文摘

肥胖是一个著名的世界各地的公共卫生问题。脓毒症是一种致命的临床综合症,导致multiorgan失败。肥胖可能会加重炎症在败血症的病人。谷氨酰胺(GLN)是一种营养与免疫监管和消炎作用。由于脓毒症是一种常见的急性肾损伤(AKI)的因素,本研究调查的影响GLN管理sepsis-induced炎症和阿基在肥胖的老鼠。高脂肪饮食由60%的热量来自脂肪提供10周诱导肥胖的老鼠。然后,肥胖老鼠分为败血症与生理盐水(SS)或GLN (SG)组。盲肠的结扎和穿刺(CLP)进行生产败血症。SS组静脉注射生理盐水在SG集团管理GLN CLP后一个或两个剂量。肥胖小鼠脓毒症牺牲在12日24或48 h post-CLP。 Results revealed that sepsis resulted in upregulated high-mobility group box protein-1 pathway-associated gene expression in obese mice. Also, expressions of macrophage/neutrophil infiltration markers and inflammatory cytokines in kidneys were elevated. Obese mice treated with GLN after sepsis reversed the depletion of plasma GLN, reduced production of lipid peroxides, and downregulated macrophage/neutrophil infiltration and the inflammatory-associated pathway whereas tight junction gene expression increased in the kidneys. These findings suggest that intravenously administered GLN to obese mice after sepsis alleviated inflammation and attenuated AKI. This model may have clinical application to obese patients with a risk for infection in abdominal surgery.

1。介绍

肥胖是一个重要的全球公共卫生问题,因为其高的全球流行。肥胖主要是由于高热量摄入和缺乏身体活动,与细胞生理发展逐渐改变之前的症状疾病变得明显。肥胖个体存在系统性的慢性低度炎症标志物。同时,肥胖导致失调的免疫反应(1]。这些变化与代谢紊乱密切相关,可能有负面影响在宿主免疫感染和促进疾病进展(1,2]。肥胖受试者被认为是脆弱的反复院内感染的风险增加(2]。病危人群,先前的一项研究发现,与正常体重相比,肥胖病人传染性并发症的风险较高,导致脓毒症(3]。

脓毒症是一种致命的临床综合征multiorgan失败(4]。认为特异表达的免疫反应,以应对感染导致失调pro -和抗炎反应,最终导致不可逆转的multiorgan衰竭(5]。对于危重患者,急性肾损伤(AKI)死亡率,是一个独立的危险因素,AKI的最常见的因素是脓毒症(6]。sepsis-induced AKI的发病机理是复杂和多因素疾病。虽然赞成和抗炎机制,炎症是关键组件和促炎细胞因子的生产可以作为预测阿基败血症的患者(7]。先前的研究发现,肥胖和苗条动物之间存在着不同的反应对感染性的侮辱。肥胖动物表现出更严重的症状比瘦的和建议与精益的动物相比,肥胖夸大了炎症反应在脓毒症(8- - - - - -10]。肥胖被认为是一个独立的危险因素病危人群的死亡率(11),在败血症的病人已成为一个主要问题。

谷氨酰胺(GLN)是一种营养和抗炎和免疫调节特性。尽管一个多中心的临床研究显示GLN政府与死亡率增加有关关键multiorgan衰竭患者(12),随后的临床试验发现肠外补充GLN是安全的在外科重症监护病房(ICU)患者和改进结果在稳定患者的器官功能13,14]。先前的研究由我们实验室发现GLN政府对抗炎症反应和远程器官损伤在脓毒症(15- - - - - -17]。GLN发现引出一个更为平衡的辅助T细胞极化(16),减少细胞程序性死亡1表达在免疫细胞18),表达下调高机动组盒蛋白1 (HMGB-1)介导的通路(19),从而减轻脓毒症肾损伤。然而,肥胖代谢压力来自暴露于急性炎症刺激,如败血症、脓毒症不同。正如我们所知,没有研究调查的影响GLN炎症和阿基在肥胖与脓毒症复杂。本研究使用高脂饮食诱导肥胖;此后,盲肠的结扎和穿刺(CLP)进行创建一个肥胖脓毒症与幼童腹壁薄弱的小鼠模型。我们假设后与GLN治疗脓毒症可能有益影响衰减炎症反应和随后的阿基肥胖老鼠并发败血症。

2。材料和方法

2.1。动物

雄性C57BL / 6小鼠(5周大体重~ 20 g)被用于这项研究。老鼠住在台北医科大学实验动物中心(本校;台北,台湾)。动物中心的条件 相对湿度50% ~ 55%的12 h光暗周期。啮齿动物食物的饮食(厂家没有标准。沃斯堡,5001年美国TX)和水随意在适应期间。护理和使用实验动物是符合的指导实验室动物保健和使用的(20.]。实验方案被批准的动物保健和使用委员会本校。

