文摘

背景。细胞凋亡和necroptosis都被认为参与了缺血reperfusion-induced肺损伤。我们旨在比较药效的疗法针对necroptosis和细胞凋亡,并确定是否有一个两者之间的协同效应治疗在降低肺缺血再灌注损伤。方法。四十Sprague-Dawley老鼠被随机分为5组:虚假的(SM)组,缺血再灌注(IR)集团necrostatin-1 +缺血再灌注(NI)集团carbobenzoxy-Val-Ala-Asp-fluoromethylketone +缺血再灌注(子)组,necrostatin-1 + carbobenzoxy-Val-Ala-Asp-fluoromethylketone +缺血再灌注(新西兰)组。左肺门被曝光而不被夹在老鼠从SM组,而老鼠被夹紧进行肺缺血再灌注1小时的左肺门,其次是IR组再灌注3小时。1毫克/公斤necrostatin-1 (Nec-1:特定necroptosis抑制剂)和3毫克/公斤carbobenzoxy-Val-Ala-Asp-fluoromethylketone (z-VAD-fmk:锅半胱天冬酶抑制剂)腹腔内管理缺血前在倪和子组,分别和老鼠收到Nec-1和z-VAD-fmk新西兰组。再灌注后,表情receptor-interacting蛋白1 (RIP1) receptor-interacting蛋白3 (RIP3)和测量caspase-8,流式细胞术分析是用来评估肺组织的细胞死亡模式。此外,炎症标志物水平在支气管肺泡灌洗液和肺水肿。结果。Nec-1和z-VAD-fmk,单独或组合,显著降低形态损伤,炎症标记物,在再灌注后肺组织水肿,cotreatment的z-VAD-fmk Nec-1产生最佳的效果。老鼠Nec-1处理较低水平的炎症标记物在支气管肺泡灌洗液比接收z-VAD-fmk独自一人( )。有趣的是,z-VAD-fmk政府调节RIP1 RIP3表达式在肺组织的子组相比在IR组( )。再灌注显著增加的百分比在肺组织坏死和凋亡细胞单细胞悬液,分别可减少Nec-1和z-VAD-fmk ( )。结论。Nec-1加强锅半胱天冬酶抑制剂来减弱肺缺血再灌注损伤大鼠。我们的数据支持的潜在使用Nec-1肺transplantation-related紊乱。

1。介绍

肺移植是治疗许多终末期肺病的治疗,但早期移植失败引起的缺血再灌注(IR)仍然是一个强大的对早期和晚期肺移植的生存障碍(1,2]。肺功能障碍引起的红外受伤也是一个主要的围手术期并发症事件,如休克、创伤、肺血管再生和心肺旁路。尽管各种药物和技术研究了减少红外受伤,目前没有有效的治疗是可以完全消除,因为底层机制仍不完全清楚。

过度生产活性氧(ROS)在红外可能损害线粒体膜和刺激细胞色素c的释放,导致内在的起始细胞凋亡通路(3,4]。抑制细胞凋亡可以减少肺损伤后红外光谱(5,6]。此外,坏死建议也参与IR-induced肺损伤(7),但它不是视为一种有效的治疗目标以前,由于坏死是传统上被定义为一种监管的和意外的细胞死亡。然而,最近的研究定义一种特殊类型的编程坏死,称为necroptosis,可以由多个通路(8]。Necroptosis有力地促进炎症介导炎症细胞因子的分泌和诱导释放有关的分子模式(抑制),参与许多人类疾病(8,9]。Necrostatin-1 (Nec-1),一个特定necroptosis抑制剂,减少肺部炎症和缓解十八烯段急性呼吸窘迫综合征肺损伤(10),也提高了生存在新生儿败血症小鼠11]。值得注意的是,Nec-1也已经发现细胞死亡的减弱程度和减轻肺损伤在实验性肺移植12]。然而,药效的疗法针对necroptosis和凋亡疗法相比,是否如果之间有协同效应这两个治疗在降低肺红外伤还未确定。

