文摘
背景。Telocytes (TCs)是一种明显的间质细胞在溃疡性结肠炎的发病机制中扮演着重要的角色和结肠组织止血。本研究的目的是检查的影响nanocurcumin (NC)的形态学和免疫组织化学鉴定TCs在溃疡性结肠炎(UC)大鼠模型。方法。四十老鼠被随机分为控制、数控、加州大学和加州大学+ NC组。在实验的最后,结肠解剖和组织病理学和免疫组织化学评估做好准备。组织匀浆准备实时PCR对白细胞介素- 6 (il - 6)、肿瘤坏死因子-α(TNF -α),并且将生长因子(TGF -β)基因的表达。我们的结果显示广泛的粘膜损伤和炎性细胞浸润,CD34的显著减少,和波形蛋白应用TCs的结肠UC组il - 6的表达的重要高度,TNF -α,TGF -β。加州大学+ NC-treated分组显示重要高程的TC计数UC组除了相比,显著减少的三个基因的表达。结论。数控成功目标结肠组织,改善粘膜病变,保留TCs分布,计算通过其抗炎和纤溶性质。
1。介绍
溃疡性结肠炎(UC)是一种炎症性肠病(IBD)的亚型,经常影响直肠和结肠左1]。虽然它已经表明,遗传、免疫、环境元素参与加州大学的发病机制,具体病因的疾病仍然是未知的2]。某些关键角色在信号通路参与炎症性肠病的发展是通过分子机制尚未完全理解(3]。
越来越多的证据表明,细胞因子在炎症性肠病生产起着重要的作用。疾病的病理特点包括增加炎症细胞浸润和促炎介质如肿瘤坏死因子-α(TNF -α)和白细胞介素,除了过度释放活性氧和活性氮物种损失的抗氧化能力的结肠癌和粘膜连续性[4]。
一线治疗UC的抗炎药,包括糖皮质激素和aminosalicylates。尽管他们效率高,这些药物有广泛的副作用5]。因此,一个更可靠和风险更低的抗炎治疗是必要的。
不安于UC患者结肠运动是好,和蠕动障碍与肠神经肌肉间的变化有关,纤维结肠癌以及间质细胞的破坏6]。
Telocytes (TCs)是一种独特的子集间质细胞的特点是小细胞相对细长的身体和扩展名为telopodes (Tps) (5,7- - - - - -9]。TCs显示占据战略地位与干细胞利基和前体干细胞(8]。在结肠,他们形成一个牙龈下网状网络,存在肠道隐窝,他们参与支持这个地区的干细胞利基(10]。TCs还认为在组织修复中发挥重要作用/再生,除了形成细胞间网络内肌外,因此支持蠕动运动(11]。
TCs和Tps中标识与其他密切接触TCs通过直接细胞间连接,干细胞,炎症细胞,神经,微脉管系统,免疫细胞和非细胞的元素,如胶原蛋白和弹性纤维(11]。
肠道的固有层包含TCs展示微分upregulation il - 6和il - 10,这被认为是参与许多自身免疫和炎性疾病12]。
姜黄素是一种天然香料和食用色素粉末中常用的传统医学。几个之前的研究表明,姜黄素提取物姜黄根茎有抗炎,抗氧化,抗癌,抗菌和伤口愈合属性(13]。然而,其药用的主要限制是姜黄素水溶性差的非常疏水。因此,展品从胃肠道吸收差、生物利用度低口服摄入后(14]。几项研究已经进行了改善姜黄素的口服生物利用度。纳米技术被表示为一个最有效的方法来提高姜黄素的生物利用度在口服后,这是30倍高于粉末形式在老鼠和人类(15]。
虽然抗炎和纤溶的性质nanocurcumin已经很成熟,没有足够的分子或细胞的基础上对组织的影响和TCs的形态学和免疫组织化学特征。我们所知,这是第一个基本研究在纳米姜黄素研究形态学分析的TCs的UC模型。
2。材料和方法
2.1。姜黄素纳米粒子的制备
水热挤压法是制备姜黄素纳米提取的实现。总共10 g的自然让姜黄姜黄素粉(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)溶解在100毫升生理盐水含2%渐变80 200毫升聚四氟乙烯烧杯。当时热压处理过的40°C一夜之间大约24小时。姜黄素纳米粒子被挤压的粉和悬浮在溶液温度和压力的作用下在高压釜封闭。获得的悬架被稀释到一个预先计算的集中管理。股票的解决方案是存储在一个寒冷的黑暗的地方,直到使用[16]。
纳米粒子被认为是使用透射电子显微镜和傅里叶变换红外(FTIR)光谱的波数范围400 - 4000厘米−1和精度1.0厘米−1(27张量,布鲁克,德国)。
2.2。实验动物