2.2。实验程序

一开始,老鼠被随机分配给一个正常的控制(数控, )组和高脂肪(高频, )组。老鼠在NC组提供了标准的啮齿动物食物的饮食,而高频组喂高脂肪的食物包括60%千卡,脂肪(21为10周)。饮食的组成是由商业公司(研究饮食,新布伦瑞克,新泽西州,美国)如表所示1。经过10周的喂养,在高频组细分为脓毒症小鼠生理盐水(党卫军, )和脓毒症与GLN (SG, )组,然后使用CLP如前所述22]。小鼠腹腔注射Zoletil(25毫克/公斤体重(BW), Virbac,卡罗,法国)和Rompun(10毫克/公斤BW,拜耳勒沃库森,德国)麻醉。打开腹膜,腹壁下切约1厘米的切口。然后,盲肠结扎在回盲瓣低50%,通过与23-gauge针穿刺。一滴粪便被挤出,抹到腹部。腹部与连续缝合关闭。CLP操作所有的动物都是由相同的技术人员,以确保一致性。手术后,无菌生理盐水(4毫升/公斤体重)皮下注射水化和免费获取水和啮齿动物食物。一百毫升的0.25% bupivacaine管理在切口部位皮肤关闭减轻手术后疼痛。老鼠的SS和SG团体牺牲在12日24或48 h post-CLP,分别根据自己的时间表。 Mice sacrificed at 12 and 24 h after CLP were injected with a single dose of either saline or GLN (0.75 g GLN/kg BW) intravenously via a tail vein 1 h after CLP. GLN was provided as alanyl-glutamine dipeptide (Dipeptiven; Fresenius Kabi, Homburg, Germany). This dosage was previously shown to have immunomodulatory effects on sepsis [18,23]。小鼠安乐死在48小时注射一剂量的生理盐水或GLN第一次注射后24小时增强GLN的功效。在实验的最后,老鼠通过心脏穿刺麻醉并被实施安乐死。体重和附睾的组织重量记录。血液样本收集和离心获得等离子体。腹膜被打开,并与生理盐水灌溉获得腹膜灌洗液(PLF)。肾切除。所有的样品都储存在−80°C进行进一步分析。

2.3。测量等离子体的生化标记和趋化因子

肾功能指标(血尿素氮(BUN)和肌酐(Cre))分析了由兽医®化学分析仪(IDEXX实验室Inc .)、韦斯特布鲁克、锰、美国)。肾损伤标记(中性粒细胞gelatinase-associated lipocalin (NGAL))测定使用商用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(研发系统公司,明尼阿波利斯,美国)。炎症趋化因子(单核细胞化学引诱物蛋白1 (MCP-1)和keratinocyte-derived趋化因子(KC))也用ELISA试剂盒(研发系统公司,明尼阿波利斯,美国)。抗体(Abs)特定于鼠标NGAL MCP-1, KC预镀的井微量滴定。血浆样本和试剂孵化和发达。的吸光度由分光光度计测量。分析程序按照制造商提供的协议。

2.4。测量等离子体氨基酸浓度

一个海域AccQ-Tag衍生工具(美国米尔福德,MA)被用来准备血浆样本。使用ACQUITY UPLC系统(水),样本用于ultraperformance液相色谱(UPLC)分离。一个Xevo TQ-XS(水域)质谱计是用于监测。氨基酸浓度测量由TargetLynx水域MassLynx 4.2软件和量化。

2.5。在PLF炎性介质浓度

白细胞介素- 10”(il - 10)、肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)、MCP-1和KC的ELISA试剂盒测定微量滴定板(研发系统公司,明尼阿波利斯,美国)。上面提到的细节。

2.6。信使(m) RNA的提取和分析实时逆转录(RT)定量聚合酶链反应(qPCR)

