的研究结果提供了一种新的生物标志物对骨肉瘤的诊断和治疗。
lncRNAs的主要功能之一是充当龙头、调节microrna的表达。电抗器是小说类的转录后的基因表达式的监管者,争夺microrna的绑定/信使rna识别元素(35]。建立一个龙头、网络使用生物技术促进阐明可能对癌症恶化的主要信号通路的影响。黄等人分析了差异表达,电抗器与复发相关软组织肉瘤基于癌症基因组图谱(TCGA)数据库,提供全面的信息为提高个性化管理软组织肉瘤(36]。几个确定电抗器,轴在详细研究了骨肉瘤在体外和在活的有机体内动物模型。例如,郑等人报道,lncRNA SNHG3竞争性必然mir - 151 - a - 3 - p调节RAB22A活动以及调节骨肉瘤细胞入侵和迁移18]。谢等人发现TUG1可能绑定到miR-9-5p和mir - 212 - 3 - p调节不同的信号通路在骨肉瘤发展37,38],露出两个小块的细节在整个拼图,电抗器的网络。在我们目前的研究中,miR-34b-3p被母星预测为唯一HCG9的潜在目标。miR-34家族在不同癌症通常表达下调(39),包括卵巢癌、胰腺癌(40,41]。然而,没有调节骨肉瘤的miR-34b-3p进展报告。在此,我们建立了龙头、网络链接HCG9 miR-34b-3p,和信号通路影响这些ncRNAs也阐明。龙头、网络和通路分析查明4 DNA的伤害途径涉及DNA损伤检查点和有丝分裂细胞周期,表明HCG9 / miR-34b-3p轴发挥了重大作用,DNA修复和细胞周期。我们发现RAD51,促进有丝分裂的关键酶,miR-34b-3p的潜在目标,发现miR-34b-3p诱导细胞周期阻滞的表达下调RAD51,和HCG9负面miR-34b-3p监管。因此,积极监管RAD51促进增殖和抑制骨肉瘤细胞的凋亡。我们没有执行dual-luciferase报告实验由于调查时间和资金。确实需要验证miR-34b-3p之间的关系并通过dual-luciferase RAD51实验报告。我们计划在将来的研究中验证。
总之,我们的数据表明,HCG9负面miR-34b-3p监管,和异常低的表情miR-34b-3p的骨肉瘤肿瘤组织支持我们的假设。由overexpressing miR-34b-3p,在体外增生、迁移和入侵,以及在活的有机体内肿瘤生长刺激HCG9超表达,减轻,意味着一个潜在的保护作用在骨肉瘤miR-34b-3p进展。
5。结论
HCG9在骨肉瘤组织和细胞株基因表达增加,和高HCG9表达尤其与骨肉瘤转移有关。HCG9 miR-34b-3p作为目标,RAD51 miR-34b-3p的潜在目标。Overexpressing HCG9促进骨肉瘤细胞增殖、迁移和入侵在体外,以及加剧肿瘤进展在活的有机体内。Cooverexpression miR-34b-3p和HCG9减弱了骨肉瘤进展。我们的研究提供了新颖的治疗靶点,将协助骨肉瘤治疗在临床实践中。
数据可用性
作者确认所有数据的结果是可用的。所有相关数据在论文及其支持信息文件。
伦理批准
动物研究是审查和批准的实验动物中心,第二个中南大学湘雅医院(批准号2020408)。动物在实验的处理符合标准的治疗实验动物“指导意见”科技部颁发的2006年。所有程序和组织收集协议的机构审查委员会批准第二湘雅医院。
同意
患者术前知情并签署书面同意。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
作者参与本研究的贡献如下:概念和设计:鲁王;提供学习材料:Shuangqing李;收集和汇编的数据:林气;数据分析和解释:凌林;手稿写:所有作者;并最终批准的手稿:所有作者。阅读和批准所有的作者都最后的手稿,我们由于照顾,以确保工作的完整性。
确认
我们感谢湘雅第二医院,中南大学,所有的支持。这项工作得到了湖南省自然科学基金(2021号jj30939)。
补充材料
补充图1 (A)中华民国情节和(B) AUC HCG9基因表达之间的相关性分析和存活率。补充图2 (A)热图HCG9表达和基因表达式。相关性HCG9表达和(B)的年龄,性别,(C) (D)转移,(E)年级,(F)病理状态。补充图3,英国石油(BP)和KEGG分析浓缩的mrna HCG9 / miR-34b-3p轴调节的信号通路。(补充材料)