甲硫咪唑抑制GFAP的表达和星形胶质细胞的迁移挠伤口模型在体外

文摘

星形胶质细胞对中枢神经系统(CNS)侮辱品种的变化,如细胞肥大、迁移、增殖,疤痕形成,upregulation胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。疤痕形成起着非常重要的作用在伤口愈合和防止进一步出血形成物理屏障,也是中枢神经系统损伤的主要特性之一,导致神经胶质疤痕形成(astrogliosis),治疗癫痫耐药密切相关,慢性疼痛和其他毁灭性的疾病。因此,星形激活过程放缓可能给一个时间窗口的轴突生长后中枢神经系统损伤。然而,潜在的星形激活机制尚不清楚,也没有有效的治疗策略减弱激活过程。在这里,我们发现,甲巯基咪唑能有效地抑制在生理和病理条件下GFAP的表达。此外,我们划了大脑皮质星形胶质细胞的主要文化和没有甲巯基咪唑预处理和调查甲巯基咪唑是否可以在这些文化缓慢愈合的过程。我们发现甲巯基咪唑可以抑制GFAP蛋白表达在挠星形胶质细胞,延长伤口愈合延迟的文化。我们也测量了磷酸化细胞外signal-regulated激酶(ERK)在这些文化中,发现甲巯基咪唑可以显著抑制scratch-induced GFAP upregulation。第一次,我们的研究表明,可能会出现甲巯基咪唑化合物能抑制中枢神经系统损伤后星形激活通过减少在星形胶质细胞ERK的磷酸化。

1。介绍

星形胶质细胞是中枢神经系统中最丰富的细胞类型,可以支持邻近的神经元和神经集成通信单元的形式“三方突触”[1]。星形胶质细胞有关键的角色在维护离子和神经递质内稳态2]。在中枢神经系统中,星形胶质细胞发生广泛的生理和形态变化的侮辱后,包括创伤和手术(3]。星形形态的变化、蛋白表达和增生是称为“活性astrogliosis”[4]。反应性星形胶质细胞可以促进伤口愈合的过程中,可能扮演一个tissue-protective函数(5]。然而,astrogliosis也可能成为有害的神经功能恢复的过程如果细胞反应发生在非常快的方式,形成一个物理屏障,阻碍了可能本次[6]。Astrogliosis也可以抑制自适应神经可塑性是神经复苏后损伤的一个重要过程5]。astrogliosis之间的密切联系和慢性中枢神经系统疾病,如癫痫、慢性疼痛、和脑损伤,建立了(7]。因此,识别可能的化合物,可以减缓星形胶质细胞的激活过程可能会打开一个新的道路对神经功能恢复和临床前研究提供更多信息,比如在动物模型。

GFAP蛋白的表达增加,星形胶质细胞的细胞骨架蛋白的重要组成部分,被认为是一个基本的改变病患激活(8]。此外,一项研究表明,upregulation GFAP的表达可以抑制的抗炎化合物,通过针对阿司匹林,NF -κB信号通路(9]。此外,最近的研究进一步表明,GFAP upregulation和上述其他特性的星形胶质细胞激活密切受到“二级”后中枢神经系统损伤和神经炎症反之亦然(10]。细胞外基质分子,如硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPGs)是神经胶质疤痕的基本要素(10]。尤其是,三个核心蛋白质扮演非常重要的角色在胶质瘢痕的形成(11- - - - - -13]。

因此,规范GFAP和CSPG核心蛋白表达及中枢神经系统损伤后炎症反应可能是一个潜在的有用的策略来减弱astrogliosis过程和疤痕形成。

甲硫咪唑是一种抗甲腺的化合物被广泛用于治疗甲状腺机能亢进和格雷夫斯病通过防止生产从甲状腺甲状腺激素的水平。有趣的是,甲巯基咪唑也发现有重大影响中枢神经系统通过影响水平品种的神经递质(14]。之前的研究也表明甲巯基咪唑可能在大脑中调节阿片受体的表达15]。最近,一项研究表明,甲巯基咪唑可以减弱糖尿病小鼠中枢神经系统的神经胶质细胞的功能(16]。然而,甲巯基咪唑能否直接影响星形胶质细胞的激活在伤病在很短的时间内仍然难以捉摸。甲硫咪唑的抗炎效应,建立了在文献[17]。

