) on day 7 after first LPS stimulation. However, the analysis of cellular metabolism did not reveal any noteworthy alterations between tolerant and nontolerant THP-1 monocytes. No quantitative differences in ATP and NADH synthesis or participating enzymes of energy metabolism occurred. Our data demonstrate that the function and epigenetic modifications of septic and tolerized monocytes can be examined in vitro with the help of our LPS model. Changes in CpG site methylation and monocyte function point to a correlation between epigenetic modification in metabolic pathways and reduced monocyte function under postseptic conditions."> 持续Immunoparalysis Endotoxin-Tolerized单核细胞的细胞 - raybet雷竞app,雷竞技官网下载,雷电竞下载苹果
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研究文章|开放获取

体积 2020年 |文章的ID 8294342 | https://doi.org/10.1155/2020/8294342

克里斯蒂娜·k·Weisheit、亚历山德拉Kluners Lennart野外,亚历山德拉Casalter,斯蒂芬妮Heilmann-Heimbach, Sugirthan Sivalingam, Jan l . Kleiner斯特凡·f·Ehrentraut Andreas Hoeft Stilla Frede,海蒂Ehrentraut, ”持续Immunoparalysis Endotoxin-Tolerized单核细胞的细胞”,炎症介质, 卷。2020年, 文章的ID8294342, 10 页面, 2020年。 https://doi.org/10.1155/2020/8294342

持续Immunoparalysis Endotoxin-Tolerized单核细胞的细胞

克里斯蒂娜·k·Weisheit,1 亚历山德拉Kluners,1 Lennart野生,1 亚历山德拉Casalter,1 斯蒂芬妮Heilmann-Heimbach,2 Sugirthan Sivalingam,2 简·l·Kleiner,1 斯蒂芬·f·Ehrentraut,1 安德烈亚斯•霍夫特,1 Stilla Frede,1 和 海蒂Ehrentraut1

1麻醉和重症监护医学,德国波恩大学医院

2基因组学、生命和大脑中心,德国波恩大学人类遗传学研究所

学术编辑器:米甲a Rahat
收到了 2020年2月11日
修改后的 2020年5月05
接受 2020年5月11日
发表 2020年6月13日

文摘

脓毒症与强烈的炎症反应引发了复杂和持久的免疫反应。败血症的病人已被证明发展持续免疫抑制由于白细胞的减少响应病原体。白细胞与细胞代谢的改变这一现象,为正在进行的免疫错乱。然而,这种现象的潜在机制还不完全清楚。在细胞培养模型,我们模仿有限合伙人公差条件提供证据表明,表观遗传修饰占单核细胞代谢变化导致重振感染性单核细胞的免疫麻痹。在细节中,我们观察到微分CpG甲基化的网站相关的代谢活动在人类PBMCs 18 h后感染性的挑战。考试的免疫功能和代谢途径的变化表现在LPS-tolerized单核细胞的THP-1细胞。通过THP-1细胞,继承初始有限合伙人的挑战,提出了细胞因子表达的失调和耗氧量长达7天在最初的有限合伙人的待遇。促炎细胞因子TNF浓度α和摘要意思β显著抑制后第二个有限合伙人的挑战( )第一个LPS刺激后7天。然而,细胞代谢的分析并没有透露任何值得注意的改变之间的宽容和nontolerant THP-1单核细胞。没有定量合成ATP和NADH的差异或参与能量代谢的酶发生。我们的数据表明,脓毒性的功能和表观遗传修饰,获得耐受性单核细胞可以在体外检查在我们的帮助下LPS模型。网站CpG甲基化的变化和单核细胞功能点之间的相关性表观遗传修饰postseptic条件下代谢途径和减少单核细胞功能。

