文摘

封装的细菌链球菌引起的肺炎,流感嗜血杆菌b型,脑膜炎奈瑟氏菌,导致严重的全球发病率和死亡率。荚膜多糖(PS),这可能引起弱T cell-independent免疫反应,是一个至关重要的毒性行列式。的一个策略来改善PS-specific免疫原性是共轭PS无毒载体蛋白。破伤风类毒素(TT)和CRM_197年是PS的典型载体蛋白结合疫苗。TT与甲醛灭活破伤风毒素操纵,遭受污染残留甲醛和不完整的解毒。CRM_197年的缺点是低当量的净化与先进文化的要求条件。因此,一种新的载体蛋白没有这些缺点是非常必要的。破伤风毒素本机C-fragment (Hc)是安全、低成本、高免疫原性和简单的净化,这可以作为一个有前途的载体蛋白。肺炎链球菌血清型14和23 f大流行肺炎球菌感染的原因。在目前的研究中,荚膜PSs(《哈利波特与魔法石》第十四章和PS23F)共轭Hc, TT和CRM_197年,分别。TT和CRM_197年的轭合物作为控制Hc-based轭合物(PS14-Hc和PS23F-Hc)。Hc的结构性质与PS共轭后没有发生根本性的改变。PS14-Hc PS23F-Hc可以加强声音PS-specific抗体水平与控制。因此,Hc展出一个实际的载体作用,帮助肺炎球菌结合疫苗进行免疫原性好。

1。介绍

封装的细菌荚膜多糖(PS)链球菌引起的肺炎,流感嗜血杆菌b型,脑膜炎奈瑟氏菌,导致严重的全球发病率和死亡率1]。由于细菌对抗生素的耐药性增加,迫切需要有效的疫苗保护的封装差异疾病(2,3]。荚膜PS是一个重要的毒力的行列式封装细菌和被用作预防性疫苗抗原发展(4,5]。然而,PS疫苗引起抑制性T cell-independent免疫反应没有长期免疫记忆,尤其是儿童和老人6,7]。

产生的共轭疫苗已经共价结合的抗原PS无毒载体蛋白提高PS疫苗的免疫原性(8- - - - - -10]。与载体蛋白启动后,PS的免疫反应提高了增加T淋巴细胞的数量(11,12]。载体蛋白还可以锚PS B细胞mhc ii,使碳水化合物一部分给T细胞和诱发T PS cell-dependent反应(13,14]。因此,共轭疫苗被证明是免疫原性,可诱导免疫记忆和高活动性[15]。

破伤风类毒素(TT)是最常用的载体蛋白之一,和TT-based共轭疫苗开发提供保护与脑膜炎球菌和肺炎球菌疾病(16]。然而,TT来源于有毒物质造成梭状芽胞杆菌用甲醛灭活,患有残留有毒的甲醛(17]。c .有毒物质造成能抵抗甲醛通过形成孢子的失活,所以不能保证TT是完全无毒的17]。此外,TT-based结合疫苗显示高易怒、哭泣,和发烧。

可交叉反应的材料197 (CRM_197年)是一个载体蛋白用于共轭批准疫苗,如Prevnar(辉瑞)美国肺炎(13]。它不需要解毒与甲醛,从而保留辅助抗原表位,并提供更多lysyl侧链共轭[18]。然而,CRM_197年是古典文化上层清液的净化c . diphtheriaeC7 (β197)应变,患有低产量,需要复杂的培养条件(19]。因此,没有缺点的候选载体蛋白的两种蛋白质是共轭急需的疫苗。

本机C-fragment的破伤风毒素(Hc)是一个定义良好的蛋白质,保留了许多性质如低变应原性,低毒性,绑定活动神经节甘脂,免疫原性能力(20.]。由于其优势在生产、表征和同质性、Hc是一个很好的替代TT生产破伤风抗毒素(21,22]。此外,Hc可以通过三步净化提纯与高收益基于亲和色谱法。

