紫草素对骨髓树突状细胞的功能的影响在严重的再生障碍性贫血小鼠模型

文摘

本研究旨在调查紫草素的影响,丙酮酸激酶平方米(PKM2)抑制剂,对髓系树突状细胞的功能(mdc)小鼠模型严重的再生障碍性贫血(AA)产生的全身辐照和淋巴细胞输注。流式细胞术和qPCR被用来确定PKM2的比例+ mDCs AA小鼠和其他免疫指标。葡萄糖消费水平、丙酮酸生成水平和ATP含量用于确定mDCs糖酵解代谢的水平。AA小鼠的存活率是评估管理后的紫草素或免疫抑制剂环孢菌素a AA小鼠显示全血细胞减少症,CD4 + / CD8 +细胞比值下降,增加穿孔素和granzyme水平CD8 +细胞,增加costimulatory CD80和CD86表达,和调节性T细胞数量不足。在活的有机体内动物实验表明,shikonin-mediated PKM2表达的抑制小鼠存活率高。此外,环孢菌素A或管理的紫草素的表达减少细胞毒性分子和costimulatory CD80和CD86 CD8 +细胞。总的来说,这项研究的结果表明,紫草素可以抑制mDCs的激活和增生以及下游的激活细胞毒性T细胞通过减少mDCs PKM2水平。

1。介绍

严重的再生障碍性贫血(SAA)是一类高度异构的血液与复杂疾病病因和发病机制1]。其临床症状通常表现为致命的贫血、出血、感染。免疫抑制治疗antithymocyte球蛋白和环孢菌素A (CsA)被认为是标准治疗方法SAA患者和改善预后。SAA患者表现出异常高水平的激活骨髓树突状细胞(mdc)分泌炎症因子参与了一代和激活的T细胞。这overactivation mDCs和T淋巴细胞导致骨髓造血功能的失败(2,3]。

紫草素是一种常用的中草药的活性成分紫草erythrorhizon也越来越收到重视,一种新的丙酮酸激酶M2 (PKM2)抑制剂4- - - - - -6]。由于其高度选择性抑制作用PKM2代替PKM1和丙酮酸kinase-L紫草素被认为是最有效的和特定抑制剂PKM2的日期(7]。最近,紫草素的抗癌作用也引起了广泛研究的关注。研究表明,紫草素对抗癌效果通过抑制不同癌细胞的增殖和诱导细胞凋亡和自噬。紫草素也已被证明能够抑制肝癌导致线粒体功能障碍和氧化应激水平增加肿瘤细胞(8]。除了它的抗肿瘤活性,紫草素已被证明对艾滋病毒感染具有疗效,牛皮癣,和其他自身免疫性疾病,但其潜在的机制仍不清楚。我们先前的研究显示,PKM2蛋白水平升高的mDCs SAA患者,争取民主变革运动的激活与增加细胞内PKM2的水平。PKM2调节SAA患者的免疫状态通过增强的功能mDCs和下游细胞毒性T淋巴细胞(ctl),以防止免疫失衡的加剧9]。因此,在这项研究中,我们关注调查SAA的紫草素对免疫状态的影响。

本研究使用了一个再生障碍性贫血(AA)小鼠模型通过诱导自体免疫性攻击和全身照射(TBI) +淋巴细胞输注。然后AA小鼠接受紫草素或CsA,和结果表明,紫草素影响mDCs和ctl的功能在活的有机体内。此外,高存活率和血液计数AA小鼠中发现的差别与shikonin-mediated对这些PKM2的水平。

2。材料和方法

2.1。研究对象

2.1.1。动物

AA小鼠模型得到从北京Weitong利华国际实验动物技术有限公司来生成这些AA小鼠,第一个子女一代近交C57BL / 6小鼠和Balb / c小鼠作为受体小鼠(CB6F1应变代码:303年,8周大,防晒系数)。这些老鼠主要组织相容性复合体(MHC)杂合的混合动力车H2^桶补充高的水平。从C57BL / 6小鼠同种异体供者淋巴细胞获得(H2^{b / b})。相应的野生型C57BL / 6小鼠(应变代码:213,8周大,SPF)被用作控制老鼠。与MHC不匹配的供者淋巴细胞输注后,T淋巴细胞免疫介导的骨髓破坏发生在CB6F1老鼠,与发病机理模拟人类AA。

