文摘

细胞外基质金属蛋白酶(MMPs)是一组蛋白激活酶底物的乳沟,他们的活动的基础上,已经证明在衰老的过程中扮演一个角色。因此,为了了解衰老的病理生理学和识别新标记的长寿,我们分析了MMP-2的活动水平和MMP-9与一些相关haematochemical参数在西西里的人口,包括长寿个人(LLIs,≥95岁)。一群154名健康受试者(72名男性和82名女性)不同年龄(年龄20 - 112)招募了。队列被分为五组:第一组受试者不到40岁,第二组从40到64岁,第三组从65年到89年,第四组从90年到94年的历史,和第五集团科目超过95年的历史。之间的关系是观察LLIs MMP-2,但不是LLIs和MMP-9之间。然而,MMP-2 LLI组和MMP-9值显著相关。此外,在LLIs,我们发现了一个正相关的MMP-2抗氧化分解产物尿酸和负相关炎症标志物c反应蛋白。最后,在LLIs MMP-9值直接相关的两个与胆固醇和低密度脂蛋白。总的来说,我们的数据表明,观察到增加MMP-2 LLIs可能发挥积极作用实现长寿。这是第一个研究表明,血清MMP-2活动增加LLIs比年轻的学科。 As far as we are concerned, it is difficult to make wide-ranging conclusions/assumptions based on these observations in view of the relatively small sample size of LLIs. However, this is an important starting point. Larger-scale future studies will be required to clarify these findings including the link with other systemic inflammatory and antioxidant markers.

1。介绍

老龄化是一个依赖于时间的功能下降,其中包括进行性恶化的生物生理功能去增加对疾病的易感性和死亡。这个过程是不可避免的,极其复杂的。然而,在过去的40年中,很多一直努力描述老化。如文献所述,有两种方法。与年龄有关的疾病的第一个是免费的,没有残疾(成功老化),而后者的特点是一个进步的倾向inflammageing,残疾,和与年龄相关的疾病(成功老化)1]。主要与年龄相关的疾病包括动脉粥样硬化、阿尔茨海默氏症和糖尿病,长期和持续的炎症组件成为损害(1,2]。另一方面,长寿的人(LLIs)被认为是最好的例子成功老化(3]。

胞外蛋白酶是一组蛋白激活酶底物的乳沟,工作机制的基础上,分为天冬氨酸的,金属-半胱氨酸,丝氨酸,苏氨酸蛋白酶(4]。在不同的免疫细胞、巨噬细胞和中性粒细胞是主要负责基质金属蛋白酶(MMP)的生产。这组蛋白质控制多种重要生理和病理过程,包括组织改造,DNA复制、细胞循环发展,神经衰弱,癌症(5]。

此外,基质金属蛋白酶负责改造的细胞外基质(ECM),代表一个三维的网络细胞外大分子如胶原蛋白、酶、糖蛋白,周围细胞提供结构和生化支持(6),尤其是干细胞利基(7,8]。ECM重塑的扰动与衰老有关,与年龄相关的疾病,例如,早衰症(极其罕见,常染色体显性遗传性疾病的症状,类似方面的老化,表现在很早的时候)(9),动脉老化,hypertension-associated血管变化(10),癌症转移,心脏衰竭,脑缺血和神经系统疾病包括帕金森症和阿尔茨海默病(11,12]。因此,分析基质金属蛋白酶可以将重要的信息添加到老化过程和长寿。作为一个例子,ECM蛋白,弹性蛋白,可以是一个不错的候选人作为衰老的生物标志物由于较低的人员流动率和老化过程中累积损伤的能力(13),如血管。胶原蛋白,另一个ECM蛋白质,是深入参与老化以来积累促使血管和肺衰老(14]。此外,在秀丽隐杆线虫、胶原蛋白等ECM蛋白质,是影响胰岛素/ IGF-1-like信号,进而延长蠕虫寿命模型(15]。

MMP-2(一种白明胶酶,72 kDa)和MMP-9(一种白明胶酶B, 92 kDa)是由3个域,杰出的II型额外纤连蛋白域插入到催化域。他们能够降解胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白、明胶、层粘连蛋白和促炎和抗炎的影响在很多组织(16- - - - - -18]。特别是,MMP-2既定的一些组织和表达是受肿瘤坏死因子-α的影响下NF -κB转录因子(19),而redox-regulated p38磷酸化和随后AP-1似乎激活的关键lipopolysaccharide-induced MMP-9表达式,至少在小鼠巨噬细胞(20.]。MMP-2与炎性状态紧密相关,如骨关节炎(21,22];此外,MMP-2保护从高血压心脏病通过抑制转录和3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA还原酶活性在早期阶段的高血压反应23]。有趣的是,它表明,在动脉粥样硬化斑块,MMP-2水平下降,相比nonatherosclerotic人体组织(24),而MMP-9水平增加,表明MMP-9活动导致内皮功能障碍(25]。

