钙卫蛋白作为闭塞性细支气管炎患者中性粒细胞性炎症的新敏感标志物

摘要

介绍．闭塞性细支气管炎(BO)是一种慢性疾病，持续炎症导致小气道阻塞和闭塞。本研究的目的是评价钙卫蛋白作为诱导痰中的炎症标志物的价值。方法．对28例BO患者和18例健康对照者进行检查。肺功能测定采用肺活量、体积描记术和肺清除率指数(LCI)。获得诱导的痰液，进行细胞计数，并使用细胞计数珠阵列(CBA)测定细胞因子。用市售夹心酶联免疫吸附测定痰液和血清中钙卫蛋白含量。结果．肺量测定法参数包括用力肺活量(FVC),在1秒用力呼气量(FEV1)和最大呼气流量25%肺活量(MEF25)博患者明显低于健康对照组,而储备容积(RV)、房车肺活量比(RV / TLC)和LCI显著增加。痰中钙卫蛋白、中性粒细胞和IL-8水平显著升高。钙保护素水平与IL-8和其他生物标志物、中性粒细胞FEV1和MEF25密切相关。在血清中，BO患者的钙卫蛋白明显低于对照组。结论．BO患者肺功能严重受损。钙卫蛋白在BO患者的痰液中显著升高，反映持续的中性粒细胞性炎症。

1.介绍

闭塞性细支气管炎（BO）是一种罕见的慢性阻塞性肺病。BO的早期描述仅限于尸检发现的病例报告。通常，BO开始于细支气管上皮损伤，随后发生炎症反应，进而发展为气道纤维化和潜在的管腔闭塞[1，2］.最初的严重损伤被认为影响下气道，可能由病原体、感染后BO (PIBO)、肺移植(LT)或骨髓移植(BMT)或BO综合征(BOS)引起[3.- - - - - -5］.这种初始和持续炎症的解决失败可能是BO疾病过程的重要组成部分。炎症细胞和免疫细胞大量涌入。再加上小气道肉芽组织的增生，导致细支气管阻塞，形成气陷和恶性通货膨胀[1，2，6］.

BO在临床上被定义为由肺功能测量确定的持续性气流阻塞和空气滞留的小气道疾病。一般来说，这种气流阻塞对支气管扩张剂无反应。大多数研究使用肺活量测定法来测量BO患者的肺功能，但目前的指南强调需要新的敏感的肺功能指标来检测早期小气道损伤。在过去的十年中，肺清除率指数(LCI)在监测不同肺部疾病小气道疾病时多次被证明优于1秒用力呼气量(FEV1)。LCI是一种可行和敏感的工具，用于检测儿童和成人慢性肺部疾病中的小气道损伤[7- - - - - -10］.据我们所知，只有少数研究将该技术用于BO患者[11，12］.

先前的研究表明，BO主要是一种小细支气管的中性粒细胞疾病，其特征是促炎细胞因子水平升高[5］.BO患者的痰液分析显示中性粒细胞炎症一致，而炎性细胞因子如IL-1的水平β、IL-6和IL-8具有更大的变异性[13]由于进展模式尚未确定，并且由于炎症模式的改变中主要是持续性中性粒细胞炎症，广泛存在于细胞质中的钙卫蛋白可能是BO的有价值的替代生物标记物。

钙卫蛋白是一种36kda的锌结合蛋白，广泛存在于人体、中性粒细胞和巨噬细胞的细胞质中。钙卫蛋白由活化的中性粒细胞释放，导致在各种液体中高浓度，如血浆、血清、脊髓液、滑膜液、尿液、唾液或粪便[14］.因此，钙保护素主要在相关器官的炎症过程中增加。由于钙保护素是局部释放的，它可能是局部炎症的敏感指标[15］.钙卫蛋白被认为是炎症性肠病中肠道炎症状态的一个很好的替代生物标志物。钙保护素是在粪便样本中测量的，因为在IBD炎症的肠道组织中有炎症细胞涌入，已知它与疾病活动相关[14，16］.