1。介绍

脓毒症与强烈的促炎和抗炎反应的相互作用。然而,后者可能会加剧宿主防御机制和免疫细胞功能改变(1]。长期免疫功能紊乱患者应对败血症的妥协结果继发感染。这些病人的白细胞immunoparalysis显示,以减少炎症和广义代谢缺陷在糖酵解和氧化代谢水平。根据剂量和第一次触发类型,第二个刺激可以引起不同的反应2,3]。表观遗传记忆可能引发公差或培训,即。,以减少或增强免疫反应(4,5]。内毒素耐受是一个至关重要的体内平衡机制,防止过度刺激的先天免疫反应持续或复发性toll样受体(TLR)刺激6]。内毒素耐受被认为是一种天生的免疫记忆,描述一个条件公差对病原体,特点是先天免疫hyporesponsiveness或immunoparalysis [7,8]。

Prestimulation单核细胞或巨噬细胞与高剂量的脂多糖(LPS)能引起LPS宽容9]。然而,低剂量的有限合伙人可以增加第二LPS引起的响应,导致训练而不是宽容,这表明对记忆的影响是剂量依赖(10,11]。

在感染细菌的分子模式,如有限合伙人影响信号转导在不同的水平。修改的TLR - 4信号级联,改变职业和抗炎细胞因子和趋化因子水平,激活转录因子的变化,和外遗传性机制可能重组宿主的反应(2]。表观遗传效应包括DNA甲基化可以短暂或持续的字符(12]。他们的影响力在炎症和免疫过程是一个正在进行的调查的问题。以来到目前为止,所知甚少的交互的复杂性在临床、细胞和分子水平阻碍转移和生殖细胞模型。DNA甲基化是最稳定的标志,其次是生命周期较短的组蛋白甲基化,使细胞分裂后保存改变(13]。

绝大多数研究先天免疫耐受的机制缺乏长期的观察。增殖的细胞是一个先决条件在调查父母细胞如何传递免疫调节作用,可能通过表观遗传过程(14]。然而,扩散PBMCS培养条件下是难以实现的。与选择性刺激生长因子改变了代谢反应和细胞刺激后效应函数。因此,我们开发了一个长期模型LPS-pretreated单核细胞的THP-1细胞,在LPS-free接受连续使媒体和他们的表型分析。

单核细胞源于骨髓髓系祖细胞。回应刺激分化和生长因子、单核细胞进入血液。在炎症信号,单核细胞迁移到受感染的组织,开始分化。单核细胞在全身炎症反应综合征的发展和补充抗炎反应综合症(15,16]。单核细胞吞噬作用、抗原表达和细胞因子生产影响代谢调制(17]。LPS诱导重编程通过TLR4在巨噬细胞和树突细胞氧化磷酸化的抑制,增加葡萄糖的吸收和糖酵解和其他代谢途径(18]。

我们旨在分析immunocompromisation是如何反映在CpG甲基化的水平。此外,免疫功能紊乱的进展和代谢改变在一段时间是我们的基本问题。

2。材料和方法

2.1。PBMC隔离和LPS刺激

新鲜的健康志愿者外周血从四个。PBMC隔离是由覆盖6毫升的血液每3毫升Histopaque 1077年和1119年(σ)。在室温下15毫升管离心机(RT)为30分钟 。由此产生的PBMC层检索和洗了三次(10分钟, )与PBS rt,表示细胞数量的细胞被resuspended RPMI 1640 (Lonza、巴塞尔、瑞士)补充heat-inactivated 10%胎牛血清(的边后卫,Applichem,达姆施塔特,德国)。

PBMCs每个主题的孵化与有限合伙人10 ng / ml (大肠杆菌0111年有限合伙人:B4,σ,圣路易斯,密苏里州,美国)或介质控制(图1)。18小时后,样品被暴露于高剂量的有限合伙人(100 ng / ml媒体)或媒介控制。三小时后,样本离心机为5分钟 和4°C。上层清液和细胞颗粒分离,保持在-80°C,直到进一步的处理。


图1
研究设计。时间表PBMC THP-1栽培,有限合伙人治疗和抽样。
2.2。DNA隔离、亚硫酸氢转换和英飞纳姆甲基化史诗珠芯片阵列

PBMCs收获从四个额外的健康志愿者。对于每一个主题,107PBMCs /毫升孵化与有限合伙人10 ng / ml或PBS 18个小时并通过离心收获。使用基因组DNA DNA孤立隔离设备(Machery内格尔,Duren,德国)。孤立的DNA是储存在-20°C。亚硫酸氢转换的DNA进行利用试剂盒EpiTect工具包(试剂盒、希尔登,德国)根据制造商的协议。英飞纳姆甲基化史诗珠芯片阵列(美国圣地亚哥Illumina公司)作为发布在别处(运行19]。