肾组织被试剂盒均质和总RNA分离试剂(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。RNA颗粒溶解在RNase-free水和储存在-80°C进行进一步分析。使用分光光度计,RNA浓度的吸光度量化260和280海里。我们使用RevertAid™第一链互补(c) DNA合成装备(热费希尔科学,维尔纽斯,立陶宛)合成的互补。互补脱氧核糖核酸是储存在-80°C,直到被使用。RT是由后续孵化5分钟在65°C, 60分钟42°C, 5分钟在70°C。信使RNA基因被实时rt - PCR放大使用7300实时PCR系统(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)与SYBR绿色我检测的格式。基因检测肾组织包括高机动组盒蛋白(HMGB) 1-associated通路(HMGB-1骨髓分化因子(MyD) 88年,toll样受体(TLR) 4,和核因子- (NF)κB),炎性细胞因子和趋化因子(il - 6、TNF -α和MCP-1)、巨噬细胞浸润标记(集群的区别(CD) 68和表皮生长因子以module-containing mucin-like激素receptor-like-1 (EMR-1)),肾损伤molecule-1 (Kim-1)和紧密连接蛋白zonula occluden-1 (ZO-1)。引物用表中列出2。引物都是由任务提供生物技术(台北,台湾)基于沉积cDNA序列(基因银行数据库,NCBI)。25的总量μL含Maxima SYBR绿色/火箭qPCR大师混合(2 x)(热费希尔科学),100 ng cDNA、和40 nM的每个引物用于放大。的反应是由一个循环处理2分钟50°C和10分钟95°C,紧随其后的是40周期15 95°C, 1分钟60°C,和最后一个分离曲线(DC)进行了分析。复制的基因表达水平量化实时rt - pcr的方法。相对mRNA表达计算周期阈值(CT)价值观和规范化鼠标3 -磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)。

2.7。分析髓过氧化酶(MPO)活动肾脏匀浆

肾组织用冷洗磷酸盐(PBS)然后用MPO均相测定缓冲区(1:10 wt /卷)。匀浆是离心10分钟13000 g除去不溶性材料。上层清液的收集和衡量髓过氧物酶活力测定工具包(Abcam、剑桥、马、美国)。试剂和样本添加到96孔板和孵化1小时。MPO活性测定在412纳米光学密度使用分光光度计和表示为一个单位/毫克蛋白(23]。分析程序按照制造商提供的协议。布拉德福德蛋白测定试剂盒(Bio-Rad,里士满,CA)是用来测量蛋白质浓度。

2.8。分析硫代巴比土酸活性物质(TBARS)在肾组织

肾组织均质在4°C试剂由蛋白酶和磷酸酶抑制剂(热费希尔科学,维尔纽斯,立陶宛)和组织蛋白质提取试剂(T-PER™,热费希尔科学)(1:100)。的匀浆在12000转离心10分钟。上层清液用于量化TBARS。TBARS由丙二醛(MDA)和硫代巴比土acid-reacted脂质过氧化终端产品。TBARS水平分析了商业分析工具(美国MI开曼群岛),决定在530 - 540纳米光学密度。的浓度TBARS被表示为μ米/毫克的蛋白质。布拉德福德蛋白质分析工具包(Bio-Rad)用于分析蛋白质浓度。

2.9。统计分析

所有的数据呈现的 (SEM)。数据分析与GraphPad棱镜5统计软件(美国GraphPad软件,拉霍亚,CA)。在同一时间点2脓毒症组之间的差异进行了分析 - - - - - -测试。NC和脓毒症组之间的比较,分析了三个不同的时间点单向方差分析(方差分析)其次是图基的事后测试。一个< 0.05被认为是具有统计学意义的价值。

3所示。结果

3.1。附睾的脂肪组织的变化和身体重量高脂肪饮食喂养后

最初的受虐妇女综合症数控和高频组之间没有差别。喂养10周后,小鼠高频组有更高的附睾的脂肪重量(NC 与高频 , )比NC组。同时,受虐妇女综合症中高频组高于数控(NC组 与高频 , )。

3.2。等离子体浓度的生化标记和炎症趋化因子

等离子体包、Cre NGAL KC, MCP-1 CLP后浓度明显升高。没有面包的差异,Cre MCP-1党卫军和SG团体之间12日24或48 h post-CLP。SG NGAL水平组显著降低在24 h和KC低12 h比SS组post-CLP(表3)。

3.3。等离子体氨基酸浓度

谷氨酸、GLN和支链氨基酸(BCAAs)包括亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸含量测量在12日,24日,CLP后48 h。SS组降低谷氨酸和GLN浓度在12和24小时而BCAAs高12 h post-CLP相比的NC组。SG组表现出更高的谷氨酸水平在12和24小时,GLN的三个时间点比CLP后SS组。异亮氨酸和缬氨酸浓度较低在12 h,而亮氨酸在12和24小时后CLP SG组比SS组(图1)。

3.4。PLF细胞因子和趋化因子的水平

脓毒症导致的肿瘤坏死因子-αil - 10, KC, MCP-1肥胖老鼠的浓度。SG集团相比SS组表现出更低的TNF -α在48 h, KC和MCP-1 12 h而抗炎il - 10在CLP(表后24 h升高4)。