在目前的研究中,我们调查甲巯基咪唑能否发挥直接影响星形胶质细胞的激活过程在体外刮伤模型,探索的影响甲巯基咪唑GFAP蛋白的表达和伤口愈合。我们还探讨了甲巯基咪唑的可能机制调控星形胶质细胞的细胞和分子反应。

2。材料和方法

2.1。细胞和治疗

星形胶质细胞是通过使用刚新生儿ICR小鼠与少量修改之前报道(18]。皮质外植体是孤立和切成一个1毫米的立方体。机械漩涡后,细胞被镀在35毫米菜肴的密度 每一道菜。这些病患文化保持杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM,生活技术)与10%胎牛血清(的边后卫,生活技术)的前两周,改为7%在接下来的两个星期。每3天中被改变。星形胶质细胞用于实验4周时的历史,被认为是功能成熟(18]。甲硫咪唑从σ和溶解在DMEM购买。使用的剂量研究被称为从前面的出版物19]。实验动物伦理委员会批准的动物协议中日联合医院,吉林大学,吉林省,中国。

2.2。细胞可行性试验(MTT)

我们测量细胞的生存能力与MTT测定如前面所描述的另一组(20.]。短暂,星形胶质细胞MTT镀在96孔板,而不是文化菜肴。还是星形胶质细胞板的使用和接受不同剂量的甲硫咪唑为12小时。在每个实验中,我们应用MTT方法直接进入井中(10%),然后是盘子是孵化3 - 4小时37°C。探讨了光学密度在570 nm,异常被表示为一个相对比例相比,他们控制。

2.3。刮伤试验

刮伤试验被用来评估甲巯基咪唑对伤口愈合的影响在挠培养的星形胶质细胞。细胞用于刮保持在35毫米直到4周大盘子。擦伤的伤口然后由使用塑料吸管技巧(10 - 20μL吸管tips)[之前报道的6]。我们洗碗后立即清除死细胞和其他碎片产生划痕。挠的菜肴被接受或没有甲巯基咪唑。在这段时间里,伤口差距组多次成像测量两条边之间的距离每道菜的伤口。

2.4。免疫印迹

测定蛋白质的表达水平,从培养的星形胶质细胞总蛋白提取。寒冷的裂解缓冲包含磷酸酶、蛋白酶抑制剂鸡尾酒(σ)减少蛋白质降解。样品含有总蛋白质变性,煮5分钟,然后用水12% sds - page电泳分离。蛋白质在硝化纤维膜被转移后与BSA通过阻断2小时或脱脂牛奶。GFAP的主要抗体(1:1000年,圣克鲁斯)p-ERK(1: 1000年,细胞信号),ERK(1: 1000年,细胞信号),p-JNK(1: 1000年,细胞信号)和物(1:1000年,细胞信号)和相应的二次抗体是用在这里。β肌动蛋白(Santa Cruz)作为内部控制。定量蛋白质表达水平的结果提出了这些蛋白质的比例相比β相应的肌动蛋白。

2.5。ELISA

il - 1的分泌水平β和il - 6对星形胶质细胞的提取蛋白质的酶联免疫试剂盒根据协议手册(eBiosciences)。通常,我们收集了颗粒介质从文化有或没有治疗。然后il - 1的水平β和il - 6测量用ELISA测定相应的装备。每个样品重复测定,和平均的值被用于分析。每个样本中总蛋白浓度测定用BCA化验(Abcam)和il - 1的值β和il - 6的比例与总蛋白。

2.6。定量实时聚合酶链反应

从培养的星形胶质细胞总RNA的RNA Mini-Preps工具包(Sangon生物科技、上海),其次是逆转录cDNA CFX96实时系统和定量PCR (Bio-Rad)。这里用引物是改编自前一个发布和GAPDH是用作内部控制(21,22)(表1)。GAPDH基因值归一化,量化计算通过使用阈值δδ周期方法之前报道(18]。