MMP-9也涉及脂质代谢(26),在老鼠模型中,它起着重要的作用对动脉瘤形成(27,28]。此外,蛋白质含量检测在卒中后的急性期,而MMP-2蛋白质含量增加几天后当屏障泄漏可能恢复。

因此,在我们的研究中,为了了解老化,与年龄相关的疾病,和长寿,MMP-2的活动水平和MMP-9分析与一些相关haematochemical参数在西西里岛的人口。

2。材料和方法

2.1。招聘和研究设计

一群154名健康受试者(72名男性和82名女性)不同年龄(年龄20 - 112)招募了。捐赠者都是西西里人,住在西方的西西里。一群训练有素的营养学家和医生进行问卷调查收集人口和记忆的数据感兴趣的。参与者选择的基础上,他们的健康状况,因为他们没有一个有肿瘤,感染,或自身免疫性疾病和没有规定药物已知干扰免疫炎症反应。参与者(或他们的亲戚一些LLIs)入学前签署知情同意书。尊重隐私,每个人都认同一个字母数字代码。创建一个数据库来处理收集到的信息。研究协议,依法进行的赫尔辛基宣言》及其修正案,巴勒莫大学医院伦理委员会的批准(营养和长寿,032017)。样本大小的适用性检查使用自由软件(http://ps-powerand-sample-sizecalculation.software.informer.com)的基础上我们的先前的研究结果。分析群体分为五组:第一组包括人不到40岁(19%,1年轻人群; ),第二组从40到64岁(25%,2成人人群; ),第三组从65到89岁(32%,三大人群; ),第四组从90到94岁(8%,集团4-oldest老人; ),和第五集团以受试者95多岁(16%,集团5-formed LLIs; )。招聘是按照指导方针和有关规定执行。

招募参与者接受了静脉穿刺后禁食期10 - 12小时。早上空腹血液样本获得(8至10点)和血清中收集管,没有添加剂。

以下haematochemical参数对所有参与者进行:白蛋白,丙氨酸和天冬氨酸转氨酶、碱性磷酸酶、胆红素、钙、肌酸酐,c反应蛋白(CRP),铁蛋白,glycaemia,高密度脂蛋白、铁、低密度脂蛋白(LDL)、镁、钾、总胆固醇(CHO)、总蛋白、转铁蛋白、甘油三酸酯,尿素,尿酸(UA)以及完整的血细胞计数测试。测试进行的实验室医学“P。Giaccone“大学医院,巴勒莫,根据标准程序。特别是,c反应蛋白测定是由immunoturbidimetry方法,UA通过比色试验和脂质参数通过酶比色检测罗氏/日立Cobas系统。

表1显示与haematochemical队列研究的基线特征参数与基质金属蛋白酶。

表1
队列研究的基线特征haematochemical参数。
2.2。明胶Zymography和聚丙烯酰胺凝胶电泳

血清蛋白浓度是量化spectrophotometrically,使用布拉德福德化验,如[29日,30.]。sds - page、整除10μgydF4y2BaL的血清,以前稀释(1:25),包含大约28μg总蛋白质的混合Laemmli缓冲区(2% SDS、10%甘油、5%β巯基乙醇,62毫米Tris-HCl pH值6.8),煮5分钟,装上 厘米的垂直8%聚丙烯酰胺凝胶。运行在150 V 50分钟执行一个迷你千变万化II Xi系统(Bio-Rad实验室开发。,米兰)。运行缓冲Tris-HCl 25毫米,200毫米甘氨酸,和0.1% SDS。凝胶沾0.2%考马斯亮蓝g - 250 40%甲醇和10%醋酸和de-stained 7%甲醇和5%醋酸。zymography化验,整除10μgydF4y2BaL(以前血清稀释(1:25)被加载到7.5%聚丙烯酰胺共聚和sds - page凝胶0.1%明胶,nonreducing条件下,并运行在150 V Tris-glycine缓冲区,所描述的Cancemi et al。31日- - - - - -33]。经过电泳,凝胶在室温下孵化1 h在洗缓冲区(50毫米Tris-HCl pH值7.5和2.5% Triton x - 100)删除SDS然后孵化18 h与激活缓冲区在37°C(50毫米Tris-HCl pH值7.5,150毫米氯化钠,CaCl和5毫米2),允许明胶酶的激活,如前所述[34,35]。凝胶是沾Coomassie蓝色。乐队与ImageJ强度测量软件。从人类乳腺癌组织中提取蛋白质样品(36- - - - - -39)被用作参考MMP-2和MMP-9活动水平。所有实验进行了一式三份。Gelatinolytic活动白人乐队出现在一个黑暗的背景(数据1(一)和2)。