四十成年雄性Wistar鼠(体重120 - 150克;8 - 10周大)从动物的房子,获得学院制药、收住曼苏拉大学。科老鼠被安置在卫生通风良好的铁笼,每笼老鼠(两个)。他们适应了1星期前开始实验。动物喂养随意在标准实验室条件下12 h光/暗周期和温度控制的环境( )。
2.3。实验UC模型的感应
前一天结肠炎的感应,老鼠饿死但允许免费获取饮用水。光乙醚麻醉后,急性结肠炎通过intrarectal管理1毫升4%醋酸溶液(AA) (Sigma-Aldrich)通过软硅胶导管,然后2毫升空气注射导管允许AA的结肠传播。最后,老鼠举行直接冲到2分钟,避免任何泄漏从肛门17,18]。
2.4。实验设计
比这更大的样本量的估计方程“资源”的方法被用来克服预测动物死于加州大学或实验技术。
老鼠被分为四组(10大鼠)。对照组(负控制)每个收到一个intrarectal管理2毫升生理盐水。NC-treated组(阳性对照)每个收到100毫克/公斤nanocurcumin口头通过胃管每日2周。
溃疡性结肠炎(UC组)组包括十个老鼠接受了感应的加州大学通过intrarectal注入2毫升4% AA如上所述。加州大学+ NC组包括加州大学十大鼠进行了归纳和收到每日口服填喂法100毫克/公斤nanocurcumin 2周(19]。
2.5。组织采样和染色
从实验结束后24小时,所有大鼠四组通过腹腔内注射安乐死的戊巴比妥钠麻醉(50毫克/公斤)。腹部解剖,左侧结肠分为三个部分,其次是固定一个段从每个动物在一夜之间在10%缓冲福尔马林的制备石蜡块。旋转切片机是用于获得5μ米厚部分染色如下:苏木精和伊红())组织学评估,马森的三色的染色纤维组织的评估,并与CD34免疫组织化学染色和波形蛋白TCs的识别。
另一个结肠段是固定在戊二醛和锇酸胶囊制剂,和semithin部分与甲苯胺蓝染色。
最后一段立即被淹没(试剂盒、德国),晚些时候在RNA孵化一夜之间在4°C或更久,紧随其后的是第二天总RNA提取。
2.6。免疫组化染色
石蜡切片(5μ米厚的)安装在带正电的玻片deparaffinized和水化。内源性过氧化物酶活性被浸泡10%过氧化氢的幻灯片。抗原网站被淹没在揭露部分在0.001摩尔(M)柠檬酸缓冲( )其次是在微波煮5分钟。非特异性染色的幻灯片背景被孵化的幻灯片避免1/100正常兔血清20分钟。幻灯片被洗在0.1磷酸盐(PBS) 5分钟。稀释主要抗体,包括anti-CD34(多克隆1:100年,产品# pa5 - 78978热费希尔科学)和老鼠多克隆波形蛋白(1:100;猫# pa5 - 27231热费希尔科学),然后添加到幻灯片1 h与PBS其次是洗涤。二次抗体(1:2000年,向量实验室)添加到幻灯片10分钟。Avidin-biotin-peroxidase复杂(向量,伯林盖姆,CA)申请30分钟来可视化的免疫染色反应,而3 3-diaminobenzidine管理10分钟作为发色体。最后,梅耶尔的苏木精复染色。消极的控制部分生成上面列出与更换1抗体与磷酸盐。毛细血管内皮和扁桃体组织切片和染色阳性控制CD34和波形蛋白,分别。
2.7。的形态学研究
定量评估CD34 -和vimentin-positive TCs进行结肠部分免疫染色和anti-CD34 antivimentin抗体使用CX31光学显微镜(日本奥林巴斯)与徕卡Qwin 500图像分析仪计算机系统(徕卡,英格兰)。串行部分来源于各大鼠的结肠(6老鼠|集团),和5张幻灯片选择从每个老鼠(1 | 10串行部分)。在400 x部分检查。研究领域包括黏膜、黏膜下层,圆形肌肉层,肌间神经丛,纵肌层。计数是手工进行的,包括只有所有的细胞的细胞核。胶原纤维的面积比例是衡量使用五个幻灯片为每个老鼠在250 x。
2.8。生化研究
测定il - 6、TNF -α,并通过实时PCR TGF-B基因表达(RT-qPCR)。
核糖核酸纯化使用试剂盒进行试剂(美国表达载体)。互补DNA是然后使用热科学最大值合成第一链cDNA dsDNase合成装备(美国罗克福德热费希尔科学)。