2.7。统计分析

所有数据都表示为 在这项研究中。从软件角度进行了统计分析。单向方差分析Newman-Keuls事后测试或紧随其后 - - - - - -测试是用于分析。时被认为是具有统计学意义的差异 。

3所示。结果

3.1。甲硫咪唑对细胞生存能力的影响、GFAP和CSPG核心挠星形胶质细胞的蛋白表达

首先,甲巯基咪唑对星形胶质细胞的细胞生存能力的影响。我们对星形胶质细胞在文化与不同剂量的甲硫咪唑(1、5、10、20和40毫米)。我们发现没有明显的毒性作用在星形胶质细胞(图甲巯基咪唑1(a))。此后,5毫米用于以下研究基于细胞刮伤模型可行性的结果和以前的报告在细胞培养模型19]。接下来,我们测试我们的主要假设甲巯基咪唑能否抑制upregulation挠GFAP蛋白的星形胶质细胞的文化。如图1(b),刮伤诱导显著增加12小时后GFAP蛋白的表达,这是符合一个以前的报告6]。然而,GFAP蛋白水平的增加可以抑制培养的星形胶质细胞的甲硫咪唑的预处理。使用rt - pcr,我们测量的相对表达水平三个核心CGPG蛋白质(neurocan, brevican, phosphacan)挠星形胶质细胞是否甲巯基咪唑可能影响他们的信使rna表达水平的表达。如数据所示1(c) -1(e),造成的划痕brevican mRNA的表达水平增加而不是neurocan phosphacan,尽管这两个基因的表达增加的趋势。有趣的是,甲巯基咪唑可以防止brevican表达的增加。

3.2。甲硫咪唑对ERK和物在挠星形胶质细胞蛋白表达

接下来,我们还探讨了可能的机制甲巯基咪唑病患可以调节GFAP蛋白的表达和激活过程中刮伤。研究验证,ERK和星形物磷酸化积极参与激活(6,23]。因此,我们进行免疫印迹探讨ERK表达水平及其磷酸化形式在这些培养的星形胶质细胞。我们发现刮伤诱导显著调节磷酸化ERK的表达,这可能是阻止甲巯基咪唑的预处理(图2(a))。我们也探讨磷酸化物的表达水平,发现磷酸化物显著增加30分钟后培养的星形胶质细胞的划痕,可有效地减少甲巯基咪唑的预处理(图2(b))。磷酸化物和ERK表达的增加的结果符合上述的出版物。和我们的研究结果暗示甲巯基咪唑可能抑制星形激活刮伤模型通过阻止物和ERK的磷酸化。

3.3。甲硫咪唑对挠星形胶质细胞的细胞迁移的影响

然后,我们测试了甲巯基咪唑能否抑制反应性星形胶质细胞的迁移,伤口边缘。增加激活星形胶质细胞迁移的能力已经被报道之前(24]。我们把培养的星形胶质细胞与甲硫咪唑被刮伤,然后用显微镜图像监控伤口愈合的速度在不同群体之间的菜肴。我们发现伤口愈合的过程开始后很快抓如图片所示,其中星形胶质细胞伸出过程覆盖在伤口上。然而,关闭是慢得多的差距比星形胶质细胞星形胶质细胞甲巯基咪唑治疗不治疗(图3)。这些结果暗示甲巯基咪唑可以减少挠星形胶质细胞的迁移,这可能是由于抑制星形激活。

3.4。甲硫咪唑对il - 1的蛋白表达的影响β并在挠星形胶质细胞il - 6

基于上述发现,我们假设甲巯基咪唑可能是一个有前途的化合物来减缓中枢神经系统损伤后星形活化过程在我们的预期。进一步证实了这一假定,我们也调查了甲巯基咪唑能否影响星形胶质细胞的炎症反应在挠文化。我们进行ELISA测量水平的细胞因子,il - 1β,在挠星形胶质细胞il - 6,这两个是众所周知的细胞因子可以调节在挠星形胶质细胞(24]。如数据所示4(一)和4(b),我们发现造成的划痕损伤显著增加这两种细胞因子的表达,认为抓创伤性星形胶质细胞的激活可能导致“hyperfunctional”星形胶质细胞刺激这些细胞因子的产品的能力。重要的是,当使用甲巯基咪唑,细胞因子水平的增加可以有效减少星形胶质细胞的培养基。以上结果始终有牵连,甲巯基咪唑能有效地减弱astrocyte-derived刮伤文化模型中炎症反应通过抑制星形胶质细胞激活。