2.3。THP-1文化使实验

THP-1细胞获得写明ATCC(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)和培养RPMI 1640 (Lonza)补充10% heat-inactivated的边后卫。为维护、THP-1培养细胞分裂每2到3天,resuspended 106细胞每毫升的媒介。

刺激之前,细胞T125烧瓶集中,清点,resuspended 106细胞/毫升媒体。细胞被播种到T75烧瓶和刺激一次血压得到较好的控制有限合伙人(1μg / ml中)或PBS控制通道(P) 0)(图1)。细胞计数,使之前,离心机( 5分钟),和resuspended 106每次细胞/毫升LPS-free新鲜的媒体。在每个使周期,两治疗组细胞的一部分被转移到一个新菜,收到第二个刺激,有限合伙人(1μg / ml中)或PBS。

2.4。RNA隔离和互补脱氧核糖核酸的合成

RNA被隔绝 THP-1细胞或 PBMCs /样品。细胞被resuspended 1毫升试剂盒(热费希尔科学)。之后的200年μl氯仿(Applichem,达姆施塔特,德国),暂停反复倒,其次是在室温下10分钟孵化。阶段被离心分离( )在4°C,持续15分钟。上层水相转移到一个新的RNase-free反应管。500年的RNA沉淀后添加μl异丙醇,在室温下10分钟孵化。离心后( ,10分钟,4°C),上层的丢弃,颗粒在DEPC-H用1毫升75%乙醇洗两次2O,其次是离心( ,5分钟,4°C)。风干RNA颗粒resuspended在20μl DEPC-H2o . RNA浓度确定spectrophotometrically (NanoDrop热费希尔科学)。高容量cDNA逆转录工具包(热费希尔科学)是利用转换2μg总RNA cDNA如前所述[20.]。

2.5。定量实时聚合酶链反应(qPCR)

肿瘤坏死因子的表达水平α,il - 1βil - 10,并使用qPCR 18 s rRNA测定。每一个反应,16 ng cDNA混合5μl TaqMan普遍掌握混合(热费希尔科学),0.5μ和2.3 l TaqMan基因表达分析μ10 l nuclease-free水最后一卷μl在384孔板的光学反应。每个样品测量一式三份井和接受40周期放大ViiA7实时PCR系统(热费希尔科学)。Ct值测定与SDS软件2.2(热费希尔科学)。目标基因表达是规范化的内部控制和18 s RNA noninducible看家基因。

2.6。蛋白表达(酶联免疫吸附试验)

肿瘤坏死因子α,il - 1β细胞培养上清液、il - 6和il - 10水平量化使用商用ELISA试剂盒(BD生物科学,富兰克林湖,新泽西,美国)根据制造商的协议。Cytation 3多模读者吸收测量。

2.7。氧率

105THP-1细胞收获从通道3初始有限合伙人((P3), 7天后治疗)在新媒体和重组转移到Transwell插入0.4μ米孔隙大小(美国纽约康宁)。实时O2测量进行了使用OxoDish®OD24盘子放在一个特别提款权阅读器(PreSens、海德堡、德国)21]。与细胞平衡板2 h孵化器(37°C, 5%的股份有限公司2与PBS或有限合伙人(1)刺激μg / ml媒体)。在媒体上之后,氧浓度测量。

2.8。MTT试验

5-dimethylthiazol-2-yl减少(3 - (4)2,5-diphenyl溴化四唑(MTT,σ)紫色甲瓒发现比色测定。100年μl MTT试剂(500μ肝癌和g / 100μl PBS)被添加到105细胞取自P3(96孔板)。2 h后潜伏期,100年μl裂解试剂(100毫升N N-dimethylformamide 20 g SDS, 2.5毫升80%乙酸,盐酸和2.5毫升1 N在ddH 100毫升2O)补充。盘子上分析了微量滴定板读者(BioTek仪器)。