引物组基因被设计使用Primer3PLUS软件(诉0.4.0;http://frodo.wi.mit.edu/;表1)。实时PCR检测进行了使用应用生物系统7500实时PCR检测系统(生活技术,美国)根据描述的方法(20.)与SensiFAST SYBR Lo-ROX PCR大师混合工具包(英国Bioline)。总反应体积是20μl,热反应概要如下:最初的变性在95°C 2分钟然后40 95°C的周期5 s 60°C 30 s紧随其后。计算折叠改变基因表达的规范化β肌动蛋白根据循环阈值(2 (Ct)方法- - - - - -ΔΔCt)。所有基因的相对基因表达是归一化到一个对照组(负控制)21]。
2.9。统计分析
形态学和分子结果统计分析使用社会科学统计软件包的软件(版本21)。数据了 ,和值< 0.05代表显著差异。
3所示。结果
3.1。姜黄素纳米粒子的表征
透射电子显微镜研究姜黄素纳米粒子用于这项研究显示平均纳米直径小于50海里(图1)。红外光谱谱分析发现大量吸收光谱表明姜黄素(图的存在2)。
(一)
(b)
3.2。组织病理形态学结果和
3.2.1之上。(圆))染色的结果
对照组的H&E-stained部分结肠部分表现出相同的组织学图像控制和数控组。冒号的正常组织学安排的四层组织墙:黏膜、黏膜下层、肌层外,浆膜。粘膜由定期安排,密切支持肠道隐窝排列的柱状吸收细胞和杯状细胞丰富。薄薄的一层固有层淋巴细胞较少,以及TCs部分呈现与Tps长梭形细胞。这些细胞被发现周围形成一个网络隐窝在固有层,黏膜下层,在肌肉纤维之间。对照组(数字3(一)-3(d)) NC组(数字3(e) -3(h))。
从加州大学组组织学检查H&E-stained部分显示广泛的柱状粘膜损伤形式的损失吸收上皮衬里表面,一些隐窝几杯状细胞,大量炎症细胞浸润,血管和许多拥挤的地区的出血性病变。其他领域完全丧失的粘膜腺体和肥大的底层观察消化道粘膜。黏膜下层显示弥漫性单核细胞浸润,粘膜下水肿,一个明显的增加与扩张充血粘膜下厚度厚壁血管。肌外展出分离肌肉纤维与单核细胞浸润。TCs在部分ill-distinguished(数字3(我)3(左))。
加州大学+ NC组发现了类似的结构与对照组有明显保护肠道隐窝,杯状细胞除了分散炎性细胞在固有层的渗透。然而,小区域不连续表面上皮仍观察。TCs长Tps中可以看到部分(数据3(m) -3(p))。
3.2.2。马森的三色的染色结果
控制和数控组显示定期安排细胶原纤维之间的黏膜下层和粘膜隐窝(数字4(一)和4(b))。UC组显示明显的大量胶原纤维沉积粘膜。粘膜下层表现出胶原纤维水肿和充血的血管(图隔开4(c))。加州大学+ NC组轻度胶原纤维在同一站点(图4(d))。中可观察到显著增加胶原纤维面积百分比UC组与对照组相比显著降低加州大学+ NC组与UC组(图5)。
3.3。免疫组织化学结果
应用部分结肠的控制和数控显示大量的CD34 +和vimentin-positive TCs组。细胞和薄圆柱,Tps长。在粘膜,一些TCs在固有层观察到接近隐窝上皮。TCs还分布在粘膜肌层的平滑肌细胞。TCs在黏膜下层,胶原蛋白和弹性纤维中分布与血管密切接触。在固有肌层,TCs的平滑肌束分布在圆周和纵向层和周围的肌间神经丛。他们还发现,在周围的结缔组织和血管的浆膜下层(数据6(一)-6(f)和7(一)-7(f))。
从加州大学组CD34 -和vimentin-stained部分显示TCs很少发现在粘膜和粘膜下层的层。肌外透露一些细胞(数字6(g) -6(我),7(g) -7(我))。显著减少数量的TCs在UC组比对照组(数字8(一个)和8 (b))。
(一)
(b)
加州大学+ NC-treated组显示许多cd34多TCs(数字6(j) -6(左))和波形蛋白immune-stained细胞(数字7(j) -7(左)与对照组的分布相似。的数量显著增加CD34和波形蛋白immune-stained TCs在UC组相比,没有明显的变化相比,控件(数字8(一个)和8 (b))。
3.4。Semithin部分结果
组织学检查的甲苯胺蓝染色semithin部分控制(数字9(一)-9(c))和NC组(数字9(d) -9(f))显示许多小圆柱TCs长Tps隐窝周围形成一个网,黏膜下层,在接触平滑肌纤维,血管,和肌间神经丛。UC组表现出几个TCs的残余肠道隐窝,而这些完全没有在炎症和纤维化的地区。TCs很少见到在黏膜下层、肌层外,周围的肌间神经丛(数字9(g) -9(我))。加州大学+ NC组显示频繁TCs周围的粘膜隐窝,黏膜下层的肥大细胞密切接触,并在靠近肌纤维和肌间神经丛(数字9(j) -9(左))。
