文摘

背景和目的。先前的研究表明,Maresin1 (MaR1)、二十二碳六烯酸(DHA)的代谢产物之一,可以减轻急性炎症,促使炎症决议。也减毒胰腺损伤caerulein-induced急性胰腺炎(AP)的老鼠。然而,这个机制抑制炎症反应和美联社仍然未知。方法。重复caerulein注射用于诱导美联社和慢性胰腺炎(CP)小鼠模型。组织病理学和血清学变化进行评估的严重性AP模型,并采用流式细胞术检测巨噬细胞吞噬作用和表型。与此同时,clodronate脂质体用于小鼠的巨噬细胞耗竭。最后,CP模型采用进一步观察MaR1的保护作用。结果。MaR1管理体现了改进的组织病理学改变和血清淀粉酶和脂肪酶水平越低。然而,MaR1在胰腺腺泡的细胞系中没有发挥保护作用在体外。它的巨噬细胞浸润明显减少受伤的胰腺,特别是M1-type巨噬细胞。巨噬细胞间隙后,MaR1没有进一步的保护在活的有机体内。这项研究还表明,MaR1可以减轻纤维化限制美联社CP模型中的进展。结论。我们的数据表明,MaR1是治疗和预防目标AP在老鼠身上,可能操作通过其对降低巨噬细胞浸润和表型转换的影响。

1。介绍

急性胰腺炎(AP)是一种常见的急性腹部致命的疾病。严重的美联社(SAP)约占-20%的患者15% AP和发展大约30%死亡率(1,2]。激活先天免疫细胞增加AP的严重性。美联社的预后与过度炎症反应有关。在这个过程中,解除免疫细胞调节炎症级联,导致全身炎症反应综合征和多器官功能衰竭(3]。然而,没有可供AP治疗,尤其是SAP患者持久器官衰竭。

ω- 3多不饱和脂肪酸(ω3 FAs)主要包括二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸。ω3 FA / DHA具有无可争辩的作用在高脂血症和心血管疾病(4,5]。研究涉及人类参与者表示,使用肠内营养丰富ω3 FAs治疗AP可能有利于空肠的喂养和住院的时候6]。一个荟萃分析显示,管理ω3 FAs可能有利于降低死亡率,感染相关性并发症,在美联社和住院时间,特别是当使用非肠道(7]。以前的临床数据表明,ω3 FA-supplemented肠外营养可以降低hyperinflammatory反应和改善SAP患者的免疫功能8,9]。

炎症可分为三个阶段:炎症,决议,post-resolution [10]。专业proresolving介质(spm),包括resolvin,保护,lipoxins, maresins,扮演一个关键的角色在分辨率和postresolution [11,12]。炎症是维持体内平衡的保护性反应。然而,过度的炎症可能导致正常组织损伤,最后发展成慢性疾病(2,13]。spm为炎症提供一条新途径;他们防止炎症扩散和停止从急性转为慢性14,15]。

解决Maresins新描述macrophage-derived炎症介质;它们的代谢产物之一ω3 FAs和biosynthesized通过12-lipoxygenase [14,16,17]。Maresin1 (z 7 14-dihydroxyd-ocosa-4Z 8、10、12、16 z, 19 z-hexaenoic酸,MaR1)已被证明是一个强有力的中介抑制中性粒细胞浸润,促进巨噬细胞efferocytosis,提高组织再生在急性炎症18- - - - - -20.]。MaR1发挥保护作用在小鼠结肠炎和脓毒症模型21,22]。最近,据报道,MaR1保护小鼠免受ROR非酒精性脂肪肝病α端依赖的方式(23]。一些研究报道的保护作用MaR1美联社没有澄清其特定的靶细胞(24,25]。

与其他spm相比,MaR1对美联社的影响仍然未知。本研究的目的是验证MaR1是否能够防止美联社的假说,以及探索可能的潜在机制。

2。材料和方法

2.1。动物和试剂

只有雄性老鼠(年龄在8周),是28 - 30 g重购买从扬州大学模型动物中心(扬州,中国)。绿色荧光蛋白转基因小鼠(GFP tg)获得BJ吴教授。所有的老鼠被安置在特定无菌(SPF)条件在一个装有空调的动物设施在24°C在12小时光/暗周期。实验动物保健原则(NIH没有出版。85每个修订1996年)随访,所有实验协议是实验动物伦理委员会批准金陵医院隶属于南京大学医学院(20160905)。