图1
Pro-MMP-2,明胶zymography Pro-MMP-9活动水平评估。(a)的原型明胶zymography 36随机选择血清样本使用。(b)相同的血清样本的sds - page电泳(a)沾Coomassie蓝色。用星号LLIs所示(b)。

图2
明胶zymography 154年的血清样本进行了分析。每个车道代表一个不同的主题。实验进行了一式三份,光密度乐队被使用ImageJ软件量化。圣代表从人类乳腺癌组织中提取蛋白质样品作为标准。
2.3。统计分析

被处理的数据使用GraphPad棱镜软件5.0版本(GraphPad软件,拉霍亚,CA,美国)。非参数测试申请统计分析。特别是,Mann-Whitney 测试是用来比较两个子组的患者,克鲁斯卡尔-沃利斯检验是用来比较三个或三个以上子组的主题。将双尾α水平 来表示一个重要的区别。应用皮尔逊相关性进行相关测试。

3所示。结果

3.1。活动水平MMP-2和MMP-9血清样本和与年龄的相关性

血清从所有受试者参加本研究受到明胶zymography确定活动归因于MMP-2和MMP-9的相对水平。图1显示一组36基本吻合的集合中随机选择样本。运行并行SDS聚丙烯酰胺凝胶以确定正确的蛋白质加载。这两个著名gelatinolytic乐队代表proenzymatic MMP-2形式(Pro-MMP-2) (72 kDa)和MMP-9 (Pro-MMP-9) (92 kDa)。200年和116年的两个额外的裂解乐队kDa,确认为MMP-9二聚体(220 kDa)和MMP-9 / TIMP1复杂(116 kDa),也明显(40,41]。在所有的血清样本,没有明显的活动水平对基质金属蛋白酶的活性形式。

Pro-MMP-9的活动水平在所有样本比Pro-MMP-2显得更加强烈。为了评估的相对变化两个Pro-MMP水平在所有科目(图2),凝胶,含有样品,一式三份,受到光密度分析通过使用ImageJ软件,如材料和所述方法。

凝胶的科目分配如下:1年轻人群, :道12,44岁,45岁,46岁,75,77,79,80,81,82,85,89,90,92,98,99,100,106,109,110,115,118,122,125,128,130,136,142,和145年;2成人群体, :车道11、14、15、16日,25日,27日,33岁,34岁,39岁,50岁,52岁,54岁,60岁,64,66,69,72,74,78,88,91,93,95,104,105,108,116,117,121,123,124,127,131,134,135,138,139,144,和152年;三大群体, :通道1、2、3、4、5,6,7,8,9,10,13日,17日,19日,20日,22日,23日,28日,29日,38岁,42岁,43岁,47岁,51岁,55岁,57岁,63,68,76,83,84,86,87,94,97,101,102,103,113,114,119,120,126,132,137,140,141,146,149,151,和154年;集团4-oldest老人, :35道31日,53岁,56岁,今年58岁,61,62,70,71,73,129,133;和组5-LLIs, :26道18日,21日,24日,30日,32岁,36岁,37岁,40岁,41岁,48岁,49岁,59岁,65,67,96,107,111,112,143,147,148,150,153。

为了评估可能的白明胶酶活动的水平和年龄之间的相关性,进行统计分析酶活动的不同个体之间的分裂在团体中描述的材料和方法。数据3(一个)和3 (b)报告的概述Pro-MMP-2的分布和Pro-MMP-9活动5组,对应于每三个测量样本的平均值。尽管每个Pro-MMP变量的活动水平在主题,一个重要的协会得到Pro-MMP-2(图3 (b))。特别是,Pro-MMP-2活动水平随年龄的增加而增加的。之间的显著差异观察第一、第二和第三组和LLIs集团。之间没有显著差异获得第四和第五小组,可能由于表现不佳的第四组(8%)和五组的年龄接近。