3.5。分子的结果
肿瘤坏死因子-的信使rna基因表达水平α、il - 6和TGF -β显示显著增加表达式在UC组( , ,和 ,)分别比对照组( , ,和 ,分别)值为0.002、0.022和0.005,分别。没有观察到显著变化之间的加州大学+ NC组和对照组。显著降低这三个基因的表达在加州大学+ NC组相比,UC组观察到值< 0.001、0.011和0.004,分别为(数字10和(11日)- - - - - -11 (c))。
(一)
(b)
(c)
(一)
(b)
(c)
4所示。讨论
使用纳米技术治疗胃肠疾病最近被认真考虑下,因为它是一个最有前途的运载系统的姜黄素的克服有限的生物利用度的问题。
考虑姜黄素的潜在影响,在本研究中,我们试图说明姜黄素的抗炎和纤溶性质纳米颗粒在加州大学的老鼠模型和关联这些属性与histomorphometric TCs的变化。
我们假设AA允许和福利管理的加州大学的实验诱导炎症和纤维化的模型。支持,先前的研究22,23)最近报道,intracecal管理caspase-1 AA基因表达增加有关,IL-B1,和NLRP3 inflammasome,给出一个典型的加州大学的照片。
在目前的研究中,显微镜检查结肠粘膜UC组显示干扰建筑形式的粘膜溃疡,杯状细胞减少,血管扩张充血,隐窝,厚厚的消化道粘膜,和过度的炎性细胞浸润。黏膜下层的分析显示明显的水肿和炎性细胞浸润。我们的结果与以前的工作24,25]。
rt - pcr分析显示重要的肿瘤坏死因子-高程α和il - 6。在加州大学的背景下,TNF -α和il - 6是特别重要的。il - 6是一种促炎和抗炎细胞因子。生产过剩il - 6参与炎症性肠病的发病机制与顺向积累肠壁的T细胞。此外,过度释放细胞因子可能导致干扰紧密连接,因此,肠道屏障损伤(26,27]。
肿瘤坏死因子-α是一种促炎细胞因子il - 1水平上升,刺激白细胞迁移到网站的炎症和增加基质金属蛋白酶的负责的破坏肠道细胞外基质(28]。肿瘤坏死因子-α刺激进一步氧化炎症介质的释放促炎细胞因子(28]。
加州大学+ NC-treated老鼠的组织病理学检查显示保存细胞结构的结肠粘膜炎症细胞浸润明显减少。这些组织学结果可以解释为il - 6和TNF -的显著减少αnanocurcumin-treated组的基因表达。我们的结果与之前报道29日),他们证明,姜黄素表现出潜在的抗炎效果,表达下调促炎介质(即。,不,PGE2, TNF -α,并通过抑制NF - il - 6)κB和抑制TLR4激活。
马森的组织学检查trichrome-stained部分UC组显示显著增加胶原蛋白沉积的黏膜和黏膜下层严重发炎冒号的UC组与对照组相比。这幅组织学证实了TGF - rt - pcr分析β,这显示对照组相比显著增加。TGF -β刺激胶原蛋白形成通过myofibroblast激活(30.]。
显著减少胶原沉积和粘膜下厚度是加州大学+ NC-treated组中观察到,这些结果证实了TGF -的明显降低β在这些老鼠相比,加州大学。这个结果符合先前的研究工作的数据31日,他们报告说,TGF -姜黄素减少β和胶原蛋白我表达,因此预防或推迟myofibrogenesis。此外,nanocurcumin促使myofibroblast凋亡[32),可以防止纤维化通过减少细胞因子和趋化因子基因的表达,直接参与纤维化(33]。
Telocytes已经承认在很多脊椎动物在几个不同的器官。直到现在,TCs的识别仍在争论中,这些细胞之间的关联和其他间质细胞是常见的。然而,光微观识别TCs取决于他们的能力形成三维基质网络通过长telopodes [34]。TCs表达不同免疫标记根据他们居住的器官和功能由这些细胞(11]。最近,CD34和波形蛋白被认为是可靠的识别标记TCs在肠道。CD34是一个跨膜phosphoglycoprotein公认在造血干细胞和血管内皮细胞35]。一些研究人员称TCs为CD34 +基质细胞(36,37]。波形蛋白是一种中间丝状体,广泛表达于内皮细胞在血管内,上皮细胞、血管平滑肌细胞、软骨和骨细胞。它也负责提供结构支持组织(38]。