266 - 6小鼠胰腺腺泡的细胞系得到来自美国文化类型集合(美国弗吉尼亚州写明ATCC)。MaR1从开曼群岛购买化学公司(美国MI)。Caerulein获得AnaSpec Inc .(美国CA)。缩胆囊素片段30-33酰胺(CCK)和脂多糖(LPS)从Sigma-Aldrich购买(美国密苏里州);clodronate脂质体(sccp CLs,从阿姆斯特丹)从Yeasen购买生物技术有限公司(上海,中国)。脂肪酶工具包是购自南京建成集团(中国南京)和淀粉酶包从BioSino购买生物技术与科学有限公司(中国,北京)。Macrophage-stimulating因子(csf)购买MedChenExpress LLC。(南京、美国)。Anti-F4/80, anti-phospho-mixed血统激酶结构域蛋白(p-MLKL),山羊anti-rabbit,兔子anti-mouse二级抗体购自Abcam(英国剑桥)。Anti-receptor-interacting蛋白3 (RIP3)抗体购自圣克鲁斯生物技术(美国CA)。所有抗体流式细胞术买来BioLegend(美国CA)。 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), fetal bovine serum, penicillin, and streptomycin were obtained from Gibco (Thermo Fisher Scientific, MA, USA).

2.2。归纳实验胰腺炎

老鼠被随机分配到五组:控制、caerulein, caerulein + 0.2 ng /老鼠MaR1 caerulein + 2 ng /老鼠MaR1, caerulein MaR1 + 10 ng /老鼠。美联社模型引起的腹腔内(i.p)注入50μ克/公斤caerulein每小时10个小时。生理盐水(NS, 0.9%氯化钠)而不是caerulein对照组。MaR1或车辆(0.9%氯化钠)在0小时后第一个caerulein注入腹腔内注入。老鼠最后牺牲了12小时后注射。

胰腺巨噬细胞耗竭是依照指令。200年短暂,小鼠腹腔注射μL CLs的天1和3。控制老鼠收到同样体积的空白脂质体(磷酸盐、PBS)。在第五天,诱导AP模型。

注射引起的慢性胰腺炎(CP)是50μ克/公斤caerulein每天一次的持续周期5天,2天,总共4周(23]。七天caerulein开始注入后,给出的老鼠NS或MaR1 (2 ng /老鼠,100μL每天 )直到牺牲5周后。

2.3。等离子体参数的样本收集和分析

血液样本得到isoflurane-anesthetized小鼠尾静脉的0,6和12小时后第一个caerulein注入。老鼠与戊巴比妥钠麻醉(50毫克/公斤,i.p。)和牺牲。胰腺组织拍摄和4%多聚甲醛固定在PBS ( )在石蜡和嵌入。

血清淀粉酶和脂肪酶的活动确定后使用淀粉酶和脂肪酶包制造商的协议。

2.4。组织学检查

胰腺和肺组织的石蜡切片苏木精和伊红染色(他)。两名调查人员对实验分组也不得分的胰腺损伤程度使用光学显微镜和评估的严重性水肿、炎症、坏死,如前所述[26]。

2.5。免疫组织化学检查

从石蜡包埋切片胰腺组织受到免疫组织化学染色(包含IHC) RIP3, p-MLKL, F4/80检测。幻灯片是一夜之间在4°C潮湿的孵化室和一个抗体RIP3, p-MLKL和F4/80(1: 200稀释),然后用山羊孵化anti-rabbit二级抗体(1:500稀释)60分钟(如前所述24]。这些照片是获得使用显微镜(IX73、奥林巴斯、东京、日本)。

2.6。细胞培养和治疗

266 - 6细胞在DMEM培养补充10%胎牛血清,100 U /毫升青霉素,100μg / mL链霉素湿润5%股份有限公司₂孵化器。缩胆囊素模拟CCK (8000μ米)应用于诱导AP有或没有MaR1 (250 nM、500 nM和1000 nM)。12小时后收集细胞进一步调查。

2.7。隔离的胰腺白细胞

MaR1或车辆注射治疗AP模型。24小时后,老鼠被杀,胰腺被小心地通过削减脂肪和肠系膜。如前所述在文献[27),胰腺与剪碎,然后洗两次与缓冲(汉克的平衡盐溶液+ 10%胎牛血清)。组织在缓冲区包含2毫克/毫升resuspended胶原酶IV型和孵化瓶在37°C 15分钟。暂停在低速20秒钟然后漩涡,离心机,和细胞颗粒在红细胞裂解缓冲resuspended 5分钟。这些细胞被剥离下来,洗了三次缓冲区,用于标记染色。