(一)
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图3
箱线图图表Pro-MMP-9 (a)和Pro-MMP-2 (b)明胶zymography分组活动水平评估的年龄。盒子的两端是上、下四分位数,线平行延伸的外框是用来表示变化上、下四分位数,而中位数是一条垂直线在盒子里面。执行的光密度分析,通过测量每个乐队的强度水平和相应的区域,称为体积。应用克鲁斯卡尔-沃利斯非参数统计分析进行了测试。 , ,和 。

相比之下,Pro-MMP-9的活动水平(图3(一个)随着年龄的增长)没有任何关联。然而,只有LLI组的活动水平Pro-MMP-2 Pro-MMP-9显著相关活动( , )。

有趣的是,当根据性别群体进行分析,明确增加Pro-MMP-2活动中可观察到随着年龄的男性而不是女性性别(数字4(一)和4(b)),可能是因为,尤其是女性,基质金属蛋白酶的表达也依赖于激素状态(42,43]。另一种假说可能是更好的健康的男性LLIs。众所周知,男性百岁老人数量更少但比女人更健康44]。少数研究不允许我们分析这种可能性。由于减少了样本大小,在男性,获得的意义只是LLI和年轻组。


图4
散点图Pro-MMP-2活动水平的女性男性(a)和(b)评价明胶zymography和年龄分组。线表示平均值和标准误差。执行的光密度分析,通过测量每个乐队的强度水平和相应的区域,称为体积。应用克鲁斯卡尔-沃利斯非参数统计分析进行了测试。 。
3.2。Pro-MMP-2和与相关Haematochemical Pro-MMP-9相关参数

血清活动水平之间的相关性Pro-MMP-2 CRP和UA也进行了分析。事实上,MMP-2活动在组织中扮演相关角色重塑的病理生理学和炎症,c反应蛋白是一种炎症标记(45),而血清UA被认为有抗氧化作用[46]。有趣的是,只有LLIs显著相关。特别是,我们发现了一个逆相关性CRP水平和LLIs Pro-MMP-2活动( , ;图5(一个))。相反,我们发现UA水平之间的正相关和LLIs Pro-MMP-2活动( , ;图5 (b))。

(一)
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(b)
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图5
直方图的Pro-MMP-2 LLI组的活动水平和血液的CRP值(a)和UA (b)的相关性。在血液参数的趋势显示了一个正或负相关。

图中的数据6还根据性别进行描述,很明显,女性LLI人口,Pro-MMP-2活动反向与c反应蛋白( , )并积极与UA ( , )。

(一)
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(c)
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(d)
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图6
直方图的Pro-MMP-2 LLI组的活动水平和血液的CRP值(a, b)和UA (c, d)女(a - c)和男(罪犯)来显示发现相关性。在血液参数的趋势显示了一个正或负相关。

自从MMP-9调节胆固醇代谢(26),我们分析了Pro-MMP-9活动之间的相关性和CHO水平。有趣的是,我们发现胆固醇水平之间的正相关和LLIs Pro-MMP-9活动( , )。

我们还发现低密度脂蛋白水平之间的正相关和LLIs Pro-MMP-9活动( , ;数据7(一)和7 (b))。

(一)
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(b)
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图7
直方图的Pro-MMP-9 (a, b) LLI组的活动水平和血液的曹值(a)和低密度脂蛋白(b)的相关性。在血液参数的趋势线显示了正相关的。

图中的数据8根据性别显示相同的结果。在男性LLI人口,Pro-MMP-9活动积极与曹(相关 , )和低密度脂蛋白( , )。

(一)
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图8
直方图的Pro-MMP-9活动水平和血液值的赵女男性(a)和(b) LLI group)和女性(c)和低密度脂蛋白的男性(d) LLI组。

4所示。讨论

在目前的研究中,可能的基质金属蛋白酶所扮演的角色在衰老和长寿都集中。基质金属蛋白酶是一个家庭的结构和功能相关zinc-dependent蛋白酶具有广泛的底物,包括ECM组件、细胞因子、受体和细胞活性的因素。人们普遍认识到,基质金属蛋白酶发挥作用在各种组织的病理生理学的增长,发展和老化。的白明胶酶成员MMP的传统,家庭,MMP-2 MMP-9,一直使用明胶zymography最简单的检测;因此,他们(上有更多的可用数据47- - - - - -49]。