在这里,一个原位温暖鼠肺IR模型成立,和肺组织形态学变化。我们使用流式细胞术分析确认receptor-interacting蛋白质的细胞死亡模式和发现表达式(撕裂)和肺组织中caspase-8证据necroptosis的责任人和细胞凋亡。此外,炎症细胞因子水平在支气管肺泡灌洗(BAL)流体和wet-dry重量(W / D)比测量表明肺部炎症和水肿,分别。

2。材料和方法

我们的实验协议制度动物保健和使用委员会批准温州医科大学(伦理代码:FHY2014002)和随后的美国国立卫生研究院的指导护理和使用实验动物。四十个成年男性Sprague-Dawley (SD)大鼠体重从300年到350 g是购买温州医科大学实验动物中心的授权和维护2周,温控动物房间12小时/ 12小时黑暗周期。免费获取标准饮食的老鼠和水。

2.1。组分配

老鼠被随机分为5组( )如下:(1)虚假的集团(SM):老鼠接受开胸,左肺门被隔离而不被夹紧(2)缺血再灌注组(IR组):老鼠接受开胸,左肺门受到小时缺血,其次是3小时再灌注(3)倪Nec-1 +缺血再灌注组(组):腹腔内管理1毫克/公斤Nec-1肺缺血(前1小时了13),剩下的程序与IR组相同(4)carbobenzoxy-Val-Ala-Asp-fluoromethylketone +缺血再灌注组(子组):3毫克/公斤carbobenzoxy-Val-Ala-Asp-fluoromethylketone (z-VAD-fmk)管理腹腔内缺血前1小时,剩下的程序与IR组相同(5)新西兰Nec-1 + z-VAD-fmk +缺血再灌注组(组):1毫克/公斤的组合Nec-1和3毫克/公斤z-VAD-fmk肺缺血前给予腹腔内1小时开始

实验结束时协议,老鼠被麻醉过量安乐死。开胸中线是立即执行,右主支气管结扎收集支气管肺泡灌洗(BAL)流体从左肺。之后,左肺上叶的肺组织形态学检查和得到湿/干重比(W / D)计算,左侧中部叶的肺组织被用来确定蛋白质的表达receptor-interacting蛋白1 (RIP1) receptor-interacting蛋白3 (RIP3)和caspase-8,左肺下叶组织收集的单细胞悬液制备和流式细胞术分析。

2.2。肺红外过程

的大鼠模型肺原位热红外使用前面描述的方法[成立14]。简单地说,老鼠麻醉与腹腔内政府的克他命(50毫克/公斤)和安定(5毫克/公斤)15),然后14号angiocatheter是通过颈部中线切口插入气管。老鼠被连接到一个专门的啮齿动物呼吸机(hx - 300, Taimeng Inc .,成都,中国)和通风的潮汐卷8毫升/公斤,呼吸速率的60个/分钟,我/ E比值1:2,启发氧气分数为0.6。进行左胸第五肋间隙,左肺门被曝光。之后,50个单位的肝素通过阴茎静脉注射和允许循环5分钟。noncrushing夹然后将封闭左肺门60分钟,而潮汐成交量降低了2/3的缺血期间的原始水平。缺血后1小时,夹了,左肺被允许reventilate与原来的潮汐卷长达3个小时。胸部是缺血和再灌注期间暂时关闭。直肠温度维持在37°C的帮助下变暖灯,温暖和0.5毫升的生理盐水是皮下注射每小时保持身体体积。

2.3。拜尔港液体收集器

左肺灌洗使用30毫升/公斤无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS) 3次,然后落下帷幕流体是收获和离心机3500克10分钟。落下帷幕的液体被立即冻结,然后储存在-70°C进行进一步检测。

2.4。组织学评估和急性肺损伤评分

肺样本固定在10%福尔马林和嵌入在石蜡,分段(4 -μ米厚的),与苏木精和伊红染色。彩色部分是由病理学家检查,取得了失明组分配使用建立急性肺损伤评分系统(16]。