2.8。隔离原发性胰腺腺泡的细胞(pac)

GFP tg小鼠胰腺中的自发发射绿色荧光。pac被隔绝GFP tg小鼠胶原酶消化和培养在含10%胎牛血清的DMEM 37°C (28]。骨骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs)与pac coincubated caerulein (5μ米),MaR1 (250 nM、500 nM和1000 nM) 6 - 8小时。

2.9。隔离BMDMs和细胞的诱导

简而言之,股骨和胫骨的两端剪和冲洗注射器充满了完整的罗斯威尔公园纪念研究所(RPMI) 1640含10%胎牛血清,100 U /毫升青霉素,100μg / mL链霉素,1% N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane磺酸(消息灵通的,1米),和0.05%β-hydroxy-1-ethanethiol挤压BM细胞无菌培养皿中。温柔的再悬浮和离心后,BM细胞培养使用20 ng / mL完全RPMI - csf。天2,4,6,媒介是half-replaced与新一批包含CSF-conditioned介质。这些细胞被准备使用7天(28]。

BMDMs与caerulein-stimulated coincubated腺泡6小时。消除腺泡后,收集BMDMs和沾fluorochrome-conjugated抗体:PE / Cy7-F4/80流式细胞术。

2.10。流式细胞术

吡啶碘(π,1μmol / L)是用于检测等离子体膜断裂坏死的特点。加载后,266 - 6细胞被洗和resuspended Ca^{2 +}无缓冲。

表面染色,胰腺白细胞沾以下fluorochrome-conjugated抗体:FITC-CD86, PE / Cy7-CD45.2 APC / Cy7-CD11b, Percp / Cy5.5-F4/80。细胞内的肿瘤坏死因子α(肿瘤坏死因子-α)染色,细胞在DMEM培养完全培养基与LPS刺激(100 ng / mL)和brefeldin (10μg / mL) 4小时37°C。这些细胞被洗,用表面标记染色。细胞被固定和permeabilized。PE-TNF -α和APC-CD206(1: 200)是用于细胞内染色。流式细胞仪使用NovoExpress NovoCyte数据收集和分析软件(究其生物科学有限公司、钙、美国)。

2.11。马森天狼星红染色纤维化

石蜡切片(4μm)沾Picro-Sirius红色(饱和苦味酸天狼星红1%解决方案)1小时在室温下分析胶原蛋白合成和沉积。部分是然后用0.5%醋酸洗两次。水被剧烈的摇晃身体从幻灯片中删除。使用100%的乙醇脱水三次后,部分与二甲苯清洗和安装在树脂中。Image-Pro + 6.1软件(美国媒体控制论,MD)是用于计算小天狼星red-positive染色比例。

马森染色,胰腺组织切片常规脱蜡、水化、孵化Wiegert 5 - 10分钟的解决方案。然后他们被分化在酸性乙醇5 - 15秒,马森稍微用水洗,法蓝发蓝处理缓冲区3 - 5分钟。洗水后,切片在Ponceau-Fuchsin孵化解决方案5 - 10分钟,用弱酸解1分钟,并与磷钼酸溶液洗1 - 2分钟。随后在苯胺蓝染色片解决方案1—2分钟。他们然后用弱酸清洗解决方案,在绝对乙醇脱水,二甲苯透明,和安装与中性树脂。

2.12。统计分析

unpaired-sample学生 - - - - - -测试是用来确定统计学意义,值小于0.05表示一个统计上的显著差异。单向方差分析+图基事后测试被用来确定多个组之间的差异,以及值小于0.05表示一个统计上的显著差异。值表示为 (SPSS统计软件,版本22.0,IBM的分析,纽约,美国)。除非表示,从至少三个独立的实验结果。

3所示。结果

3.1。MaR1改善小鼠的胰腺组织病理学改变与美联社

我们组之前报道,DHA对美联社产生保护作用。本研究调查的影响MaR1 (DHA的代谢物)部分解释其临床受益。在动物实验中,三个剂量的0.2,2,10 ng /老鼠。正如所料,caerulein组表现出古典水肿胰腺炎表现,包括水肿、炎性细胞浸润和参差不齐的腺泡的细胞坏死。根据病理结果,2 ng /老鼠MaR1被选在后续实验检查其明显的保护作用(图1(一))。胰腺损伤分数评估与pathohistological变化。此外,MaR1-treated老鼠还表现出显著降低血清淀粉酶和脂肪酶水平(图1 (b))。