3.5。肾脏炎症基因的表达

HMGB-1, MyD88、TLR4和NF -κB mRNA表达调节在脓毒症组比NC组。炎症介质包括基因表达的il - 6和TNF -α脓毒症后也升高。SG集团相比SS组较低MyD88基因表达式,il - 6和TNF -α在每个时间点,TLR4在12和48 h, HMGB-1和NF -κB在CLP(图48 h后2)。

3.6。巨噬细胞浸润标记的mRNA表达肾脏

数控,巨噬细胞浸润标记相比,CD68 EMR-1,化学引诱物MCP-1 CLP后都升高。MCP-1表达显著低于SG小组12和24小时比CLP后SS组。CD68的表达式和EMR-1 SG组低于在SS组48 h。没有差异CD68 EMR-1被认为在12和24小时post-CLP两脓毒症组(图3)。

3.7。信使rna的表达紧密连接和损伤肾脏蛋白质

紧密连接的基因,ZO-1 SG组明显升高比数控组后脓毒症。SG集团SS组相比表现出更高的ZO-1 CLP后基因表达在24和48 h。表达Kim-1 CLP后增加在24和48 h。SG组Kim-1表达低于SS组48 h post-CLP(图4)。

3.8。肾脏MPO活动

CLP后的MPO活性显著增加SS和SG组。SS组相比,SG组降低MPO CLP(图后活动在每个时间点5)。

3.9。肾脏脂质过氧化氢浓度

SS组MDA浓度高于数控组,而SG和NC组之间没有差异指出CLP后在每个时间点。SG组MDA水平低于SS组在12 h post-CLP(图6)。

4所示。讨论

肥胖是一个越来越大的挑战。有越来越多的肥胖病人收住icu (24]。有研究报告,与正常体重的患者相比,肥胖似乎降低死亡率在危重病人(25,26]。然而,研究还显示,肥胖病人中发现的较低的死亡率被废除时,结果调整的并发症和脓毒症的干预措施(27]。临床研究甚至表明败血症患者在ICU住院死亡率独立与肥胖相关(28]。尽管存在差异,肥胖被发现与更高的感染和夸大炎症(29日]。我们不包括一个肥胖的虚假的集团(没有脓毒症)在这项研究中,因为前的一项研究表明,与虚假的组相比,脂肪细胞巨噬细胞浸润和局部和全身炎症加剧肥胖与脓毒症(共存时30.]。由于肾脏是一个经常器官在脓毒症的影响,本研究的重点是探讨GLN sepsis-induced安琪在肥胖的影响。在这项研究中,GLN CLP后立即进行。集团牺牲在48 h,第二个24 h post-CLP GLN剂量注射。升压剂将加强GLN的功效在脓毒性状态。我们发现,在肥胖、GLN管理导致海拔等离子GLN水平,减轻氧化应激,炎症发生在肾脏,可能防止sepsis-induced AKI。

我们分析了基因表达式HMGB-1-associated介质。HMGB-1是一种蛋白质释放激活巨噬细胞和受损组织,与通常(31日]。HMGB-1的系统性炎症被认为是中介相对晚阶段的脓毒症(32]。先前的研究表明内生HMGB-1增强肾损伤炎症期间(33,34]。MyD88是一个适配器蛋白质之间充当连接器通常和下游激酶(35]。HMGB-1-mediated通路激活细胞信号,最终导致NF -κB激活和随后的炎性介质生产(31日]。Kim-1是一种跨膜管状蛋白表达在上皮细胞受损区域。Kim-1 AKI的可以被看作是一个指示器(36]。在这项研究中,我们观察到HMGB-1-mediated通路调节;肾脏炎症趋化因子和Kim-1表达增加。与等离子体的高度一致Cre和包子,NGAL水平提高脓毒症组。许多组织包括肾脏NGAL表示。在正常情况下,NGAL的表达很低,但将大大增加在上皮损伤和炎症37]。因此,NGAL被视为一个有用的生物标志物的阿基38]。上述调节生物标记表明肾脏炎症和损伤发生在肥胖与脓毒症复杂。Kolyva等人的一项研究还显示,肥胖与增强促炎细胞因子的生产和夸张的系统性发生在败血症患者氧化应激(39]。