2.9。ATP,乳酸、NAD / NADH和LDH测量

ATP含量测定用CellTiter-Glo®发光细胞生存能力分析(WI Promega,麦迪逊,美国)。乳酸Lactate-Glo™试验(Promega)量化细胞外。NAD / NADH水平测量与NAD / NADH-Glo™试验(Promega)。乳酸脱氢酶(LDH)检测与CytoTox96®非放射性细胞毒性试验(Promega)。相对发光单元(RLU)或吸收检测BioTek Cytation 3多模读者。RLU NAD +和NADH规范化水平测量如果THP-1和提出了任意单元(AU)。所有THP-1细胞用于这种方法是从P3收获的。

2.10。数据分析和统计评估

英飞纳姆甲基化史诗珠与GenomeStudio甲基化芯片阵列数据分析模块v1.8和R bioconductor包“minfi”[22]。细胞因子的差异,NAD / NADH、ATP,乳酸,LDH,麻省理工,氧气化验分析用单向方差分析与图基的多重比较检验 或非参数克鲁斯卡尔-沃利斯和邓恩的多个测试比较 (Prism 6.0 c, GraphPad软件,拉霍亚,CA,美国)。

2.11。伦理批准

这项研究是经当地伦理委员会批准的波恩大学医院(376/16)。所有捐助者提供知情同意。

3所示。结果

3.1。LPS诱导的免疫耐受在人类PBMC体外模型

我们的研究的首要目标是为了证明我们的体外PBMC模型是否适合长期有限合伙人的感应宽容。我们旨在解决之间的联系持续先天免疫反应发生在败血症患者作为观察和特异表达CpG甲基化的调制。

证明18 h(主要LPS刺激适用于获得PBMCs LPS-tolerant表型,在体外细胞因子水平测定LPS-tolerized PBMCs与控制PBMCs(见图1)。PBMCs回应有限合伙人与宽容感应反映肿瘤坏死因子的量化α基因和蛋白质水平。暴露在第二个LPS刺激没有进一步提升肿瘤坏死因子α转录(图2(一个))和细胞因子分泌(图2 (b))相比,细胞治疗主独自LPS刺激( )。il - 1β演示了一个类似的模式作为肿瘤坏死因子mRNA值α较低的响应能力LPS-pretreated PBMCs向第二个有限合伙人接触(不重要)。这个观察是不反映在il - 1β分泌。18 h的初始有限合伙人治疗升高il - 10基因表达和蛋白质的分泌。引发刺激与LPS对3 h了il - 10 mRNA转录到相当水平。

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图2
人类PBMCs先天免疫耐受的诱导。PBMCs (106细胞/毫升)从全血分离( 个人捐助者)和刺激了18 h与有限合伙人10 ng / ml或PBS。细胞因子转录(a)和(b)分泌检测在额外的3 h有限合伙人或PBS (100 ng / ml)。 ; ; ; 。
3.2。有限合伙人预培养引起代谢Pathway-Associated CpG甲基化差的网站

18 h(有限合伙人孵化造成持久的有限合伙人宽容PBMCs证明细胞因子表达分析。因此,这一点的时间也选择CpG甲基化分析。PBMCs健康志愿者捐赠的分裂,刺激与有限合伙人或PBS 18 h,并收获阵列分析。

处理数组数据与Minfi Bioconductor包包括质量评估和校正了年龄,性别和单核苷酸多态性。之后,1033年CpG网站显示显著LPS-induced减少1972 CpG甲基化而网站有限合伙人预处理后显著提高甲基化(diff展出。 或< -13)。明显调制CpG网站(截止hypomethylated或hypermethylated网站:< -2.0 > + 2.0)LPS-pretreated组中,37.63%的改变发生在甲基化CpG网站,6.86% unmethylated CpG网站,58.8%,略微甲基化CpG网站(图3)。