几个观测表明,necroptosis介导美联社发展。RIP激酶发挥核心作用在调节necroptosis [29日]。RIP3和MLKL蛋白质组装necrosome很重要。包含IHC考试被用于检测RIP3和p-MLKL在胰腺组织中表达。如图2(一个)阳性染色RIP3和p-MLKL显示,一个健壮的PAC后增加伤害。MaR1可以减少RIP3 p-MLKL-positive细胞,表明MaR1减轻严重性的PAC necroptosis AP模型。

3.2。MaR1没有直接作用于胰腺腺泡的细胞坏死

结果的基础上在活的有机体内实验中,我们首先考虑是否MaR1对PAC损伤有直接的保护作用。266 - 6细胞株是广泛应用于其外分泌功能的胰腺炎模型(30.,31日]。因此,266 - 6细胞被用来探索MaR1的影响,和CCK被用来诱导急性损伤模型在体外。在不同剂量(250 nM、500 nM和1000 nM) MaR1治疗,PI染色表明,坏死细胞的百分比CCK组大约是15.24%,而MaR1组没有显著差异(图2 (b))。此外,MaR1浓度梯度差异(50 nM, 100 nM、250 nM, 500 nM, 750海里,1μ5米,μ10 M,μ米)扩大,仍然没有迹象表明保护观察(数据没有显示)。结果证实,MaR1在美联社的保护作用可能不会在pac锚。

3.3。MaR1抑制胰腺组织中巨噬细胞的浸润

由于MaR1并非直接有利于266 - 6细胞,我们专注于免疫细胞在胰腺组织。巨噬细胞发挥重要作用在美联社32]。IHC考试F4/80证明MaR1显著降低巨噬细胞浸润在胰腺组织(图3(一个))。主要免疫细胞与美联社从小鼠的胰腺组织中提取测定巨噬细胞的极化。流式细胞仪是用来检测TNF -α和CD206水平M1 M2-associated生物标记,分别。AP组相比,平均荧光强度(MFI) TNF -αMaR1组显著降低,而MFI CD206略微增加没有统计上的显著差异(数字3 (d)- - - - - -3 (f))。此外,巨噬细胞的总数MaR1治疗后显著降低,这与包含IHC染色结果(数据是相一致的3 (b)和3 (c))。

MaR1能增强巨噬细胞吞噬作用的死细胞和碎片。我们想在AP模型验证其效果。pac的GFP tg老鼠被488海里提取,因为他们的激发光导致荧光最大发射约530海里。收集与caerulein-stimulated pac coincubation之后,BMDMs流式细胞术。的基本吞噬PBS-stimulated pac是4.01%左右。caerulein组显示一个明显的上升到7.32%,而MaR1治疗组则没有改变。MaR1可能不会提高BMDM吞噬作用受损pac(数字3 (g)和3 (h))。总的来说,这些结果表明,MaR1可能防止老鼠美联社通过减少巨噬细胞浸润,主要是促炎M1表型。

3.4。MaR1没有进一步防止美联社胰腺后巨噬细胞间隙

胰腺巨噬细胞被耗尽之前使用CLs caerulein曝光。CLs能有效地清晰的巨噬细胞和防止美联社在老鼠(图4(一))。此外,MaR1不能进一步减轻实验美联社的严重性,无论病理成绩或血清学测试(数字4 (b)和4 (c))。从动物和细胞实验结果表明MaR1可能改善小鼠的AP严重程度取决于胰腺巨噬细胞。

3.5。MaR1减轻巨噬细胞浸润和胰腺组织的纤维化CP模型

在老鼠身上,胰腺过度caerulein导致AP。连续复发引起的急性损伤胰腺美联社最后CP,这是符合人类胰腺炎的病理生理过程。CP模型建立了重复的方式进一步检查MaR1的效果在活的有机体内。老鼠接受重复caerulein注入显示巨噬细胞浸润,胰腺纤维化和腺泡的细胞损失。基于以前的结果,2 ng /老鼠MaR1被选中,这明显缓解胰腺损伤的严重程度(图5(一个))。马森天狼星红染色显示在胰腺纤维化明显减少(图5 (c))。此外,MaR1组巨噬细胞浸润较少(F4/80染色)在胰腺组织中与CP组(图5 (b))。