2.5。电子显微镜检查

肺片( )使用2.5%戊二醛固定在PBS (pH值7.4,0.1米)24小时在4°C。然后,肺片后缀在缓冲2小时四氧化二钠为2%,在一系列分级乙醇脱水,嵌入在环氧树脂。超薄部分都沾染了醋酸双氧铀及柠檬酸铅和检查使用透射电子显微镜(H600、日立、日本)。

2.6。肺组织含水量

肺W / D比率为肺水肿的作为指标。安乐死后,部分肺组织的左肺上叶重获得湿重,然后干60°C 48小时来确定干重。W / D比率被定义为湿重/干重。

2.7。流式细胞术分析单细胞悬浮的肺部组织

单细胞悬浮体肺组织的准备,和流式细胞术使用膜联蛋白V -荧光素isothiocyante (FITC) / propidium碘(PI)工具被用来检测肺组织中的细胞死亡模式。详细,点左下角(膜联蛋白V - /π)象限表示可行的细胞,在左上角(PI膜联蛋白V + / +)象限坏死细胞,和右下角(膜联蛋白V + /π)象限是细胞发生凋亡早期,而那些在右上角(膜联蛋白V - / PI +)象限机械受伤细胞。

2.8。蛋白质的表达RIP1、RIP3 Caspase-8

总蛋白提取肺匀浆,免疫印迹分析评估表达式RIP1, RIP3, caspase-8。简而言之,目标蛋白(40毫克)dodecylsulfate-polyacrylamide钠凝胶电泳在10%,转移到聚乙二烯二氟化物膜。三羟甲基氨基甲烷缓冲液的膜被盐水与渐变(TBST;含有5%脱脂牛奶,10毫米三,150毫米氯化钠,Tween-20 0.05%) 1小时在室温下然后孵化第一抗体RIP1 (1: 200), RIP3 (1: 200), caspase-8(1: 200),和glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH;1:5000)在一夜之间在4°C,分别。之后,膜与二次孵化抗体anti-rabbit免疫球蛋白g(1: 2000)在TBST 1小时在室温下的解决方案。墨迹是使用增强化学发光系统,然后扫描。微执行ImageLab软件,和蛋白质乐队量化作为GAPDH比例控制。

2.9。炎症标记物和蛋白质浓度的液体

炎症标记肿瘤坏死因子的水平α(肿瘤坏死因子-α),interleukin-1β(il - 1β)、白细胞介素- 6 (il - 6)和高机动组框1 (HMGB1) BAL液测定的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法根据生产商之一的工具。蛋白质浓度测定用bicinchoninic酸(BCA)蛋白质化验设备。

2.10。统计分析

数据用SPSS 16.0版软件进行了分析。连续和正态分布的数据被表示为 ,和单向方差分析(方差分析)其次是事后Bonferroni方法用于数据组间比较。一个值< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。肺组织形态学变化

正常肺组织的微观结构和超微结构在SM。IR组肺组织严重受损,证明了明显的肺泡壁增厚,间质水肿、中性粒细胞浸润,苏木精和伊红染色。电子显微镜检查显示,线粒体肿胀,嵴紊乱,并胞质层状的身体,部分微绒毛,破坏细胞膜的完整性和II型肺泡上皮细胞从IR组。在肺组织形态学损害明显减轻镍和子组,但新西兰组的老鼠显示进步最快的形态结构与红外集团(数字1(一)- - - - - -1 (e)和2)。

肺损伤分数平行的组织学检查的结果,和IR组的肺损伤评分明显高于SM的集团,而镍或子组的肺损伤评分显著低于IR组( )。正如预期的那样,新西兰组的大鼠急性肺损伤最低分数在这些组( ,图1 (f))。