图3
甲基化水平的重大CpG网站。Methylome分析的DNA进行PBMCs来源于健康的人类捐助者( )。

不同甲基化CpG网站相应的病理生理和生理相关通路分析利用KEGG映射。在代谢的积累差异甲基化网站pathway-related基因(表出现1)。1252相关网站,870人差异表达。一个浓缩的甲基化变化具体和统一的基因组区域metabolism-correlated基因没有发生。
顶级KEGG通路 德 P.DE 罗斯福
1 路径:hsa01100 代谢途径 1252年 870年 6日27日 - - - - - -255年 2,01 - - - - - -252年
2 路径:hsa05200 通路在癌症 394年 316年 1、20 - - - - - -97年 93 - - - - - -95年
3 路径:hsa05165 人类乳头瘤病毒感染 318年 244年 79 - - - - - -66年 91 - - - - - -64年
4 路径:hsa04151 PI3K-Akt信号通路 339年 243年 9日24 - - - - - -59 7日,39岁 - - - - - -57
5 路径:hsa04010 MAPK信号通路 255年 197年 5、27 - - - - - -50 3,37 - - - - - -48
6 路径:hsa05166 HTLV-I感染 252年 192年 1日05 - - - - - -49 63 - - - - - -47
7 路径:hsa04360 轴突的指导 174年 151年 2、22 - - - - - -45 1,01 - - - - - -43
8 路径:hsa04144 内吞作用 244年 186年 4,18 - - - - - -45 67 - - - - - -43
9 路径:hsa04015 Rap1信号通路 210年 167年 86 - - - - - -44 61 - - - - - -42
10 路径:hsa04014 Ras信号通路 226年 173年 2、24 - - - - - -43 7、15 - - - - - -42
11 路径:hsa05169 eb病毒感染 197年 156年 3,43 - - - - - -41 9日,97年 - - - - - -42
12 路径:hsa04510 粘着斑 198年 159年 4、35 - - - - - -41 1、16 - - - - - -38
13 路径:hsa05205 蛋白聚糖在癌症 203年 157年 1、11 - - - - - -37 2,74 - - - - - -36
14 路径:hsa04810 调节肌动蛋白细胞骨架 211年 160年 8日,19 - - - - - -37 87 - - - - - -35
15 路径:hsa05202 转录misregulation癌症 181年 141年 7、12 - - - - - -36 1、52 - - - - - -34
16 路径:hsa05203 病毒致癌作用 198年 149年 1、27 - - - - - -35 2,53岁 - - - - - -34
17 路径:hsa05167 卡波济氏肉瘤相关疱疹病毒感染 186年 140年 2,96 - - - - - -35 5日,58 - - - - - -34
18 路径:hsa04022 cGMP-PKG信号通路 162年 132年 1、17 - - - - - -35 2,09年 - - - - - -34
19 路径:hsa05016 亨廷顿氏舞蹈症 186年 140年 65 - - - - - -34 2,79 - - - - - -33
20. 路径:hsa04141 蛋白质在内质网处理 165年 131年 85 - - - - - -34 2,96 - - - - - -33
KEGG途径:代码从京都基因和基因组百科全书; :数组中包含的许多KEGG pathway-related CpG网站;德:数量的差异甲基化CpG网站;P.DE:adjusted differential methylation 价值;罗斯福:错误发现率。
表1
有限合伙人在18 h有限合伙人耐受化(10 ng / ml媒体或PBS控制,106细胞/毫升),methylome分析的DNA来自健康的人类PBMC捐助者( )执行和KEGG途径的结果。
3.3。持续Immunoparalysis LPS-Tolerant THP-1细胞

数组结果强调功能的相关免疫细胞在代谢途径和不同甲基化CpG网站。然而,排除异质性和评估功能相关性的观察,我们继续我们的研究在一个不灭的单核细胞的细胞系。

首先,我们建立了一个THP-1在体外模型诱导长期有限合伙人宽容。我们研究了有限合伙人的维护公差后三个使周期初始内毒素挑战。我们的模型考虑到大多数的细胞在P2和P3新子细胞增生,这可能进行有限合伙人通过表观遗传传输(补充图公差1)。天真THP-1细胞相比,重振immunoparalysed THP-1细胞显著减毒il - 1β和肿瘤坏死因子α信使rna(图4(一)(图)和蛋白质表达式4 (b))在第二个有限合伙人治疗P1, P2, P3。il - 6和il - 10细胞因子mRNA水平,而在另一个内毒素挑战增加通道1 (P1)(不重要,补充图2)。相反,没有相当大的改变的il - 6和il - 10之间观察到治疗组在通道2 (P2)。促炎il - 1的动能β和肿瘤坏死因子α表达了长期有限合伙人宽容在我们在体外模型。