4所示。讨论

巨噬细胞负责宿主防御,急性炎症反应,及时解决(33]。他们可以简单地分为两个极端表型:经典激活巨噬细胞(M1),或者激活巨噬细胞(M2)。短暂,M1巨噬细胞表现出proinflammation和免疫防御属性,而M2巨噬细胞表现出相反的属性。从M1, M2表型可以减轻急性炎症的严重程度(34]。

因为没有具体的治疗存在目标胰腺实质细胞,更多的研究者关注当地特别是巨噬细胞的免疫细胞。巨噬细胞腺泡的细胞死亡和激活胰腺炎症和确定美联社的严重程度(35]。巨噬细胞吞噬受损腺泡的细胞也可以美联社的焦点与受损的腺泡的细胞(28]。在这项研究中,我们发现MaR1保护美联社通过巨噬细胞而不是代理直接在pac。按照吴et al .,我们发现巨噬细胞量化后的胰腺组织显著增加AP发病(1天)36]。MaR1治疗后,巨噬细胞的比例人口显著下降。此外,M1巨噬细胞的数量减少和M2巨噬细胞的数量略有增加胰腺组织。巨噬细胞可能证明可塑性和多能性局部微环境信号在一个特定的时间和空间。M2巨噬细胞可以进一步细分为M2a M2b, M2c, M2d,表面标记是非常不同的37]。CD206可能不是最佳选择跟踪M2的变化。另一个问题是政府的时机MaR1的老鼠。在胫骨骨折损伤模型中,MaR1治疗受伤的时候是无效的在减少促炎巨噬细胞的数量,不同的治疗结果受伤后(38]。巨噬细胞表现出动态转换在表型和功能如美联社的进展。M2或M2-like巨噬细胞数量的增加在急性炎症期(36]。延迟政府MaR1可能提供一些提示对M2巨噬细胞对其的影响。进一步,就像我们的结果,一些研究报道,MaR1明显减少促炎巨噬细胞的数量,但不抗炎的巨噬细胞在炎症模型(38,39]。此外,MaR1能增强巨噬细胞吞噬作用的中性粒细胞炎症。但是,没有报告提到的MaR1对巨噬细胞吞噬作用的影响腺泡细胞AP受损。在我们的研究中,没有增强MaR1对受伤的腺泡细胞的吞噬作用的影响被观察到。结果表明,MaR1主要调节巨噬细胞表型减轻炎症。此外,研究结果表明,MaR1的确没有进一步的保护作用在美联社巨噬细胞间隙在动物模型。然而,使巨噬细胞极化在美联社的平衡是一个有吸引力的治疗选择,考虑到异构巨噬细胞的功能在疾病的不同阶段,除了直接消除巨噬细胞。

美联社的复发是一个挑战在临床治疗。据美联社复发的发生率可达21%,CP发展在36%的病人40]。此外,有效的预防和治疗策略CP治疗仍然缺乏。巨噬细胞浸润和激活发挥重要作用在胰腺损伤和纤维化。因此,CP模型用于本研究探索MaR1的药理作用。MaR1明显减毒巨噬细胞浸润、纤维化和胰腺损伤的CP模型。这些结果表明,MaR1可能作为免疫临床预防CP消散的。

总之,我们的研究表明,MaR1可以通过减少巨噬细胞浸润减少美联社的严重性,特别是M1巨噬细胞在胰腺组织。这提供了证据对美联社DHA的保护作用。因此,MaR1可以作为一个有前途的临床治疗药物治疗AP在未来。

数据可用性

可以按照客户要求所有的数据都包含在本研究通过与相应的作者。信件应该写给Weiqin李(电子邮件保护)或Zhihui通,(电子邮件保护)。

的利益冲突

本文的所有作者没有利益冲突披露。

作者的贡献

陆专业化概念化。林高做了正式的分析。Zhihui通和李Weiqin资金收购和监督。迎迎路做了调查。马朱青田静雪小姐,南马的方法。精铸张和气杨寻找资源。洁盾获得软件。Weijuan龚提供技术指导。所有作者已阅读及同意发布版本的手稿。迎迎Lu和专业化陆贡献同样这项工作。

确认

特别感谢将薛京教授专家的技术援助和吴教授Baojin GFP tg老鼠捐赠。这项研究得到了国家自然科学基金(81801970号,81670588,和81870441)和关键研究和发展项目中国江苏省(没有的基础。BE2016749)。