4所示。讨论

Upregulation GFAP蛋白的表达水平的一个突出特征astrogliosis [25]。和astrogliosis被认为是抑制神经修复中枢神经系统损伤后迅速形成一个物理屏障6]。甲硫咪唑,我们的研究显示,抗甲腺的化合物可能是一个有前途的化合物能促进中枢神经系统损伤后神经再生在某些情况下,因为它显示一些有利影响星形胶质细胞活化过程中刮伤培养的星形胶质细胞的模型。尽管星形激活中枢神经系统反应的重要组成部分品种的侮辱后,可能产生不利影响在神经细胞复苏26]。假设建立了几十年的物理障碍导致astrogliosis能够介入神经再生的过程。因此,发现这里可能识别一个新化合物可用一个批准安全性快速调整健壮和星形激活中枢神经系统创伤或手术后的侮辱。我们探讨了可能的甲硫咪唑对CSPG核心蛋白的影响,发现甲巯基咪唑可以抑制scratch-induced upregulation brevican。不过,我们不能发现显著增加neurocan和phosphacan培养的星形胶质细胞的表达痛苦刮伤损伤与前面的结果在动物模型。这可能是由于CSPG核心培养的星形胶质细胞中蛋白质的表达概要文件不相同的动物模型。进一步研究关于这些蛋白质的表达模式是未来的保证。

甲硫咪唑可能通过不同的途径来影响病患在中枢神经系统功能。首先,它可以防止星形胶质细胞的激活,这是在我们的研究结果验证表明甲巯基咪唑抑制星形胶质细胞的迁移的边缘刮伤。其次,甲巯基咪唑可能影响星形胶质细胞的功能被侮辱,重新激活后包括细胞因子的生产(27]。如图4,我们发现甲巯基咪唑显著降低il - 1的蛋白水平β和il - 6在挠星形胶质细胞的培养基。甲硫咪唑的能力减弱直接炎症反应建议抗炎作用。正如上面提到的,发现了甲巯基咪唑抑制糖尿病小鼠模型的神经胶质细胞的功能(14]。我们的结果与这些先前的结果一致。此外,神经炎症和细胞因子可能大大影响神经元函数通过不利调节突触可塑性或突触蛋白质功能(28,29日]。因此,甲巯基咪唑可以直接阻止这些细胞因子的释放中枢神经系统损伤后可以保护神经元的“二次攻击”随后的炎症反应。

甲硫咪唑的有利影响病患激活后受伤被信号通路上的结果进一步证实了在我们的研究中。已经确立,MAPK通路与星形胶质细胞的活化过程密切相关损伤,包括刮伤(6]。我们研究了物和ERK的磷酸化状态MAPK-related蛋白质。免疫印迹结果在我们的研究证明了磷酸化物和ERK的显著增加。重要的是,这些磷酸化蛋白质的表达水平在星形胶质细胞的划痕可以预防甲巯基咪唑的预处理。

有各种优势的甲硫咪唑在中枢神经系统对未来可能的应用。首先,甲巯基咪唑已经商业化了许多年的临床医学。其次,甲巯基咪唑具有相对安全性,使它可以用于神经再生的时间通常需要几个月,甚至几年。第三,研究动物如上所述建议甲巯基咪唑在中枢神经系统渗透的能力。然而,本研究有局限性。我们的研究是第一步的探索可能的应用程序在体外模型。这项研究的结果和结论是初步的。

5。结论

目前的研究提供了在体外数据第一次甲巯基咪唑具有潜在的用于治疗中枢神经系统损伤通过瞄准星形胶质细胞功能。而更多在活的有机体内在动物模型中数据是必要的,如刀刺模型,目前的发现可能为一个新的应用程序提供初步证据广泛使用的化合物在中枢神经系统损伤的减速星形胶质细胞的激活过程,允许受伤神经元恢复。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者没有利益冲突的披露。

确认

作者感谢中国的奖学金Chunhai Zhang博士奖学金委员会。

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