3.2。肺组织含水量

如图3W / D比率的IR组肺组织明显高于SM组( ),暗示红外后肺水肿。与组织学的研究结果一致,肺W / D比率在倪和子组低于IR组,但高于新西兰集团( )。

3.3。单细胞悬浮的细胞死亡的肺部组织

红外显著诱导坏死和凋亡细胞死亡在肺组织单细胞悬架,由百分比的增加证明膜联蛋白V + /π-和膜联蛋白V + / PI +细胞( )。如图4,膜联蛋白V + / PI +细胞的百分比在NI组和膜联蛋白V + /π-细胞子组明显低于IR组( ),和联合治疗Nec-1 z-VAD-fmk显著降低坏死和凋亡细胞的比例( )。此外,老鼠接受z-VAD-fmk有更大比例的膜联蛋白V + / PI +细胞单细胞悬浮的肺组织与处理Nec-1 ( )。

3.4。RIP1、RIP3 Caspase-8表达式的肺部组织

如图5红外调节RIP1 RIP3,肺组织和caspase-8表达式( )。RIP1和RIP3的表情,但不是caspase-8,是减少Nec-1治疗,而z-VAD-fmk政府下调caspase-8表达式,与此同时,增加RIP1和RIP3表情在肺组织应对红外损伤( )。联合Nec-1 z-VAD-fmk总局降低这三种蛋白的表达与IR组( )。

3.5。炎症标记物,HMGB1蛋白浓度的液体

图6演示的炎症标记物和蛋白质水平的液体。与SM组相比,老鼠接受了肺红外受伤有更高水平的炎症标记物和蛋白质的液体( ),可部分抑制的治疗Nec-1或独自z-VAD-fmk ( ),和两个代理的老鼠接受组合治疗炎症标记物和蛋白质含量最低的流体在这些组( )。此外,高水平的HMGB1 BAL流体IR组减少了治疗Nec-1但不是z-VAD-fmk ( )。重要的是,炎症标记物的水平和蛋白质减少NI组相比,子组( ),和HMGB1水平BAL流体倪和新西兰组没有差异 )。

4所示。讨论

本研究的主要发现是,(1)necroptosis,一种新近发现的细胞死亡类型,参与IR-induced肺损伤;(2)锅半胱天冬酶抑制剂治疗z-VAD-fmk缓解肺红外受伤,但同时可能促进RIP-mediated necroptosis;和(3)特定necroptosis抑制剂Nec-1更有效地衰减炎症反应,这将加强z-VAD-fmk减少IR-induced在大鼠肺损伤。

复氧之前缺血性组织导致剧毒ROS通过几个关键机制的形成,通常包括激活烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶和黄嘌呤氧化酶和线粒体功能障碍17]。过度产生的活性氧会损害各种蜂窝组件,核酸DNA或RNA,蛋白质中的氨基酸,脂肪在细胞膜脂质尤其面临风险。随后,活性氧导致细胞死亡的多个模式和组织损伤4,18]。流式细胞仪使用膜联蛋白V和PI染色提供了一个快速、方便的检测细胞凋亡和坏死,细胞死亡的两种经典模式19]。π不是cell-permeable荧光染料,它专门结合核酸染色细胞核死细胞的质膜中断。同时,膜联蛋白V是一个calcium-dependent phospholipid-binding磷脂酰丝氨酸蛋白具有高亲和力,它可以绑定到外部化凋亡细胞的磷脂酰丝氨酸。因此,fluorescein-labeled膜联蛋白V-positive(膜联蛋白V +π-)细胞可能是公认的凋亡,而膜联蛋白V和πdouble-positive染色(膜联蛋白V +π+)表明坏死。在这里,我们发现红外显著诱导凋亡和坏死细胞死亡的肺部组织。Caspase-dependent凋亡被认为是一个经典的贡献者IR-induced肺损伤,和凋亡疗法的有效性已经被证明在先前的研究5,6,20.,21]。在这项研究中,z-VAD-fmk,一锅半胱天冬酶抑制剂,显著减少凋亡细胞死亡和肺组织病理严重程度和减少炎症标记物和蛋白质水平BAL流体。综上所述,这些研究结果再次证明细胞凋亡参与IR-induced肺损伤。

