丝氨酸缺乏通过微生物糖诱导的老化小鼠通过微生物液 - 肠脑轴加剧炎症和氧化应激

摘要

炎症和氧化应激在衰老过程和年龄相关疾病中起着关键作用。由于丝氨酸可用性在支持抗氧化和抗炎防御系统中发挥重要作用，我们探讨了丝氨酸缺乏是否会影响d -半乳糖诱导的衰老小鼠的炎症和氧化状态。雄性小鼠被随机分为四组:基础饲粮组、丝氨酸和甘氨酸缺乏(SGD)饲粮组、注射d -半乳糖组、注射d -半乳糖组、注射d -半乳糖组。结果表明，d -半乳糖导致氧化和炎症反应，而单独缺乏丝氨酸没有这种作用。然而，丝氨酸缺乏显著加剧了d -半乳糖处理小鼠的氧化应激和炎症。d -半乳糖注射液对粪便菌群组成有影响，表现为菌群多样性降低，菌群比例降低厚壁菌门/伯啉，以及减少比例Clostridium xiva．此外，丝氨酸缺乏加剧了这些变化。此外，丝氨酸缺乏联合d -半乳糖注射显著降低粪便丁酸含量和短链脂肪酸转运体基因表达(SLC16A3.和SLC16A7）和受体（GPR109A)在大脑中。最后，丝氨酸缺乏加剧了磷酸化AMPK表达的减少和磷酸化NF表达的增加κB p65, d -半乳糖注射所致。总之，我们的结果表明，丝氨酸缺乏加剧了d -半乳糖诱导的衰老小鼠的炎症和氧化应激。其机制可能部分归因于丝氨酸缺乏对肠道-脑轴的影响。

1.介绍

老年人口的人口在增加全球范围内迅速和老化被认为是作为对与年龄有关的疾病发展的主要因素。因此，揭示了参与与年龄有关的疾病的机制是非常重要的。自由基理论是由研究人员接受的机制之一，因为增加活性氧在大脑中积累，他们的年龄有关的疾病的过程中，攻击多种生物分子[1］.此外，已被认为是有助于年龄相关疾病的发病机制，并且通常被称为“炎性”的病症[2］.最近，增加证据表明，微生物群组合物的变化已经与老化大脑中的氧化和炎症过程有关，因为脑和肠道微生物肿瘤之间存在双向通信，称为微生物肠血管轴，这使得肠道微生物与大脑沟通[3.那4.］.然而，仍然需要研究来阐明微生物-肠道-大脑轴在这些过程中如何工作。

通常，通过调节基因和蛋白质表达，认为饮食在脑老化中起重要作用[5.］.最近的研究表明肠道菌群也影响与年龄相关的发病机制，饮食引起的变化[6.］.丝氨酸是一种营养不良的氨基酸，但它是合成谷胱甘肽的主要基材。最近的研究表明，用丝氨酸的膳食补充剂在某些小鼠模型中表现出强烈的抗炎和抗氧化能力[7.-10］.此外，丝氨酸施加在微生物群的组合物的有益效果和在小鼠葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎模型缓解炎症反应[11］.重要的是，来自含有丝氨酸和甘氨酸缺乏饮食的水坝的后代小鼠易受氧化应激的影响[12］.因此，我们进行本研究，探讨丝氨酸缺乏是否作用于大脑中的慢性d半乳糖处理，这也有类似的特性如天然老化啮齿动物确实诱发的老化小鼠模型的炎症和氧化状态。此外，微生物肠脑轴是否以及如何参与这些影响还探讨。