肺炎链球菌血清型14和23 f已被证明是肺炎球菌感染的主要原因,和他们的荚膜PSs(《哈利波特与魔法石》第十四章和PS23F)是至关重要的致病因素(23,24]。在目前的研究中,《哈利波特与魔法石》第十四章和PS23F共轭Hc, TT和CRM_197年,分别。Hc的载体效应提高肺炎球菌结合疫苗的免疫原性,因此评估。TT-based和CRM_197年的轭合物作为控制Hc-based (PS14-Hc和PS23F-Hc)。PS14-Hc和PS23F-Hc都加强了强劲PS-specific体液免疫。的生物物理和免疫学性质PS14-Hc和PS23F-Hc调查。这项研究可以理顺Hc的载体效应提高肺炎球菌结合疫苗的免疫原性。

2。材料和方法

2.1。材料和动物

2-iminothiolane (IT),牛血清白蛋白(BSA), 5、5 - - - - - -dithio-bis - (2-nitrobenzoic酸),N——(2-aminoethyl)马来酰亚胺(AM)买来σ(美国)。辣根过氧化物酶(合)共轭山羊anti-mouse抗体(包括HRP-IgM HRP-IgG HRP-IgG1, HRP-IgG2a)是产品Abcam(美国)。PS血清型肺炎球菌14和23 f, CRM_197年,TT华兰生物工程公司工程有限公司(中国)的产品。Hc是如前所述[准备20.]。

BALB / c (15 - 20 g,女)从北京购买重要河流实验动物技术有限公司提供的老鼠足够的食物、水和一个舒适的环境下长大的。老鼠实验机构批准的动物保健和使用委员会北京实验动物研究中心(识别代码:zsbd - 2017 - a034 - 3 - r)。对老鼠进行的所有操作是根据批准的方法。实验的小鼠安乐死时,和所有的努力都是减少疼痛。

2.2。激活PS

4毫克/毫升第十四章或PS23F 20毫升的量添加到20毫米醋酸缓冲(pH值5.8),含有10毫米高碘酸钠进行氧化反应(图40分钟1)。氧化第十四章或PS23F 3毫克/毫升的浓度和体积20毫升,NaCNBH₃10毫克/毫升的浓度和体积的2毫升,我6毫克/毫升的浓度和体积的10毫升涨跌互现,孵化20毫米磷酸盐缓冲剂(PB缓冲区,pH值7.4)在一夜之间2 ~ 8°C。活化的PS随后透析20毫米PB缓冲区(pH值7.4)。

2.3。PS14-Hc和PS23F-Hc做准备

Hc 3毫克/毫升的浓度和体积中增加6毫升20毫米PB缓冲区(pH值7.4)包含36纳摩。孵化后在2 ~ 8°C一夜之间,自由是被广泛透析使用20毫米PB缓冲区(pH值7.4)。激活《哈利波特与魔法石》第十四章(2毫克/毫升,4.5毫升)或PS23F(2毫克/毫升,4.5毫升)与合成孵化Hc导数在一夜之间2 ~ 8°C,分别。结果配合被称为PS14-Hc PS23F-Hc,分别。

2.4。PS14-TT和PS23F-TT做准备

TT 3毫克/毫升的浓度和体积中增加9毫升20毫米PB缓冲区(pH值7.4)包含11纳摩。孵化后在2 ~ 8°C一夜之间,自由是被广泛透析使用20毫米PB缓冲区(pH值7.4)。激活《哈利波特与魔法石》第十四章(2毫克/毫升,4.5毫升)或PS23F(2毫克/毫升,4.5毫升)与合成孵化Hc导数在一夜之间2 ~ 8°C,分别。PS14-TT PS23F-TT被称为合成轭合物,分别。

2.5。PS14-CRM和PS23F-CRM做准备

CRM_197年3毫克/毫升的浓度和体积中增加6毫升20毫米PB缓冲区(pH值7.4)包含16个纳摩。孵化后在2 ~ 8°C一夜之间,自由是被广泛透析使用20毫米PB缓冲区(pH值7.4)。激活《哈利波特与魔法石》第十四章(2毫克/毫升,4.5毫升)或PS23F(2毫克/毫升,4.5毫升)与合成孵化Hc导数在一夜之间2 ~ 8°C,分别。PS14-CRM PS23F-CRM被称为合成轭合物,分别。

2.6。净化的轭合物

净化的六个轭合物是由Superdex 200列( ,美国通用电气医疗集团)尺寸排阻色谱(SEC)的方法。列是平衡和筛选了20毫米PB缓冲区(pH值7.4)2.0毫升/分钟的流量。然后,收集目标配合。