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图4
LPS-tolerized (1μTHP-1单核细胞(10 g / ml)6细胞/毫升)证明持续的细胞因子mRNA和蛋白改变后6 h有限合伙人引发刺激(1μg / ml)相比以前未经治疗的细胞。信使rna转录(a)和蛋白质分泌TNF (b)α和il - 1β在不同时间点测定48 h后预培养后的休息时间0 d(≙通道(P) 1), 2 d (≙P2),重复前5 d (≙P3)有限合伙人曝光。 ; 。
3.4。内毒素耐受细胞代谢的改变

展示一个正在进行的免疫功能紊乱后单核细胞48 h后休息5天有限合伙人的挑战,对细胞代谢的影响进行了评估P3的细胞。首先,耗氧量测量细胞呼吸的是量化的。细胞被刺激与有限合伙人或PBS (0 h时间点,和O2消费持续测量。一个模范测量nontolerized THP-1细胞刺激与PBS或有限合伙人在图给出5(一)。


图5
有限合伙人预处理后Immunotolerant THP-1单核细胞证明改变新陈代谢。细胞与LPS刺激(1μ48 h和g / ml)有限合伙人切除后休息5 d。之后,他们被要求与有限合伙人(1μg / ml)或PBS。(一)演示了一个代表测量LPS-tolerized nontolerized细胞超过20 h。单核细胞的氧率(b, c)不及时治疗或preincubated有限合伙人。集中的数据( )独立测量每4技术复制。MTT试验(b, - - - - - -5)、LDH活性(c, ),乳酸分泌(d, ),和NADH / NAD + (e, )水平检测。 ; , ,和 。

四个治疗组比较,最大耗氧量在nontolerized THP-1细胞没有额外的LPS刺激。细胞接触到新鲜的有限合伙人显著降低耗氧量与幼稚细胞相比,3和LPS刺激后20 h(数字5(b)和5(c))。LPS-pretreated细胞取自P3没有进一步LPS刺激了中间O2吸收后没有达到显著性水准20 h(连续测量(数字5(b)和5(c))。然而,获得耐受性和nontolerized细胞取自P3采取了类似的耗氧量对第二个LPS刺激在0 h。

我们假设这个观察定量合成ATP的变化和NADH或酶参与能量代谢。然而,ATP水平量化内毒素预处理和天真THP-1细胞取自P3透露任何重大差异治疗组( ;图5(d))。

MTT测试反映出细胞的代谢活动,主要依赖NAD (P) H等价物和氧化还原酶的活动减少。结果治疗组表达相对于PBS预防组中获取的值。没有区别LPS-pretreated观察和幼稚细胞(图5(e))。两个小时的LPS刺激略减毒的速度减少幼稚细胞MTT(不重要)和持平LPS-pretreated THP-1 P3。

细胞内LDH使用乳酸和NAD +合成丙酮酸和NADH。在细胞毒性刺激,从细胞LDH释放。在我们的模型中,LDH仍略有增加(1.5倍, ,不显著)LPS-pretreated THP-1细胞相比PBS-pretreated细胞(图5(f))。两个小时的额外的有限合伙人治疗7 d后预处理影响LDH活性在同一温和的方式。

乳酸是一种最终产品的糖酵解与监管葡萄糖体内平衡和能源生产的性质。检查乳酸、NAD +和NADH积累在媒体报道中,我们进行了引发刺激有限合伙人的宽容和nontolerant THP-1细胞24 h。未发现乳酸浓度在媒体上的差异prestimulation 7 d后,和24小时的额外LPS刺激不引起任何有关增加乳酸水平(图5(g))。

符合这一点,细胞内NAD +和NADH率没有改变在宽容和nontolerant THP-1细胞(数字5(h) -5(j))。有限合伙人引发刺激,获得耐受性和non-tolerized细胞,显著提升NAD + / NADH比率,即。NAD的减少+NADH降低整体(图5(j))。