获得的老鼠在动物饲养和维护中心,中国医学科学院放射医学研究所。英汉动物研究都是批准的天津医科大学校内的动物保健和使用委员会。

2.1.2。诱导骨髓衰竭

腋窝和腹股沟淋巴结(LNs)收集C57BL / 6捐助者,然后磨成匀浆、洗涤、离心和过滤。他们的手机号是计算和调整到10⁷/ 100μl

老鼠被分为三组:正常对照组(NC, ),创伤性脑损伤组( ),和一个AA模型组( )。数控组包含CB6F1老鼠。创伤性脑损伤的老鼠有4使用铯- 137伽马源Gy创伤性脑损伤。AA模型小鼠也preirradiated 4使用相同的铯- 137 Gy创伤性脑损伤的伽马源。4 - 6 h后,稀释LN细胞通过retroorbital窦注入收件人AA组小鼠(CB6F1) ⁶细胞/接收方在100年μL淋巴细胞分离的解决方案(Solarbio,北京)。

2.1.3。AA小鼠免疫抑制药物的管理

我们将CB6F1老鼠分成三组:CsA,紫草醌、生理盐水(NS)组。与供者淋巴细胞输注后1 h,三组管理CsA (50μg / g / d, ),紫草素(美国Sigma-Aldrich) (100μg / g / d, ),或生理盐水(NS, ),分别通过腹腔了10天。所有老鼠健康饮食,然后流血17天(见表的具体操作步骤S1)。

2.2。血细胞计数和免疫指标

2.2.1。血细胞计数

收集血液样本retroorbital鼻窦的老鼠,用EDTA实际上。使用一个自动血细胞分析仪血细胞计数测定(mek - 722,日本Kohden)。

2.2.2。流式细胞术

上述方法获得的外周血样本孵化与红细胞溶解产物的解决方案(美国BD生物科学)20分钟溶解红细胞(红血球)。溶菌产物都沾染了抗体和分析使用流式细胞分析仪(美国BD生物科学FACSCalibur)。

单克隆抗体对小鼠CD3、CD4、CD8 CD11c, CD80、CD86, Foxp3, PKM2, CD25、MHC II, CD107a, CD107b获得BD生物科学(美国圣地亚哥,CA)。

2.2.3。测定葡萄糖的消耗,丙酮酸生成和ATP含量

眼球提取后,小鼠的外周血样本收集和实际上与EDTA。mDCs排序,计算使用鼠标mDC immunomagnetic排序工具包(Miltenyi研究,德国)。细胞培养的上清液用于测量葡萄糖消耗使用葡萄糖测定工具包(南京生物工程研究所、南京、中国)根据设备的指令。丙酮酸和细胞ATP浓度测定用丙酮酸测定工具包(南京生物工程研究所、南京、中国)和ATP检测设备(Beyotime生物技术,中国上海),分别根据设备指令。血糖测量的光学密度在505 nm和丙酮酸生成,和ATP含量在636海里,是读者阅读使用ELISA (BioTek仪器,Inc .)、美国)。

2.2.4。定量rt - pcr(存在)

CD8 + T细胞从老鼠按immunomagnetic分离。总RNA提取并进行反转录。

在执行中存在一个iQ5 PCR系统(美国Bio-Rad大力神,CA)下面的热循环条件下:初始变性在95°C 2分钟,其次是40周期放大(95°C 10年代,表明退火温度为35年代,30年代,72°C和65°C 10 s)。引物序列如下:穿孔素、F: 5 - - - - - -CAGGTCAACATAGGCATGCACG-3R: 5 - - - - - -GAACAGCAGGACGTTAATGGAG-3 ;Granzyme B, F: 5 - - - - - -GAAACGCTACTAACTACAGG-3R: 5 - - - - - -CCACTGAGCTAAGAGGT-3 ;和β肌动蛋白F: 5 - - - - - -TTGCCGACACGATGCAGAA-3R: 5 - - - - - -GCCGATCCACACCGTGTACT-3 。感兴趣的基因的相对表达水平计算。