2.7。定量分析

phenol-sulfuric酸方法用于确定总PS轭合物的内容。定量方法测定非结合的PS的配合。该方法是基于TT的乙醇沉淀。TT的thiolation程度检测到5,5 - - - - - -dithiobis (2-nitrobenzoic酸)。使用BSA作为标准,TT内容配合的由bicinchoninic酸。然后,质量比率的PS / TT共轭疫苗。

2.8。动态光散射

使用一个怀亚特DynaPro泰坦TC仪器(美国圣芭芭拉分校CA),六个轭合物的分子半径计算25°C。之前分析,样本在12000 g离心10分钟在20毫米PB (pH值7.4)的缓冲区1毫克/毫升的浓度。

2.9。内在的荧光光谱

配合做好准备在蛋白质浓度为0.15毫克/毫升20毫米PB缓冲区(pH值7.4)。使用荧光分光偏振计(日立、日本),六个轭合物的固有荧光光谱被记录下来。发射的荧光强度与激发300 nm和400 nm之间在280海里。发射和激发狭缝宽度都是2.5海里。

2.10。圆二色性光谱

远紫外圆二色性(CD)六个轭合物的光谱分光偏振计检测到的(Jasco、日本)波长从260纳米到190纳米。该检测中使用的比色皿的长度是0.2厘米的道路。所有的蛋白质浓度的轭合物20毫米PB缓冲(pH值7.4)0.15毫克/毫升。

2.11。免疫接种

BALB / c小鼠(女,6周大)被随机分为8组第十四章的名称,PS23F, PS14-TT, PS23F-TT, PS14-Hc, PS23F-Hc, PS14-CRM和PS23F-CRM分别。每组有六个老鼠。小鼠腹腔注射不同的疫苗天0,14日和28日。所有的疫苗包含2μ克/毫升的PS的体积0.5毫升。老鼠的尾巴静脉血液14日拍摄于天,28岁,而42。小鼠的血清分离后储存在-20°C。

2.12。抗体滴度

免疫球蛋白的anti-PS抗体滴度、IgG1 IgG2a, IgM ELISA测定试验(25]。简单地说,PS14-BSA或PS23F-BSA (2μg PS /毫升)准备与前面的描述26)和涂96 - 100孔板μ我每一夜之间在2 ~ 8°C。盘子洗四次PBS + 0.1%渐变20 (PBST)。血清连续稀释1倍:100添加到好,孵化在37°C 1 h随后被四次。100年μl每好anti-mouse HRP-IgG、IgG1 IgG2a或IgM添加然后在37°C孵化1 h。PBST四次洗涤后,三甲基质添加到96孔板卷100μl /好,在室温下培养5分钟。50μl 2 M H₂所以₄被用来停止反应。OD的值_450年都被记录下来。

2.13。统计分析

美国GraphPad棱镜5软件(GraphPad软件)被用来分析结果。组老鼠之间的差异由单向方差分析比较。的值 ( )代表了统计学意义, ( )代表实验团体之间的高度统计学意义。

3所示。结果

3.1。净化的PS-Protein共轭

Superdex 200列( ,GE)被用来净化6配合基于秒。结果在图2(一个),PS14-Hc首次筛选了广义对称峰值为55.3毫升,紧随其后的是一个非结合的Hc的高峰。反应混合物PS14-CRM显示类似PS14-Hc的色谱行为,和PS14-CRM洗脱峰在52.4毫升(图2 (b))。相比之下,PS14-TT首次筛选了作为重要的峰值为45.2毫升,紧随其后的是一个小的非结合的TT(图2 (c))。结果在图2 (d),PS23F-Hc筛选了峰值的44.9毫升。同样,也出现两个洗脱峰的反应混合物PS23F-CRM和目标洗脱峰在44.4毫升(图2 (e))。反应混合物PS23F-TT被筛选了一个峰值为42.4毫升(图2 (f))。

六个配合的洗脱峰出现在PS23F-TT, PS23F-CRM, PS23F-Hc, PS14-TT, PS14-CRM,和PS14-Hc表观分子量成正比(多工作站系统)的配合。PS23F-based共轭首先被筛选了更多比PS14-based的;由于,PS23F MW高于《哈利波特与魔法石》第十四章。CRM_197年的轭合物被筛选了比Hc-based的早和晚于TT-based的。这个结果是由于CRM_197年表现出一种兆瓦高于Hc和低于TT。