尽管目前的免疫功能障碍在我们的模型中LPS-tolerized THP-1细胞,细胞新陈代谢的选择读数没有透露任何值得注意的改变之间的宽容和nontolerant THP-1单核细胞。

4所示。讨论

单核细胞属于第一道防御入侵的病原体,通过编排炎症和导致脓毒症的结果(23]。单核细胞从败血症的病人可以表现出内毒素宽容,妥协他们的功能和麻痹免疫应答。内毒素耐受和对脓毒症的影响已经被研究了24]。然而,immunoparalysis的相关性,代谢失调,表观遗传修饰在单核细胞分离败血症的病人是一个正在进行的调查的问题。

有限合伙人可以重组炎症反应对降低炎性细胞因子的生产(降低TNFα生产)在随后的有限合伙人的挑战[25]。人类PBMCs孤立的在我们的模型中,我们发现减毒TNFα和il - 1β细胞因子mRNA表达和肿瘤坏死因子α有限合伙人引发刺激后分泌获得耐受性PBMCs。的促炎细胞因子肿瘤坏死因子α和il - 1β被标记为展示内毒素耐受(26,27),而il - 10反映了抗炎细胞反应。由于il - 1的特定属性β处理并通过inflammasome激活(28),减少il - 1β蛋白质的减毒mRNA转录发生暂时延迟。

出现的问题是是否以及如何在这些观察表观遗传机制发挥作用。表观遗传重编程可以建立一种先天免疫记忆对系统性感染或炎症29日]。组蛋白和DNA甲基化沉默肿瘤坏死因子交互α表达式[30.]。我们的结果与观察,单核细胞释放抗炎介质的能力(例如,il - 10)既没有受损,也没有增强在脓毒症和支持的假设单核细胞胞内信号从炎症反应转移向生产的抗炎分子耐受化的特点(6,31日]。

为了联系有限合伙人宽容PBMCs表观遗传修饰,我们执行一个CpG甲基化数组。DNA甲基化是一种稳定的表观遗传标记,可继承的子细胞和DNA可访问性变化,从而推动推广活动。到目前为止,甲基化的变化人类PBMCs体现18 h在有限合伙人挑战没有检查。我们的甲基化数组显示差异甲基化模式发生在代谢pathway-associated基因LPS-tolerized PBMCs。代谢途径重新编程和代谢调节免疫细胞功能的加速感兴趣的在过去的几年中17,32]。白细胞缺陷能量代谢密切相关的初始激活宿主防御和有助于immunoparalysis败血症的患者(15]。由于个人间变异性在LPS刺激以及较低的样本数量,单一网站CpG甲基化修改并未达到显著值。这个观察是反映在Grondman et al .,也记录在单核细胞异型的代谢反应健康受试者呈现immunotolerant [33]。组织、年龄和性别DNA甲基化变化的报告。尽管如此,KEGG路径分析发现微分CpG甲基化率最高的网站相关的代谢途径。

由于DNA甲基化是一个稳定的表观遗传标记,可以通过多个细胞分裂,我们怀疑LPS-induced代谢活动可能会持续的改变。因此,我们旨在建立一个长期的观察细胞培养模型,允许有限合伙人耐受现象包括单核细胞的细胞的代谢活动。自活力PBMCs 36 h后迅速减少,我们建立了一个模型的扩展有限合伙人宽容与反复通过单核细胞的THP-1细胞。首先,我们为我们的模型的可靠性检测内毒素耐受的标准参数,观察TNFα和il - 1β细胞因子抑制LPS后引发刺激还可测量的初始LPS刺激后7天。假设一倍THP-1细胞大约2天内,观察到肿瘤坏死因子的变化α和il - 1β细胞因子水平是不限于父母细胞直接接触兴奋剂但也监控新子细胞扩散。