2.2.5。存活率

从数控小鼠的存活率( ),创伤性脑损伤( ),AA模型( ),紫草素( ),CsA ( ),和NS ( )组织了90天,直到死亡计算和比较。血细胞计数测定在17天,诱导后的30,90 AA。

2.2.6款。统计分析

数据了 。使用卡方检验统计分析,其次是非参数未配对 - - - - - -测试。值< 0.05被认为是指示意义。单向方差分析进行比较的三个独立的团体。

3所示。结果

3.1。血液计数检测数控、创伤性脑损伤和AA模型组

白细胞(白细胞)计数,红血球、血红蛋白(Hb)和血小板(plt) CB6F1小鼠的外周血样本 ⁹/ L, ¹²/ L, g / L, ⁹分别/ L, NC组; ⁹/ L, ¹²/ L, g / L, ⁹在创伤性脑损伤组分别/ L;和 ⁹/ L, ¹²/ L, g / L, ⁹/ L,分别在AA模型组。AA模型组的外围血液测试显示全血细胞减少症与数控和创伤性脑损伤组相比(表1,图1)( )。

3.2。PKM2在AA + mDCs增加小鼠和紫草素治疗后下降

PKM2的比例+ mDCs (PKM2 + CD11c + / CD11c +)是AA组(高 %)与NC组( %)和创伤性脑损伤组( %)( )。之间的比例没有显著不同的数控和创伤性脑损伤组( )。治疗后,紫草素mDCs PKM2水平降低( %, )和CsA ( %, )组的价格相比NS组( %, )( )。紫草素之间的水平没有显著差异和CsA组( )(图2)。

3.3。mDC Costimulatory分子CD80和CD86的表达增加的AA小鼠和CD86紫草素治疗后下降

来验证是否PKM2过度负责mdc的激活costimulatory分子的表情CD80和CD86 mDCs进行评估。的百分比mDCs数控的外周血样本,创伤性脑损伤,AA,紫草素,CsA, NS组 %, %, %, %, %, %,分别表明了六组之间的差异不显著( ,图S1)。

数控的比例CD86 + mdc,创伤性脑损伤,AA,紫草素,CsA, NS组 %, %, %, %, %, 分别为%。值得注意的是,比例明显高于AA组比NC和创伤性脑损伤组( )。治疗后,CD86表达紫草素和CsA组显著下降的价格相比AA组( ,图3(一个))。

CD80的百分比+ mDCs数控,创伤性脑损伤,AA,紫草素,CsA, NS组 %, %, %, %, %, 分别为%。CD80的百分比+ mDCs AA组升高的价格相比NC组( )。治疗后,CD80表达式CsA组显著降低的价格相比AA组( )。然而,没有观察到的统计上的显著差异CD80紫草素和AA组(图之间的表达式3 (b))。

3.4。葡萄糖消费水平、丙酮酸水平和ATP含量mDCs增加AA小鼠和紫草素治疗后下降

我们测量了葡萄糖消费水平、丙酮酸生成水平,和ATP含量确定的糖酵解代谢水平的mDCs每组。葡萄糖消耗水平的mdc数控,创伤性脑损伤,AA,紫草素,CsA, NS组 , , , , ,和 ,分别。值得注意的是,在AA组水平显著高于在创伤性脑损伤和NC组( )。治疗后,血糖mDCs消费水平的紫草素和CsA组显著减少的价格相比AA组( ,图3 (c))。

丙酮酸生成水平mDCs数控,创伤性脑损伤,AA,紫草素,CsA, NS组 , , , , ,和 ,分别。值得注意的是,在AA组水平显著高于在创伤性脑损伤和NC组( )。治疗后,丙酮酸生成水平的mdc的紫草素和CsA组显著减少的价格相比AA组( ,图3 (d))。