3.2。分子检测半径

载体蛋白的分子半径和轭合物被动态光散射测量。TT的分子半径、Hc和CRM_197年6.9 nm, 4.7 nm,分别和5.2海里。的分子半径PS14-TT和PS23F-TT 11.9和14.3 nm,分别。的分子半径PS14-Hc和PS23F-Hc 10.3和12.4 nm,分别。的分子半径PS14-CRM和PS23F-CRM 10.8和12.9 nm,分别。这种分析与美国证券交易委员会(SEC)的结果(图是一致的2)。

3.3。定量分析

自由载流子蛋白质中没有检测到六个配合。相比之下,自由PS14 PS14-Hc比率,PS14-TT,和PS14-CRM分别为3.9%,2.8%和3.3% ( ),分别。自由PS23F比率PS23F-Hc、PS23F-TT PS23F-CRM是3.6%,4.2%,3.0% ( ),分别。第十四章/蛋白质比例( )PS14-Hc、PS14-TT PS14-CRM分别为0.56,1.39,和0.65,分别。PS23F /蛋白质比例( )PS23F-Hc、PS23F-TT PS23F-CRM分别为0.62,1.48,和0.77,分别。由于多工作站系统TT (140 kDa), Hc (50 kDa)和CRM_197年(62 kDa)第十四章/蛋白质和PS23F /比率(摩尔/摩尔)的六个配合相互可比。

3.4。固有荧光分析

由于Trp和酪氨酸残基,具有内在荧光的蛋白质。结果在图3(一个)Hc呈单峰曲线,最大波长328 nm。PS14-Hc发射荧光强度和PS23F-Hc略低于Hc的隐性变化最大的波长。如图3 (b)、CRM_197年显示一个单峰曲线,最大波长332 nm。PS14-CRM发射荧光强度和PS23F-CRM与CRM_197年,伴随着没有转变的最大波长。结果在图3 (c),TT展出一个单峰曲线的最大波长327 nm。PS14-TT或PS23F-TT的曲线几乎重叠与TT。因此,第十四章的接合和PS23F并未从根本上改变Trp,载体蛋白的酪氨酸的环境。换句话说,载体蛋白的构象与PS绑定时并没有改变。

3.5。二级结构分析

远紫外圆二色性(CD)光谱是用来测量六个配合的二级结构。结果在图4Hc, CRM_197年,TT显示典型的CD光谱。结果在图4(一),CD光谱PS16-Hc或PS23F-Hc几乎重叠在Hc。同样,PS16-CRM CD光谱和PS23F-CRM CRM的本质上都是正值_197年(图4 (b))。CD光谱PS16-TT和PS23F-TT接近TT(图4 (c))。因此,Hc的二级结构,CRM_197年,TT在本质上是改变与PS接合。

3.6。PS14-Specific抗体

ELISA试验被用来测量老鼠PS14-specific抗体滴度。结果在图5(一个),四组的免疫球蛋白g PS14-specific抗体的滴度都很低在第一次疫苗接种(14天)。第十四章组显示增加2.8倍PS14-specific免疫球蛋白浓度在第二次免疫相比第一季度(28天)免疫(~ 1:270)。第三个疫苗接种(42天)无法进一步加强免疫球蛋白浓度。然而,PS14-specific免疫球蛋白浓度PS14-Hc集团第二次免疫后会增加4.2倍(28天),这是高于第十四章组( )。第三个疫苗不能进一步加强免疫球蛋白浓度。的免疫球蛋白浓度PS14-TT ( )和PS14-CRM组( )没有显著不同于PS14-Hc组42天( , )。因此,Hc可以作为载体蛋白能力提高PS14-specific免疫球蛋白浓度CRM_197年和TT。

如图5 (b)四组所有显示低PS14-specific IgG1滴度第一次免疫后(14天)。Th2通路的标志,IgG1效价PS14集团的第二个和第三个疫苗接种后很难被探测到。相比之下,PS14-Hc组有增加2.4倍的具体IgG1滴度第二次(~ 1:180)疫苗接种和增加5.2倍的具体IgG1浓度后第三(~ 1:380)疫苗。的浓度IgG1 PS14-TT(~ 1: 900)和PS14-CRM组( )都高于PS14-Hc组42天(~ 1:380年, )。