2。材料和方法

2.1。动物和实验设计

92名男性C57BL / 6J小鼠在9周龄，购自Slac实验室动物中央（长沙）。将小鼠在标准条件下保持在塑料笼中，并且可以自由进入饲料和水。在2周的适应后，将所有动物随机分配到4组（ ）：对照组，给予基础日粮并注射生理盐水；SGD组，小鼠饲喂丝氨酸和甘氨酸缺乏（SGD）饲料并注射生理盐水；D-半乳糖组，给予基础日粮，注射D-半乳糖；而D-SGD组，小鼠喂食缺乏丝氨酸和甘氨酸的饮食，并注射D-半乳糖。小鼠皮下注射1.2%葡萄糖 g/kg体重/天D-半乳糖（D-半乳糖溶液，0.15 g/mL）。基础饮食和缺乏丝氨酸和甘氨酸的饮食从研究饮食中购买（美国新泽西州新不伦瑞克）。实验持续了两个月。实验方案由亚热带农业研究所方案管理和审查委员会批准，小鼠按照亚热带农业研究所（中国长沙）的动物护理指南进行治疗。实验结束时，收集新鲜粪便以分析微生物群组成和短链脂肪酸（SCFA）浓度。处死小鼠后，采集血样，分离血清，并在-20°C下保存，直至分析。同时收集大脑并立即在液氮中冷冻，并在-80°C下储存，直至分析。

2.2. 生化分析

浓度晚期糖化末端产物（年龄），丙二醛（MDA），肿瘤坏死因子（TNF-α），白细胞介素1β（IL-1β)、IL-6，超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)活性及谷胱甘肽含量，采用市售试剂盒(江苏宇通生物科技股份有限公司美棉)，按厂家说明书吸收测定。

2.3. qRT-PCR

使用Trizol Reagents（Invitrogen，Shanghai，China）从全脑组织中分离出总RNA。根据制造商的说明，使用cDNA逆转录试剂盒（Takara，大连）的CDNA逆转录试剂盒（Takara，大连）逆转录，RNA逆转录。使用Sybr绿色混合物（Takara）进行RT-QPCR，如前所述[13］.用于扩增mRNA的引物在补充表中列出1．

2.4。Microbiota profile

如前所述，使用QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen)从粪便样本中提取DNA [14］.细菌16 s rRNA基因序列(V3-V4地区)被放大,然后,PCR进行总量的50毫升的12.5毫升Phusion高保真PCR反应混合液(新英格兰生物学实验室Inc .,贝弗利,妈,美国),每个引物1毫升,50 ng模板DNA, PCR-grade水。将纯化的400-450 bp的PCR产物用Illumina HiSeq 2500平台(Illumina Inc.， San Diego, CA, usa)进行MiSeq Illumina测序。接下来，将获得的对端读取进行合并，然后根据每个样本的独特条形码分配到每个样本。根据QIIME质量控制流程，基于97%的序列相似性，使用USEARCH将高质量的干净标签聚类为操作分类单元(OTUs)。采用RDP算法使用Greengenes数据库对具有代表性的otu进行进一步分析。

2．5．短链脂肪酸浓度的测定

在涡旋混合器中间歇地将新鲜的粪便颗粒与去离子冰冷的水混合2分钟。在冰上保持20分钟后，将样品在4800g在4℃下以4800g离心20分钟。收集上清液并通过注射到基像系统上分析，如前所述[15］.

2.6. 蛋白质印迹分析

如前所述，从脑样本中提取的总蛋白用于蛋白质印迹测定[16］.简单地说,20μg蛋白通过SDS-PAGE分离，然后印迹PVDF膜。用脱脂牛奶阻断后，用抗AMPK、磷酸化AMPK、NF的一抗孵育膜κB p65和NF磷酸化κB p65 (Cell Signaling, Danvers, MA, USA)在4°C下过夜。然后，与二抗at孵育后 ℃持续1小时，使用EZ-ECL（生物工业，Cromwell，CT，USA）检测膜。

2.7。统计分析

使用进行统计分析 -测试或单向ANOVA，数据统计软件SPSS 18.0。 被认为是统计学意义的。所有测量数据都表示为 (SEM)。

结果

3．1.丝氨酸和甘氨酸缺乏加重了d -半乳糖处理小鼠AGEs和MDA的积累

如表所示1，对照组和SGD组的小鼠之间的血清和脑中的血清和MDA含量中的年龄含量没有显着差异。然而，D-GAL组血清和MDA含量的年龄含量明显高于对照组中的血清和大脑的含量显着高。此外，D-SGD组的小鼠具有最高的年龄和MDA的含量，其显着高于其他三组小鼠。