先前的研究表明,老龄化与MMP-2活动的增加(50]或MMP-2和MMP-9 [51和活跃MMP-9浓度随着年龄降低48]。

许多研究表明,老龄化LLIs与成功老化的最佳模型,这老人口是最好的人口研究。平均发病的与年龄有关的疾病,百岁老人被分为三个配置文件,幸存者,延缓型,幸免型。幸存者有一种与年龄有关的疾病的诊断之前,80岁。延缓型受到一个与年龄有关的疾病的影响后,80岁。幸免型达到100th年的生活没有与年龄有关的疾病的诊断52]。因此,极端的寿命通常表现为不独特而明确的表型,因为可能有多个路径来实现长寿。然而,每个LLI可以代表一个模型的“积极的生物学”可以解释健康和福祉的生物机制(44]。

如图所示变化与衰老有关影响免疫炎症反应的免疫功能下降,增加系统性炎性状态、即。功能下降,免疫衰老,不仅与时间的流逝也抗原负担,一个人在一生中(53]。长寿命慢性抗原压力有助于慢性低度炎症状态,inflammageing,观察到老年人。Inflammageing特点是增加促炎介质的水平。反过来,代表一个负所有死因的预后因子。氧化应激中扮演一个重要的角色在决定和维持低度炎症,导致氧化应激(54]。所以,百岁老人显示增加许多炎性分子比较成人,但这种情况是补偿的同时激活抗炎反应。这表明inflammageing可能与长寿特别是平衡共存的抗炎成分。(可能)会成为百岁老人的人应该能够降低炎症更长时间(44]。

知识来自这些研究可能提供有价值的信息在调制实现健康老龄化老龄化率和指出一种长寿的签名。识别的因素使成功老龄化是转化医学的巨大利益3]。

在我们的论文中,结果表明,血清MMP-2活动增加LLIs比年轻的学科。此外,在LLIs,我们找到一个正相关的MMP-2 UA和CRP的负相关。

UA是内源性和外源性嘌呤代谢的终产物,和一些流行病学研究表明,血清UA水平增加疾病的危险因素,氧化应激中起着重要的作用。相反,其他证据表明,UA可能发挥作用是一种抗氧化剂(46]。可能的解释在于UA可能像氧化剂变老。

c反应蛋白,主要由肝脏分泌的,是最重要的生物标志物的炎症,通常评估监测治疗反应和预测炎性疾病的长期结果。血清c反应蛋白水平增加年龄相关性的方式,良好的身体和认知能力预测和死亡率的风险在整个老人口和成功岁个人(45]。

尽管他们的名字,MMP矩阵蛋白质的酶不仅体积下降但他们也提供一种机制来添加一个额外的监管层细胞间通信,包括炎症。特别是MMP-2调节趋化因子的处理monocyte-chemotactic蛋白质3产生趋化因子受体拮抗剂,反过来,可能提供规定的炎症信号级联直接施加MMP-2 [55]。更有趣的是,MMP-2激活负责降解alarmin S100A9,从而限制inflammation-inducing信号。它是无菌炎症有关,alarmins介质在衰老和衰老相关疾病56]。

因此,抗炎活性MMP-2可以解释正面和负面的联想,分别与CRP和UA水平以及增加LLIs相比其他年轻群体。然而,值得注意的是在解释这些结果应该添加,因为它已经证明了抗高血压药物可以降低Pro-MMP-2活动(57),我们没有这些信息对于大多数主题下的研究。

MMP9影响胆固醇代谢,至少部分通过MMP-9 plasma-secreted影响肝磷脂酶A2轴转录反应膳食胆固醇。因此,有人提出MMP-9的失调可以导致代谢紊乱,可能的发展,最终导致动脉粥样硬化和冠心病26]。MMP-9结果表明,水平不提高LLIs水平高度变量在整个人口。

总的来说,观察到增长MMP-2 LLIs可能建议实现长寿的积极作用。有趣的是,基质金属蛋白酶都被定性为双功能蛋白在阿尔茨海默病,他们中的一些人,比如MMP-2 MMP-9,显示保护作用在疾病进展,而其他促进疾病发展(7]。

然而,很难使广泛的结论/假设基于这些观察针对LLIs的样本量相对较小。尽管如此,我们相信,这是一个重要的起点为未来大规模研究需要保证这些发现包括链接和其他系统性炎症和抗氧化剂标记。

数据可用性

生成的数据集和/或分析在当前研究由于隐私不公开的原因,但从作者可以以匿名形式合理的请求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Patrizia Cancemi和安娜Aiello的贡献同样这项工作。

确认

这项研究是由普林斯顿(普林斯顿- 20157 - atslf_009;设计:发现潜在的分子和遗传和表观遗传签名抵制衰老相关疾病和并发症)贝和g . C和Stiftelsen大车Engkvist Byggmastare VS。