结果在图5 (c),PS14-specific IgG2a第十四章组的浓度几乎检测不到三个接种疫苗。Th1免疫途径的迹象,其他三组被察觉的滴度IgG2a初始疫苗接种和显著增加在第二次和第三次接种疫苗。特别是PS14-Hc组显示明显高于IgG2a浓度在42天( )比PS14-TT集团(~ 1:430)( )和PS14-CRM团体(~ 1:190)( )。比率IgG2a / IgG1 PS14-Hc, PS14-TT,和PS14-CRM组42天是2.90,0.48,和0.15,分别。因此,Th1 / Th2 PS14-Hc集团的偏见与PS14-TT和PS14-CRM组明显不同。建议Hc可能比TT和CRM的刺激较强的细胞免疫_197年作为载体蛋白。

结果在图5 (d),四组的IgM浓度很低在最初在第二次接种疫苗接种和显著增加。第三个疫苗不能进一步加强免疫球蛋白浓度。此外,PS14-specific IgM滴度的四组互相媲美三种疫苗。此外,免疫球蛋白/ IgM PS14-Hc比率,PS14-TT,和PS14-CRM组42天是1.1,1.4,和1.4,分别。这些比率都高于第一次疫苗接种(1.0、0.8和1.0)。这个结果表明,第十四章的接合与载体蛋白质转移更多的回应IgM免疫球蛋白。

3.7。PS23F-Specific抗体

结果在图6(一)所有组显示,低免疫球蛋白浓度的PS23F-specific第一次免疫后抗体(14天)。PS23F集团没有升压PS23F-specific免疫球蛋白浓度相比,第二次和第三次免疫后的初始接种PS23F。相比第一次免疫PS23F-Hc(~ 1: 480)的免疫球蛋白浓度PS23F-Hc集团第二次免疫后会增加3.6倍和7.8倍增加第三免疫。此外,PS23F-specific免疫球蛋白浓度的PS23F-Hc组高于PS23F集团( )。因此,PS23F-Hc免疫原性的实质与增压机响应两剂后观察到的第二次剂量。PS23F-TT PS23F-specific的免疫球蛋白浓度( )和PS23F-CRM组( )在42天的都低于PS23F-Hc集团( )( )。因此,Hc显示一个更强大的比TT和CRM载体效应_197年在PS23F-specific免疫球蛋白浓度。

结果在图6 (b),所有的组织显示低IgG1 PS23F-specific抗体的滴度在最初接种疫苗。第二个和第三个疫苗可以显著提高IgG1滴度的三个共轭组( )。尤其是IgG1 PS23F-Hc集团的滴度( )是低于PS23F-TT集团( )和更高的比PS23F-CRM组( )( )在42天。

结果在图6 (c),PS23F-specific IgG2a PS23F集团的滴度无法察觉低毕竟三接种疫苗。的Th1-type IgG2a滴度的其他三组检测不到临到初始疫苗接种和略增加第二个( )和第三个疫苗( )。此外,IgG2a浓度的三组第三接种疫苗并没有显示显著差异( )。比率IgG2a / IgG1 PS23F-Hc, PS23F-TT,和PS23F-CRM组42天是0.03,0.02,和0.03,分别。因此,PS23F-specific三组的抗体反应主要在IgG1的形式。

结果在图6 (d),IgM浓度四组较低的初始接种疫苗。第二个和第三个疫苗不能显著加强免疫球蛋白浓度。此外,PS23F-specific IgM滴度的四组互相媲美三种疫苗。此外,免疫球蛋白/ IgM PS23F-Hc比率,PS23F-TT,和PS23F-CRM团体第三疫苗接种是3.1,0.9,和2.9,分别。这些比率都高于第一次疫苗接种(0.6、0.5和0.6)。这个结果表明,载体蛋白的结合变化的反应IgM免疫球蛋白,这是一个典型的共轭疫苗的反应。