ATP含量mDCs数控,创伤性脑损伤,AA,紫草素,CsA, NS组 , , , , ,和 ,分别。值得注意的是,AA组中ATP含量显著高于在创伤性脑损伤和NC组( )。治疗后,ATP含量mDCs紫草素和CsA组显著下降的价格相比AA组( ,图3 (e))。

3.5。Granzyme B的mRNA表达CD8 +细胞增加了AA小鼠和紫草素治疗后下降

granzyme B mRNA表达CD8 +细胞的AA组( )明显高于CD8 +细胞的NC组( , )。值得注意的是,紫草宁的表情( )和CsA ( )组低于AA和NS组( )( ,图4(一))。然而,穿孔素mRNA表达CD8 +细胞表现出六组之间无显著差异( ,图4 (b))。

我们进一步研究了ctl的脱粒水平。的比率CD107a + CD8 + / CD8 +细胞(表示为一个百分比)显著高于AA组( %)的价格相比NC组( %)( )但显示数控和创伤性脑损伤组之间无显著差异( )。治疗后,CD107a水平CD8 +细胞明显减少紫草素( %)和CsA ( %)组的价格相比NS组( %)( )。值得注意的是,紫草素之间的CD107a水平的差异和CsA组没有明显不同( )。的比率CD107b + CD8 + / CD8 +细胞在数控(表示为一个百分比),创伤性脑损伤,AA,紫草素,CsA, NS组 %, %, %, %, %, 分别为%。AA组的比例明显高于NC组( )。治疗后,紫草素的比例和CsA组显著减少的价格相比AA组( ,图4 (c))。

3.6。PKM2抑制其他免疫细胞的影响

我们也探讨PKM2在其他免疫细胞的影响除了mDCs。CD4 + / CD8 +细胞的比例在AA组( )明显低于那些在创伤性脑损伤( , ),数控( , ),紫草素( , ),和CsA ( , )组(图5(一个))。

CD4 + CD25 + Foxp3 +细胞的比例(Treg) AA组( )明显低于那些在创伤性脑损伤( , ),数控( , ),紫草素( , ),和CsA ( , )组(图5 (b))。

3.7。紫草素的影响在AA小鼠的存活率

老鼠从数控,创伤性脑损伤、AA模型、紫草素,CsA, NS组安置来评估他们的90天的存活率。调查结果显示,90% NC组(9/10),100%(10/10)的创伤性脑损伤组,AA模型组的0%(0/5),60%(3/5)的紫草素组,CsA组的60%(3/5),20%(1/5)的NS组存活90天。在46天,60%的老鼠从紫草素和CsA组还活着,都活了下来,直到他们安乐死在实验的最后,但只有一个鼠标天46 NS组中幸存下来。同时,没有一个AA模型组小鼠存活到32天。如图6,90天之后第一个政府紫草素或CsA,紫草素的存活率和CsA组高于AA模型和NS组( )。之间的存活率没有显著不同的创伤性脑损伤和NC组。

老鼠的血液计数从创伤性脑损伤组90年天达到接近正常水平。创伤性脑损伤+淋巴细胞输注白细胞计数减少导致不可恢复的。直到死亡的时间,老鼠的血液计数AA模型和NS组没有改善,而那些老鼠的紫草素和CsA组,尤其是白细胞计数,逐渐恢复。图7显示了白细胞,Hb, PLT计数小鼠不同组织。

4所示。讨论

SAA是一种血液疾病,其特征是骨髓造血衰竭。尽管它的病因和发病机制复杂,最近的数据表明,AA是一种免疫介导性疾病(1]。据最新的研究显示,失调mdc在SAA发病机制中发挥作用(3]。然而,mDC的机制产生的感应激活和一系列的自身免疫损伤过程仍不清楚。