除了被广泛接受的回应的单核细胞TLR4刺激促炎细胞因子释放、细胞激活有限合伙人(也经历了深刻的代谢的变化34]。激活巨噬细胞和树突细胞的促炎的刺激使他们接受对糖酵解代谢开关(35]。除了纯粹的能量和生物合成的前体的一代,也有越来越多的证据表明,代谢产物控制免疫效应功能(36]。关于我们的细胞因子表达动力学和基于我们的甲基化数组结果,我们推测,有限合伙人THP-1细胞获得耐受性演示与深刻的代谢7 d后开关。

据推测,显著降低了O2吸收后获得耐受性细胞有限合伙人引发刺激指向一个持续的炎性表型与氧化磷酸化率减少能源需求通过糖酵解的报道。然而,我们的数据突出,针对有限合伙人预处理糖酵解的关键酶——代数余子式和分子参与能量转移并没有改变7 d后,而有限合伙人引发刺激导致减少NAD + NADH转换。这些观察结果不一致与我们的假设,产生新的问题。我们知道化验结果强烈依赖于分析选择的时间点。证明朱et al .,单核细胞的新陈代谢和生物能学顺序激活、关闭,并最终解决急性炎症(34]。感兴趣的另一个方面,在未来的项目检查,是主机铁代谢。通过解除对葡萄糖代谢,这种机制可以妥协建立疾病宽容脓毒症(37,38]。

体外模型往往缺乏临床意义由于各种方法的局限性。大多数研究分析短时间间隔LPS刺激后,当尝试PBMCs这几乎是可以避免的。另一方面,永生化细胞系不共享所有生理属性的主要细胞。THP-1细胞,作为人类单核细胞模型,是从一个自发无限增殖monocyte-like细胞系,发达的情况下急性单核细胞的白血病(18]。他们反应弱有限合伙人由于CD14表达水平低(39),这需要不同剂量LPS对LPS响应的差异。因此,我们增加了广泛使用的有限合伙人用量10 ng / ml的PBMC实验1μg / ml THP-1实验(40]。此外,比较THP-1细胞刚孤立PBMCs和单核细胞透露,这些细胞可以释放量在相同的实验条件下(不同的细胞因子41]。因此,临床意义可能更好地与主要从累积出来的实验执行,不灭的,和败血症的病人细胞样本。

5。结论

我们的模型显示,有限合伙人公差的影响反映在细胞因子调控的水平比代谢改变。免疫反应和代谢调节高度集成,重建体内平衡。因此,所选THP-1模型是适当的时候检查终止炎症过程在一个细胞模型定义的实验条件。快照收集以及大规模阵列分析交织在一起的免疫反应,表观遗传修饰,代谢变化,动力学将稳步提供进一步的洞察脓毒症病理生理学。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

没有一个声明。

作者的贡献

交流,阁下,J.L.K., A.K., and L.W. performed the experiments. H.E., S.F.E., S.H.H., A.K., S.S., and L.W. evaluated the data. H.E. and C.K.W. designed the study with support from S.F. and A.H. H.E. and C.K.W. wrote the paper in consultation with S.F. and A.H.

确认

本研究支持的German-Israelic研究基金会(旧金山那里:我- 302 - 422.10 - 2014),波恩大学(S.F.E.:BONFOR o - 117.0050 l:BONFOR 2014-1-22, C.K.W.: 2015-1-24, H.E.: Maria von Linden program), and Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation; C.K.W.: Grant no. 397484323, project no. 426093965).

补充材料

补充图1:THP-1扩散后5天内恢复48 h (LPS刺激。有限合伙人或PBS添加到媒体P0 48 h。在所有治疗组细胞密度确定年底P0(治疗开始后48 h), P1 (96 h治疗后开始),和P2 (144 h治疗后开始)前再悬浮在新媒体不含有限合伙人的密度106细胞/毫升(a) ( , - - - - - -12; )。在每个时间点,统计PBS和LPS处理细胞之间的差异与计算 - - - - - -测试( )。图2:补充LPS-tolerized (1μg / ml) THP-1单核细胞表现出持续的il - 6和il - 10细胞因子mRNA和蛋白改变有限合伙人引发刺激(1μg / ml)相比以前未经治疗的细胞。信使rna转录的il - 6和il - 10测量通道(P) 1和P2 48 h后预培养后的休息时间0 h (P1)和48 h (P2)。 ; 。(补充材料)

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