4所示。讨论

Hc是一种安全、有效和廉价的蛋白质免疫原性效力强劲。肺炎链球菌血清型14和23 f是侵入性肺炎球菌病的主要原因在儿童和老年人。三个载体蛋白(Hc、TT和CRM_197年)共价结合和第十四章PS23F在目前的研究。六个轭合物被用来研究Hc的载体效应在第十四章的免疫原性和PS23F。

当T cell-independent抗原,第十四章和PS23F都有一些重复B细胞抗原表位。辅助细胞载体蛋白的抗原表位可以激活蛋白特异性CD4⁺T细胞,这可能提供帮助的B细胞内化和过程的共轭分子和演示的肽MHC II级(26]。PS-specific B细胞能诱导其分化对等离子体或记忆细胞,引起显著的强度PS-specific抗体反应(27]。获得保护性免疫美国肺炎主要是由于PS-specific抗体对抗侵入性肺炎球菌疾病自然获得。因此,PS-specific轭合物的抗体反应是在这项研究中调查。

形成的共轭疫苗PS,承运人蛋白质共价结合。几个因素可能影响PS-specific轭合物的抗体滴度,如接合方法,免疫协议,载体蛋白,PS抗原和PS /蛋白质摩尔比。接合方法,免疫协议,六个配合和PS抗原是相同的。第十四章,PS23F-based配合显示类似的PS /蛋白质摩尔比率。因此,载体蛋白的主要差异因素结合疫苗。

在目前的研究中,PS14-Hc和PS23F-Hc证明加强健壮PS-specific抗体反应的水平与TT和CRM_197年的控制。Hc拥有多个辅助细胞抗原表位和表现出的实际载体结合疫苗的免疫原性的影响,考虑到高水平的PS-specific抗体测定。这个结果表明足够力量的Hc作为载体蛋白。PS14-specific IgG响应后三个剂量高于PS14-specific IgM响应。类似的模式观察PS23F-specific免疫反应。这一结果表明,这两种抗原被Hc改为T cell-dependent抗原。

不同的蛋白疫苗、抗体滴度的具体多糖结合疫苗诱导的动物似乎并不高。张等人研究了13个化合价的肺炎链球菌多糖结合疫苗的免疫原性无佐剂在恒河猴。结果表明,不同类型多糖抗体效价是1:95.1 ~ 1:538.2 (28];沈等人研究了NIH小鼠腹腔免疫的抗体滴度与肺炎链球菌荚膜polysaccharide-tetanus类毒素结合疫苗了三遍。结果表明,对18 c和23 f多糖抗体滴度1:373.29和1:分别为422.24 (29日]。在我们的研究中,14 - 23 f的抗体滴度与Hc多糖对小鼠免疫结合疫苗三次可以达到1:1100和1:3700,远远高于以前的文献报道。推测,共轭疫苗有很强的免疫原性和良好的保护活动。

TT和CRM197是典型的载体蛋白脑膜炎球菌和肺炎球菌结合疫苗。荧光光谱数据证实,Hc, CRM_197年,TT认为大多没有与PS接合后构象变化。人口TT或CRM与既存的免疫力_197年,不受欢迎的抗体可以减少共轭疫苗的有效性与载体蛋白TT或CRM_197年。因此,Hc是否一个理想人选载体来避免这个问题。

5。结论

总之,结合与Hc显著增加肺炎球菌第十四章和PS23F的免疫原性。Hc的载体效应相当TT和CRM_197年。因此,Hc可以作为载体蛋白能力发展的荚膜PS共轭疫苗来防止封装细菌感染。这项研究让人们相信它是重要的选择一个合适的载体,使PS的抗原表位诱导的抗体反应。

数据可用性

所有的数据都可以从睿语博士(电子邮件保护)在请求。

附加分

突出了。这是第一个报告关于破伤风毒素原生C-fragment (Hc)、安全、低成本、高免疫原性,且易于净化,用作载体蛋白多糖结合疫苗。

的利益冲突

作者宣称他们没有利益冲突与这篇文章的内容。

作者的贡献

瑞玉道,胡锦涛概念和设计研究;睿语做了实验和分析数据;俊杰徐起草文章和修改它至关重要的知识内容;胡锦涛和魏道陈最终批准提交的版本。

确认

本研究在经济上支持中国国家重点研究和开发项目(2018 yfa0900804)和中国国家自然科学基金(31970875和31970875)。