本研究探讨钙卫蛋白和细胞因子在BO患者痰液中的价值。此外，本研究还探讨了钙卫蛋白作为炎症标志物的价值及其与细胞因子水平和LCI的相关性。

2.方法

2．1．病人和控制

我们对28例BO患者进行了前瞻性研究，其中21例为PIBO患者，7例为造血干细胞移植后的BOS患者。患者队列的中位年龄为14.2(6.2-27.3)岁。诊断标准如下:有感染史或骨髓移植史，临床检查有持续性噼啪，肺功能伴甲亢 可逆性小于12%。此外，大多数患者在诊断时表现出典型的放射学特征。所有患者均排除了其他导致慢性呼吸道症状的原因，如囊性纤维化(CF)、免疫缺陷、吸入综合征或先天性心脏病。此外，18名健康对照组，中位年龄为16.2岁(7.6-25岁)。每个受试者都需要患者或护理人员的书面同意。该研究遵循《赫尔辛基宣言》的伦理原则、监管要求和良好临床实践规范。该研究由法兰克福大学负责任的伦理委员会批准，并在临床试验网站(clinicaltrials.gov)注册。NCT02627833)．

2.2.肺功能测试

使用体积描记仪(VIASYS Healthcare GmbH, Hoechberg, Germany)评估肺功能测试和可逆性测试。记录强迫肺活量(FVC)、FEV1、FEV1/VC、最大呼气流量的75% (FEF 75%)、储备容积(RV)、RV/总肺活量(RV/TLC)。LCI由EasyOne Pro Lab (ndd Medical Technologies, Andover, Massachusetts, USA)测量。

对所有患者在常规临床检查时进行肺功能检查(肺活量和体积描记)和LCI评估。如果患者正在接受-激动剂，建议他们在试验前8小时停止给药，长效-激动剂在研究前24小时停用。FVC、FEV1、75% FEF和流量-容量曲线根据美国胸科协会(ATS)指南进行评估。按照国际建议，通过容积描记术测量肺容积(TLC、强迫剩余容量(FRC)和RV) [17］.

２．３．气道可逆性

吸入400毫克后测试支气管扩张剂可逆性μ用带间隔器的计量吸入器(MDI)取克沙丁胺醇。可逆性定义为是/否，使用≥12%的支气管扩张剂后改变200毫升。

２.４.痰液收集、处理和细胞分析

如最近所述，患者和对照组受试者首先吸入沙丁胺醇，然后每7分钟雾化3%、4%和5%的高渗盐水溶液[18，19]。收集后1小时内处理痰。对痰进行定量，从样本中选择痰塞并放置在预称重的Eppendorf管中。用4倍重量/体积的0.1%二硫苏糖醇（DTT）处理，在随后添加2倍重量/体积的磷酸盐缓冲盐水（PBS）之前，样品在冰上处理15分钟。样品通过48 μ790 × g离心10分钟。上清液-80°C保存，待进一步分析。小球在300毫升重悬μ2% PBS/BS。随后，将混合物设置为30000个细胞/ml进行细胞旋分析，用May-Grunwald-Giemsa染色进行差异细胞计数[18，19].每个载玻片总共计数400个细胞，中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和巨噬细胞的百分比表示为总细胞计数的比例。

2．5．细胞计数珠阵列(CBA)

使用BD测定痰样本中三种细胞因子的浓度™ CBA Flex Set系统（BD Bioscience PharMingen，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国）用于测量IL-6、IL-8和IL-1β的水平。每个BD™CBA Flex Set包含一个具有不同荧光强度的单珠群体，以及适当的藻红蛋白(PE)检测试剂和标准。这些测试是根据制造商的说明书进行的。为了分析细胞因子，我们将与痰上清相同浓度的DTT(0.025%)添加到标准曲线和酶免疫分析缓冲液中，如所述[20.］.IL-8、IL-6和IL-1的细胞因子检测下限分别为1.2 pg/ml、1.6 pg/ml和1.0 pg/mlβ,分别。

2.6.统计和数据分析

使用GraphPad Prism (GraphPad Software Inc.， La Jolla, CA, USA)和Microsoft Excel对数据进行分析。使用Kruskal-Wallis检验或Mann-Whitney检验分析BO患者与对照组的组间差异检验依赖于方差的正态性和同质性假设。的概率 被认为是显著的。

3.结果

如表所示1，我们招募了28名患者（中位年龄14.2岁，范围6-27岁，男女比例11/7）。我们将患者数据与18名健康对照受试者的数据进行了比较（中位年龄16.2岁；范围7-25岁；男女比例16/12）（表1）1)．

３．１．肺功能检查结果

BO患者肺功能检测明显受损。BO患者的FVC、FEV1和25%肺活量时最大呼气流速(MEF25)显著降低，RV/TLC和LCI显著升高(BO: 12.1, 7.3-20.5;控制:7.1,6.0 - -8.4, ）与控件相比(表1)．

３．２．气道可逆性

大多数BO患者未检测到气道可逆性(图)1)．给药后进行气道可逆性试验μg沙丁胺醇在1例FEV1升高>12%和>200 ml的患者中呈阳性，在3例FEV1升高>12%但<200 ml的患者中呈阳性。