3.2. 丝氨酸和甘氨酸缺乏加剧D-半乳糖治疗小鼠的炎症和氧化应激

如表所示2，tnf-没有显着差异α，IL-1β，观察对照组和SGD组小鼠血清中IL-6含量。而D-gal组的炎性细胞因子含量明显高于对照组。而且，D-SGD组小鼠的炎性细胞因子浓度明显高于其他三组小鼠。

如表所示3.在SOD，CAT，谷胱甘肽过氧化物酶，和对照组的小鼠和SGD组之间GSH含量的血清活动中没有观察到差异显著。然而，这些抗氧化酶和GSH含量的活动比对照组中的d-gal的组中显著降低。另外，d-SGD组中的小鼠具有抗氧化酶和下GSH含量高于其他三组的显著较低的活性。

如图所示1，丝氨酸和甘氨酸缺乏不影响mRNA的表达肿瘤坏死因子-α那IL-1β那il - 6那猫那Sod1那Sod2， 和GPX1在没有d -半乳糖治疗的老鼠的大脑中而在d -半乳糖处理下肿瘤坏死因子-α那IL-1β， 和il - 6显著升高，而猫那Sod1那Sod2， 和GPX1与基础饲粮相比，SGD饲粮显著降低了小鼠的肝细胞凋亡。

３．３．丝氨酸和甘氨酸缺乏加剧了d -半乳糖处理小鼠的菌群结构变化和SCFA水平下降

如表所示4.，其中α-多样性，各组间Simpson指数无显著差异。但与对照组相比，D-gal和SGD组的Shannon H和观察种指数显著降低。这两个α与D-gal组和SGD组相比，D-SGD组-多样性指数进一步降低。

此外，我们将不同的分类水平与群体中不同的分类水平进行了比较了不同的社区概况。在门平均值，结果表明比率厚壁菌门/伯啉没有受到丝氨酸和甘氨酸缺乏的显着影响（图2（a）)．而在d -半乳糖处理下厚壁菌门/伯啉与基础饲粮相比，SGD饲粮显著降低了小鼠的肝细胞凋亡。在属水平上，d -半乳糖注射液显著降低了褐飞虱的比例Clostridium xiva（数字2（b）)．此外，丝氨酸和甘氨酸缺乏加剧了比例的比例Clostridium xiva源于d半乳糖注射。

然后，我们在新鲜粪便决定SCFA的水平。如图所示2（c），各治疗组间乙酸、丙酸水平无显著差异。然而，虽然丝氨酸和甘氨酸缺乏或d -半乳糖注射均未改变丁酸水平，但SGD饲粮联合d -半乳糖注射可显著降低丁酸水平。检测脑内SCFA转运体和受体的mRNA表达。结果表明SLC16A3.那SLC16A7， 和GPR109A与其他三个治疗组相比，D-SGD组显著降低(图2（d）)．

3．4．丝氨酸和甘氨酸缺乏抑制AMPK-NFκ乙信号通路在d半乳糖处理的小鼠

如图所示3.， pAMPK和pNF蛋白表达无显著差异κ对照组和SGD组之间的B p65。而pAMPK蛋白表达量显著降低，而pNF蛋白表达量显著降低κ与对照组相比，D-gal组B p65明显升高。而且，与D-gal组相比，D-SGD组中这两种磷酸化蛋白的表达变化更为显著。

4.讨论

慢性D-半乳糖暴露是探索与年龄相关疾病机制的共同模型。在该模型中，年龄的形成被认为是与年龄相关疾病的开始的触发[17］.在本研究中，我们检测到d -半乳糖处理小鼠循环中AGE含量增加，提示衰老模型建立成功，小鼠处于发生年龄相关性疾病的高风险状态。由于d -半乳糖代谢异常导致活性氧(ROS)的过量产生，累积的AGEs通常与氧化应激和炎症有关[18那19］.ROS与脂质反应，以产生更稳定的产品，如丙二醛（MDA），进一步损害脑中的核酸和蛋白质，导致炎症衰老[20.］.在本研究中，我们发现d -半乳糖慢性治疗后，小鼠血清和脑中MDA含量升高，血清中炎性细胞因子含量升高，抗氧化酶活性降低。此外，大脑中编码炎症因子的基因增加，而编码抗氧化酶的基因减少。这些结果进一步证实了d -半乳糖暴露引起的氧化和炎症反应，与之前的结果一致[17那21］.丝氨酸是合成GSH和NADPH的主要底物[22那23]，这表明它的有效性起着支撑的抗氧化系统的关键作用。丝氨酸缺乏先前证明加剧氧化应激12］.根据本报告，我们的结果表明，丝氨酸缺乏也会加重衰老小鼠大脑中的氧化和炎症反应。我们的结果表明，丝氨酸的可用性对老年人可能是重要的，尽管额外补充丝氨酸是否有助于预防年龄相关疾病仍有待探索。