紫草素是一个主要从传统的中草药提取的活性化学成分l。erythrorhizon。研究已经证明,紫草素是一种高度特定PKM2抑制剂和扮演重要的角色在抑制乳腺癌、肝癌和其他肿瘤。近年来,研究紫草素在人类健康的角色逐渐加深。越来越多的证据表明,紫草素可以抑制肿瘤的生长和克服抵抗化疗药物在肿瘤细胞(10]。唐et al。11]表明,紫草素可以显著抑制食管癌细胞的增殖调节HIF1α/ PKM2信号通路。紫草素还可以抑制炎症免疫反应通过阻断炎症信号,从而推迟败血症等炎症性疾病的进展。此外,据报道抑制T淋巴细胞激活通过抑制IKKβ活动和物的信号,因此将发挥治疗作用作为一个潜在的免疫抑制剂在自身免疫性疾病12]。鉴于紫草素的广泛的治疗效果与免疫性疾病,炎症,肿瘤,在这项研究中,我们试图探讨紫草素对SAA发病机制的治疗作用。

DCs是唯一能够激活幼稚T细胞抗原递呈细胞”。他们可以分为若干个子集基于起源、位置和功能。mDCs发挥独特作用的生成T lymphocyte-mediated免疫反应(13]。mDCs激活T细胞的能力取决于他们的成熟和功能分化状态,也受环境因素如微生物产品、细胞因子、加氧酶,代谢产物,免疫抑制剂(14,15]。mDCs可以调节功能和T细胞的增殖,促进Th1和CD8 + T细胞的激活免疫反应。mDCs也扮演了一定的角色Treg分化调节,通过调节细胞程序性死亡配体- 1的表达和T细胞costimulatory分子(16]。在老鼠中,单核细胞炎症条件下可以区分mDCs在活的有机体内或在体外刺激后粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和白介素4 (17]。mDCs高度表达CD11c、mhc ii和DC-specific转录因子(18]。我们之前的研究表明,新诊断的mDCs SAA患者表现出PKM2蛋白水平升高,这种蛋白质参与争取民主变革运动的激活函数(8]。

在这项研究中,紫草素和CsA被用来治疗大鼠AA模型观察他们对这些小鼠的免疫状态的影响。CB6F1用于生成AA小鼠模型小鼠骨髓衰竭的诱导自身免疫攻击。的父母行CB6F1老鼠Balb / C小鼠(H2^{d / d})和C57BL / 6小鼠(H2^{b / b})。因为老鼠CB6F1 MHC-heterozygous携带H2混合动力车^桶高补,他们可以很容易地启动自身免疫反应水平。在之前的研究中,发现了致命剂量的辐照损伤造血组织CB6F1小鼠骨髓微环境的。此时,C57BL / 6小鼠(H2^{b / b})淋巴细胞,MHC-mismatched可以诱导持续免疫骨髓的造血损伤(19]。在我们的研究中,SAA模型小鼠血液计数减少。CD4 + / CD8 +细胞的比例下降,增加mDCs CD80和CD86的表达,增加水平的CTL脱粒,Treg数量不足也被检测到。在这些AA小鼠免疫功能紊乱的状态在SAA患者类似。我们发现AA小鼠PKM2 + mdc的比例升高,呈显著正相关的功能mdc和ctl。PKM2在mDCs确认激活在活的有机体内小鼠实验,但PKM2水平mDCs紫草素或CsA治疗后下降。mDC co-stimulatory分子CD80和CD86的表达增加的AA小鼠和CD86紫草素治疗后下降。这一发现表明,紫草素的表达减少mDC costimulatory分子通过减少PKM2的水平,抑制mDC激活,而不是减少mDCs的数量。葡萄糖消费水平、丙酮酸生成水平和ATP含量也增加的mDCs AA小鼠。这一发现表明,紫草素阻止细胞糖酵解代谢在某种程度上,从而抑制mDCs的激活和增生。水平的糖酵解mDCs紫草素和CsA治疗后也减少了。