３．３．诱导痰中炎性细胞及细胞因子水平分析

如图所示2，中性粒细胞的比例明显更高(BO患者:79%，15-91%;对照组:14%，1-49%， ）所有BO患者中均观察到巨噬细胞，而对照组患者主要表现为肺泡巨噬细胞(BO患者:20%，5-83%;对照组:86%，48-99%， ）在他们的痰样本中。

所有细胞因子均在BO患者和19例对照组的痰上清中检测到。如图所示2，即IL-1的水平βBO患者的IL-6、IL-8水平高于对照组，但只有IL-8水平(BO: 9855 pg/ml, 182-155228 pg/ml;控制:2734 pg/ml, 366-13018 pg/ml， ）有显著不同。

3.4.血清和痰中钙卫蛋白水平

血清钙保护素浓度(BO患者:1416 ng/ml, 504-4161 ng/ml;对照组:2342 ng/ml、875 ~ 4331 ng/ml、 ）BO患者明显低于对照组(图3(一个))．

相比之下，BO患者的痰钙保护素水平显著高于对照组(BO患者:6429 ng/ml, 30.6-84000 ng/ml;对照组:950 ng/ml, 135 ~ 2887 ng/ml， ）如图所示3 (b)．

钙保护素与IL-8水平显著相关( ； ）钙卫蛋白与中性粒细胞计数、FEV1、MEF25和LCI的关系2)．钙卫蛋白与IL-1无明显相关性β和il - 6。

4.讨论

“闭塞性细支气管炎”一词描述了小气道常见的病理改变，这些改变是由不同的病因和特征引起的各种刺激性疾病引起的[1，2］.导致小气道中观察到的病理的过程不仅受到初始损伤的影响，还受到局部炎症反应和现有因素的影响，如营养状况和遗传变异[2- - - - - -4]先前的研究已经证实，BO患者的气道中存在持续的中性粒细胞炎症和促炎症标志物增加，尤其是IL-8[5，13，21]尽管如此，目前仍在寻找可用于评估单个患者风险和疾病活动性的生物标志物。钙卫蛋白是一种广泛存在于中性粒细胞细胞质中的蛋白质。在细胞死亡后，在炎症过程的范围内被动释放，其在炎症性肠病中的价值ase已建立良好[14- - - - - -16］.正如预期的那样，BO队列的痰标本中钙卫蛋白显著高于对照组。此外，钙卫蛋白与中性粒细胞计数、IL-8水平和促炎细胞因子IL-1水平显著相关β和il - 6。这些结果表明钙卫蛋白可能是小气道炎症过程的可靠指标。IL-8与钙卫蛋白的相关性最显著。IL-8由上皮细胞产生，对中性粒细胞有趋化作用。在我们的BO队列中，IL-8和中性粒细胞这两种标志物的增加强烈提示小气道持续炎症。由于我们的方案排除了患有急性呼吸道感染的BO患者，而且其中一些患者已经在10多年前被诊断为BO，因此很有可能存在潜在的慢性炎症过程，而不是由急性感染引发的炎症。

米歇尔等[22]健康对照组受试者在脂多糖（LPS）前和24小时后诱导痰的调查吸入和痰中中性粒细胞计数增加与钙卫蛋白水平之间存在相关性。重复测量显示钙卫蛋白水平重复增加；然而，中性粒细胞计数增加与首次尝试的结果不相关[22］.这一发现可能表明，与痰中中性粒细胞计数相比，钙卫蛋白水平的重现性有优势。Gray等人的研究[23]提示钙保护素可能表明炎症过程引起的变化。CF患者急性加重抗生素治疗后，痰中钙保护素水平显著下降[23，24］.然而，需要进一步的研究来揭示BO患者的痰中钙卫蛋白水平在抗生素和抗炎治疗后是否同样下降。

对CF患者的进一步研究表明，血清钙保护素水平的升高反映了炎症活动[25］.据推测，血清钙保护素水平的升高可能通过炎症部位上皮屏障的渗漏或骨髓中性粒细胞募集的增加而在循环中发生[24］.然而，在我们的研究中，BO队列的血清样本中钙卫蛋白水平没有增加，但血清钙卫蛋白水平明显下降。在BO患者中出现这些结果可能是因为BO与不能被全身钙保护素水平捕获的局部炎症有关;因此，血清钙保护素并不是一个有用的气道炎症标志物在BO。钙卫蛋白作为炎症标志物在IBD中已被证实[15，16］.检测钙保护素水平是廉价的、可重复的和可用的。因此，痰液钙卫蛋白可作为鉴别疑似BO患者的有效生物标志物。此外，是否有同样合格的方法来测量痰钙保护素水平，这将有助于进一步研究，而不像目前的方法费时。