一般来说，在老年人中被证明，微生物群的主要种类在老年人中保持不变，除了有减少的微生物群多样性[3.］.我们发现，用D-半乳糖处理的小鼠中，Shannon H和观察到的物种显着降低，表明肠道微生物的丰富性降低了[24］.此外，我们观察到的一个显著下降厚壁菌门来伯啉比率，被认为是老年人最显着的变化[25］.令人惊讶的是,α- 微生物群的大学和厚壁菌门来伯啉当喂食缺乏丝氨酸和甘氨酸的食物时，这一比例进一步降低。这些结果表明，丝氨酸缺乏影响老年个体的微生物群组成。

最近，增加证据表明，微生物群可以通过微生物液 - 肠道轴来调节脑功能，使微生物能够与大脑连通[26］.我们发现…的比例下降了Clostridium xiva在与d半乳糖处理的小鼠属水平，其比例时，小鼠饲喂丝氨酸和甘氨酸缺乏饮食进一步降低。Clostridium xiva是丁酸的生产商之一[27］.据此，我们测定了小鼠粪便中SCFAs的含量，发现丁酸在小鼠体内有所下降。SCFAs是一堆微生物代谢物，可以调节微生物和大脑之间的交流[28］.他们可以到达大脑，因为它们能够根据细胞培养模型的结果[穿越血脑屏障29］.与粪便中丁酸的含量下降结合，我们还发现，用D-半乳糖和丝氨酸和甘氨酸缺乏饮食治疗的小鼠中，其转运蛋白和受体的表达降低。这些结果表明，丝氨酸缺乏可以通过降低丁酸的产生来减少肠道微生物群和大脑之间的通信。SCFA可以进入线粒体柠檬酸循环，然后产生能量[30.］.由于AMPK是关键能量传感器，AMPK-NFκB信号通路可能介导了SCFA的作用，因为SCFA可以激活AMPK，抑制NFκB激活(31］.我们的研究结果表明，D-半乳糖暴露抑制了AMPK磷酸化，同时增加了NF-κ大脑中的B磷酸化。此外，这些变化在同时喂食d -半乳糖和缺乏丝氨酸和甘氨酸饮食的小鼠中更为显著。这些结果提示AMPK-NFκ信号传导途径也能起到调节其被丝氨酸不足而恶化的氧化和炎症反应的作用。

总之，我们的研究结果表明，慢性D-半乳糖处理诱导的老化小鼠模型中的血清缺陷恶化和炎症状态恶化。此外，我们的结果表明，微生物群和脑通过微生物疱疹肠轴之间的相互作用可能会介导上述变化。具体而言，丝氨酸缺乏减少了肠道丁酸生产商Clostridium xiva并导致丁酸产量下降。随后，丁酸的减少影响了促进NF的AMPK磷酸化κB激活和下游目标的积累。

数据可用性

支持本研究结果的数据包括在文章中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

致谢

这项工作得到了湖南省“湖湘青年人才计划”项目（2019RS2046）和中国科学院青年创新促进会的支持。我们要感谢大连成三畜牧有限公司在测定SCFA浓度方面提供的帮助。

补充材料

补充表1:本实验RT-qPCR引物序列。补充表2:对照饲粮和试验中使用的丝氨酸和甘氨酸缺乏(SGD)饲粮组成。这两种饮食均购自Research diet (New Brunswick, NJ, USA)。（补充材料）

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