细菌感染可能激活巨噬细胞和中性粒细胞。这些免疫细胞的渗透到肾脏组织导致持续的炎症和器官损伤(40]。在这项研究中,巨噬细胞的标志进行了分析。CD68是一种跨膜糖蛋白,是众所周知的一个表面标记大量巨噬细胞在炎症组织中表达的(41]。F4/80分子,也叫EMR-1,成立作为一个独特的标记小鼠巨噬细胞(42]。此外,肾脏MPO活性进行了分析。MPO激活中性粒细胞释放的一种酶。先前的研究表明,MPO可以用作标记的嗜中性粒细胞浸润和脓毒症患者的炎症的严重程度43]。在这项研究中,肾脏的表达CD68和EMR-1升高和MPO活性增加肥胖组与脓毒症,这表明巨噬细胞和嗜中性粒细胞浸润和炎症发生在实验期间。

在这项研究中,剂量GLN管理1或2在CLP后肥胖的老鼠。我们观察到有几个有利的影响,并没有指出在老鼠身上注射生理盐水。第一个GLN政府维持等离子体GLN BCAA的水平和逆转sepsis-induced GLN的损耗和谷氨酸。先前的研究表明,BCAA氧化和从肌肉组织是提高射流,从而提供能量底物的需求压力和异化的条件下(44,45]。增加BCAA水平观察SS组中特别是在12 h CLP后可能表明存在更严重的分解代谢在这个时间点。GLN政府提供了更多的燃料来满足所需的代谢和缓解在脓毒症分解代谢。第二个、GLN减毒部位的炎症损伤和肾组织。我们观察到,TNF -α浓度降低而增加抗炎细胞因子il - 10在PLF。此外,HMGB-1-mediated途径表达下调和炎性细胞因子表达降低的肾脏。我们的结果与之前的研究相一致,GLN下调HMGB-1通路,抑制NF -κB激活和随后的下游靶基因表达式(19,46]。此外,GLN的表达式可以激活过氧物酶体proliferator-activated受体(PPAR)。PPAR -γ可以通过一些配体激活,抗炎性质。GLN是PPAR的配体之一γ。先前的研究发现,GLN政府肠道内腔诱导PPAR -的表达γ和防止肠道缺血后肠道炎症的发生47]。第三GLN政府减少巨噬细胞和中性粒细胞浸润肾脏。激活巨噬细胞和中性粒细胞的标志,包括CD68、EMR-1表达式,在肾脏MPO活性,减少SG组。符合发现等离子NGAL水平较低和肾脏Kim-1和MCP-1而高ZO-1表达式指出这表明sepsis-associated肾损伤时减毒GLN管理。先前的研究发现,GLN持续的T细胞群和调制一个更为平衡的脓毒症相关联的辅助T细胞分化与减轻炎症和肾损伤(16,18]。

尽管GLN的抗炎特性,有其他的机制参与衰减肾损伤。氧化应激和炎症是潜在疾病发生在肥胖和脓毒症(48,49]。肥胖赞同败血症进一步加剧炎症反应和氧化应激29日]。GLN的前身是内源性抗氧化剂,谷胱甘肽(50]。在这项研究中,我们发现肾脏脂质过氧化物的产生降低了SG组。较低的氧化应激产生从GLN-associated氧化还原反应可以在减轻肾损伤中发挥作用。另一方面,血管内皮损伤和功能障碍与multiorgan损伤的进展在脓毒症(51]。内皮祖细胞(epc)来源于骨髓能增殖和分化为成熟内皮细胞(52]。循环内皮祖细胞被证明参与修复和维持血管内皮完整性在脓毒症(53]。先前的研究表明,CLP后GLN政府促进EPC动员、改善血管功能,保护远程器官损伤对脓毒症(54]。然而,GLN政府是否可能启动内源性内皮修复和改善微血管灌注,从而减轻肾损伤,需要进一步调查。

据我们所知,本研究调查的影响GLN sepsis-induced肾脏炎症和损伤在肥胖的第一次。结果表明,与肥胖共存,脓毒症导致巨噬细胞和中性粒细胞浸润肾脏,可能导致炎症和损伤的器官。GLN政府CLP后血浆GLN水平增加,减弱免疫细胞浸润肾,和解决sepsis-induced炎症和阿基。GLN的提议机制条例衰减sepsis-induced阿基提出了如图7。这里给出的结果表明,GLN可能可能减弱炎症和防止肾损伤在肥胖与脓毒症复杂。这个模型可能有临床应用对肥胖患者腹部手术感染的风险。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

本研究Chiu-Li叶的构思和设计。李汉苏进行研究和分析数据;Ming-Tsan林和Sung-Ling叶做的分析的一部分,有助于解释数据。林Ming-Tsan Chiu-Li叶,Sung-Ling叶准备手稿。所有作者阅读和批准最终提交的手稿。

确认

本研究支持的科研补助金TMU106-AE1-B14台北医学大学,台北,台湾。