在抗原表达、mdc逐渐成熟和表达高水平的costimulatory分子CD80和CD86 [20.]。ctl活性通过mDCs和众多细胞信号,启动免疫反应。作为主要的效应细胞与细胞毒性功能ctl SAA发病机制密切相关,所以我们还探讨了在AA小鼠紫草素对ctl的影响。我们的数据表明,紫草素的水平降低细胞毒性分子granzyme CD8 + T细胞和B可能调节CD4 + / CD8 +细胞的比例和AA小鼠Treg计数。紫草素的影响是CsA的类似。CD107a / b的表达表面的CD8 + T细胞在AA组增加相对于控件,但减少了紫草素或CsA后管理。CD8 + T细胞储存的大部分细胞毒性分子在细胞毒性颗粒,布满在接触目标细胞。lysosomal-associated膜糖蛋白,CD107a / b表示表面的CD8 + T细胞(21]。当CD8 + T细胞接触到目标细胞,costimulatory分子与靶细胞膜融合;这导致释放细胞毒性T细胞颗粒分子,最终导致靶细胞的死亡22]。CD107a / b的upregulation表情ctl在我们的研究中观察到符合granzyme b分泌会增加。因此,上述结果表明,AA组的CTL活性显著增加相对于管理后的控制,但减少了紫草素或CsA。我们推测,细胞毒性t淋巴细胞功能的变化是由于shikonin-mediated抑制mDC PKM2水平进而调节mDC costimulatory分子和炎症因子的表达。最近,Treg细胞群在SAA发病机理中的作用吸引了许多研究关注(10]。亚被认为控制自身免疫的发展在AA抑制T细胞功能亢进和预防的抗原呈递过程mdc (23]。我们的数据显示在AA小鼠亚群数量不足。紫草素处理或CsA时,亚群的数量增加,这是符合人类AA亚发现不足,不能抑制自体效应T细胞,最终导致T细胞介导骨髓衰竭。紫草素治疗后减少的活动mdc mDCs亚群上的抑制作用也减少。

此外,我们评估小鼠的存活率和外周血数量在不同时间点探讨紫草素和免疫抑制剂CsA的影响。我们SAA小鼠模型结合使用产生的创伤性脑损伤+淋巴细胞输注展出在32天内死亡率几乎100%。然而,用紫草素治疗或CsA的死亡率下降到40%。紫草素后的存活率增加和PKM2表达减少政府紫草素组与AA模型和NS组。这一发现表明,老鼠紫草素处理的高存活率与shikonin-induced有关抑制PKM2表达式。经过短时间内的骨髓抑制,血项创伤性脑损伤组迅速回到正常水平。然而,AA模型的血液计数和NS组没有改进,直到死亡的时间,而这些,尤其是白细胞计数,紫草素和CsA组逐渐恢复。这一发现表明,老鼠经验部分缓解紫草素或CsA治疗后血计数与AA模型和NS组。这个结果与我们之前的发现是一致的在体外研究使用人类细胞系PKM2 mDCs中表达水平与SAA进展显著相关(9]。紫草素管理AA小鼠是有利于疾病恢复,这再次证实了紫草素对SAA发病机制的治疗意义。

总之,紫草素可以抑制mDCs的激活和增生,抑制免疫效应细胞的激活下游通过减少mDCs PKM2的水平。因此,紫草宁是一个潜在的新药SAA免疫治疗的目标。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

伦理批准

所有适用的国际、国家和/或机构动物保健和使用指南。所有程序中执行研究涉及动物按照道德标准的机构或实践进行了研究。

的利益冲突

作者证实不存在利益冲突。

作者的贡献

所有作者列出了概念、设计、数据的收集、分析和解释了本文的写作内容和知识。所有作者给了知情同意提交的手稿。Mengying郑,Bingnan Liu渊源邵,萝岗区华贡献同样这项工作。

确认

这项工作得到了国家自然科学基金(81570106,81570106,81570106,81400088),天津市自然科学基金(14 jcybjc25400 15 jcybjc24300, 12 jczdjc21500),和天津科技支持重点项目计划(20140109)。

补充材料

图S1: mDCs的百分比在数控小鼠的外周血中,创伤性脑损伤,AA, PKM2-i, CsA和NS组被FCM检测。在单核细胞、mdc被确认为CD11c + MHC II +。在六组没有显著差异。( )。在老鼠身上表S1:具体操作步骤。(补充材料)

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