Necroptosis是一种特殊的程序性细胞死亡模式,提出了近年来,它被公认为是由激酶RIP1和RIP38,22,23]。与坏死Necroptosis股票类似的形态特性,积累证据在调节各种病理生理的事件凸显了它的重要性(12,24- - - - - -29日]。混合血统激酶域蛋白(MLKL)被确定为一个关键组件的下游RIP3执行RIP1-mediated necroptosis,和MLKL三聚和易位促进渠道形成的等离子体膜抑制释放(21,30.,31日]。因此,necroptosis通常表现为细胞肿胀和破裂,和细胞膜完整性的丧失会促进炎症通过抑制的释放到细胞外环境中(22,32]。Nec-1,特定的小分子能够抑制RIP1激酶活性,阻断下游坏死事件的进展(33]。这种小分子的功效已经证明在减少ROS生成,调节炎症通路,减少坏死细胞死亡在几个型号的红外和器官移植24,27,28,34,35]。

这里,IR引起肺组织损害和坏死细胞死亡和增加撕裂的表达式,可显著减毒Nec-1治疗。此外,Nec-1政府还降低了蛋白质泄漏表明细胞膜受损和炎症介质的形成。HMGB1,公认necroptosis标记(36)在球后流体红外显著增加,可以减少Nec-1但不是z-VAD-fmk治疗。这些数据支持necroptosis肺红外受伤的贡献,这是符合Kanou T et al。结果,他证明了Nec-1政府捐献者和接受者可以显著抑制坏死细胞死亡和在大鼠肺移植后移植物的改善功能12]。在目前的研究中,Nec-1和z-VAD-fmk共享类似的效果在减少肺形态异常和IR引起的水肿,但比v-ZAD-fmk Nec-1政府更有效防止炎症和肺红外实验破坏细胞膜。

我们目前的研究表明,z-VAD-fmk减少凋亡细胞死亡和表达下调了caspase-8表达式,但z-VAD-fmk促进表达式RIP1 RIP3和矛盾的肺组织坏死细胞死亡增加对红外与Nec-1对待。机械,激活caspase-8抑制necroptosis RIP1乳沟,但当caspase-8基因耗尽或抑制,RIP1与RIP3和MLKL死亡受体激活形成necrosome复杂(8,31日,32]。因此,还存在使用抑制剂或基因消融caspase-8已经证明切换从细胞凋亡细胞命运necroptosis [31日,37]。我们的数据表明,Nec-1显著减少的不利影响锅半胱天冬酶抑制剂在促进坏死细胞死亡和共享的协同z-VAD-fmk减少肺红外受伤。

我们的研究有一定的临床意义,抑制necroptosis,添加到锅半胱天冬酶抑制剂,似乎是一个更有前途的策略防止红外肺损伤在未来临床设置。还需要进一步的研究来探索的详细机制或潜在通路在动物研究或复制我们的发现在人类受试者代理是临床上可用的。还有其他应该解决的局限性。首先,由于缺乏可靠的phospho-MLKL抗体,我们未能跟踪下游通路RIP1 RIP3,和未来的研究是必要的,当商业产生抗体。其次,它将会更有说服力,如果体外数据提供了支持这种动物研究的结果。最后,一剂的保护作用Nec-1测试在我们的研究中,和剂量反应数据需要确定“理想”剂量。

5。结论

Necroptosis有助于IR-induced肺损伤,抑制与Nec-1 necroptosis加强锅半胱天冬酶抑制剂减弱肺红外受伤的老鼠。我们的数据支持承诺在肺中使用Nec-1 transplantation-related紊乱。

数据可用性

可以按照客户要求所有的数据都包含在本研究通过联系与通讯作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项研究是由温州基础研究项目(没有。Y20150234 Y20180123)和温州医科大学。