对TCs的分布在结肠的对照组,他们发现周围形成一个广泛的网络隐窝和固有层。这种安排确保组织完整性的维护压力下从机械力,如膨胀和收缩34]。在消化道黏膜和musculosa CD34和波形蛋白透露TCs积极immune-stained细胞过程之间的混合肌束和周围的肌间神经丛。这可以解释TCs的作用在调节胃肠蠕动卡哈尔间质细胞的(39]。TCs在大鼠结肠的分布符合描述在草鱼肠道和其他的管状器官哺乳动物(40]。
UC组中,TCs明显减少,尤其是在炎症或纤维化的地区。这可能是由于改变细胞外基质(ECM)的构成和多余的胶原纤维沉积,与纤维细胞外基质诱骗TCs,导致细胞死亡如前所记录在心力衰竭的情况下(41)、硬皮病、炎症性肠病(42]。最近,一个研究报告说,TCs的增殖能力下降水平增加的TNF -α(43),这是与我们的结果一致。
TCs据报道发挥重要作用在胃肠道(GIT)。他们直接接触各种免疫细胞、肥大细胞、树突状细胞、淋巴细胞浆细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、巨噬细胞(9,40]。符合该TCs在调节免疫反应的作用通过旁分泌途径,TCs在子宫被假定在腹膜巨噬细胞激活中发挥作用。活化的巨噬细胞不同显示更多的伪足和分泌炎性细胞因子包括TNF -α、IL1-R1和il - 10,表明即将TCs在免疫调节和免疫监视的机制44]。
提出了TCs在组织中扮演一个角色塑造通过ECM的规定在器官发育形成。不管telocytes显著减少的加州大学前的纤维化组织纤维化的结果,TCs的损失可能是一个因素改变组织的ECM肠壁[39]。此外,成纤维细胞之间的接触和TCs被报道在许多器官9),表明TCs的角色在组织内稳态的规定通过抑制成纤维细胞的活动信号(39]。
我们的研究结果表明,与频繁腹泻相关的UC组与格式良好的颗粒在加州大学+ NC-treated组。这可能是由于降低TC数字有平滑肌束之间的战略地位;此外,粘膜的炎症观察和il - 6和TNF -增加α。值得注意的是,TCs和隐窝干细胞之间的密切联系和Wnt蛋白质的分泌牙龈telocytes在干细胞分化和上皮更新尤为重要(10),这是符合我们的研究结果表明损失牙龈TCs UC组导致溃疡愈合的失败和上皮再生。
基于这项研究的结果,TCs溃疡性结肠炎的发病机制中发挥重要作用。符合这一假说,TCs的固有层GIT已报告分泌高水平的il - 6和il - 10相比,周围的基质细胞(10),表明TCs的潜在作用在炎症和免疫调节的疾病的发病机制。
研究的局限性,需要进一步的超微结构和免疫学研究更好地理解TCs在溃疡性结肠炎的病理生理学的作用。在这项工作中,我们研究的影响短期姜黄素治疗UC大鼠模型,并用nanocurcumin长期治疗慢性或复发UC模型在未来的研究中应该考虑。
5。结论
我们所知,没有可用的研究评估在结肠telocytes nanocurcumin加州大学的影响。在目前的研究中,免疫组织化学检查nanocurcumin-treated集团在TC计数显示显著增加与UC组和指标与对照组相比无显著变化。这可能是由于抗炎和antifibrotic nanocurcumin的影响。这些并行免疫组织化学结果与分子对il - 6、TNF -α,TGF -β。
这些结果表明nanocurcumin作为治疗UC的相关作用通过其有益的抗炎和纤溶性质。这项研究也揭示了TCs的角色在溃疡性结肠炎的发病机制和结肠组织止血。这些信息可能是有利于未来的研究人员可能考虑使用TCs在组织修复和再生的可能的替代细胞疗法。
数据可用性
的数据支持本研究的发现可以从相应的作者在合理的请求。
伦理批准
所有参与实验,严格符合动物实验动物实验动物保健和使用指南。本研究的协议的机构审查委员会批准的医学院收住曼苏拉大学科(R.21.01.1153)。程序都符合国家卫生研究院(National Institutes of Health))实验动物保健和使用指南。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。