BO患者通常发展为小气道疾病，表现为明显的流量限制，特别是影响小气道，并在肺远端出现典型的气陷症状[2- - - - - -5］.以往的研究表明，小气道阻塞与痰液和支气管肺泡灌洗液中的中性粒细胞计数有关。BO、CF和COPD患者中持续性中性粒细胞炎症与小气道疾病之间存在明显的关系[5，21，26- - - - - -28］.CF中有证据表明，LCI检测小气道内的变化比其他测试更为敏感[9］.在我们的BO队列中，LCI显著增加，由于小气道阻塞，通气存在相当大的不均匀性。RV和RV/TLC显著升高，fef75降低证实了这一发现。此外，我们发现LCI和fef75之间存在显著的相关性，这表明这两个参数表征了小气道的梗阻程度。先前的研究表明，在肺功能明显下降之前，LCI测量的BOS患者的通气不均匀性持续增加[11，12］.拉扎米等人[11提示定期行肝移植和肝移植后LCI测量可显示早期BOS;因此，可以建立早期治疗方案，以防止进一步纤维化改变。然而，需要对LCI进行进一步的纵向测量，以表明LCI是否对BO的早期阶段是敏感和有效的测量。本研究中肺功能检测结果与痰钙保护素水平有显著相关性。在BO队列的痰标本中，FEV1和fef75的降低和LCI的增加与钙卫蛋白水平的升高明显相关。钙卫蛋白水平较高的BO患者，炎症活动加剧，肺功能检查结果显示梗阻加重。恶性通货膨胀(RV和RV/TLC)与钙卫蛋白水平无相关性。

5.结论

BO与导致阻塞性气道疾病的小气道慢性炎症有关。由于持续的以中性粒细胞为主的炎症，中性粒细胞释放的钙卫蛋白在BO患者的痰液中显著增加。还需要进一步的研究来证实钙卫蛋白是否是中性粒细胞炎症的一个合理的替代标记物，以支持BO的诊断，并监测抗炎治疗在BO中的作用。

数据可用性

本论文的所有数据可根据要求提供。请联络Pera-Silvija Jerkic夫人(Pera-Silvija.jerkic@kgu.de)．

附加分

关键信息。关键问题是什么?钙卫蛋白作为一种成熟且局部释放的标志物，能否作为闭塞性细支气管炎患者嗜中性粒细胞持续性气道炎症的敏感指标?底线是什么?闭塞性细支气管炎(BO)患者痰中钙卫蛋白水平显著升高，并与IL-8和肺清除率指数升高密切相关。为什么要读。钙卫蛋白水平的升高反映了持续的中性粒细胞性气道炎症，钙卫蛋白是一种新的可靠的BO生物标志物。

信息披露

这幅作品的一部分作为海报在巴黎的急诊室展出。欧洲呼吸杂志2018:增刊62,PA4649。

利益冲突

作者声明了以下冲突。Stefan Zielen因演讲和咨询获得下列公司的酬金:CSL Behring、阿斯利康;赛诺菲-安万特公司;勃林格殷格翰集团;Stallergenes格里尔;Allergopharma GmbH & Co. KG, Allergy Therapeutics, bene-Arzneimittel GmbH;诺华公司;葛兰素史克公司;ALK-Abello Arzneimittel GmbH是一家;Lofarma GmbH, IMS Health GmbH & Co; Engelhard Arzneimittel GmbH & Co. KG and Biotest Pharma GmbH. Ralf Schubert received fees for consulting from Biotest Pharma GmbH and Vifor Pharma Deutschland GmbH. Martin Rosewich received fees for consulting from Allergy Therapeutics, Sanofi-Aventis GmbH, GlaxoSmithKline GmbH, Engelhard Arzneimittel GmbH & Co. KG, and Allergopharma GmbH & Co. KG. There are no conflicts of interest to report for the authors Pera-Silvija Jerkic, Felix Michel., Helena Donath, and Eva Herrmann. The authors confirm that the above stated conflicts of interest did not cause any bias in the present publication.

致谢

这项研究得到了“stftung Starke Lunge”基金会的资助。该基金会是一个非盈利性组织，支持对罕见肺病(https://starkelunge.de)．作者承认Annalena Kochems有助于痰诱导。

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