Triticum vulgare提取物调节BV-2细胞中的蛋白质 - 激酶B和基质金属蛋白酶9蛋白表达：与分子机制伤口愈合相关的炎症途径的生物活性

抽象的

基质金属蛋白酶（MMPS）是一种大家庭，普遍地表达锌依赖性酶，其具有蛋白晶型活性。它们在生理情况和病理条件下表达，涉及炎症过程，包括上皮细间充质转换（EMT），神经元损伤和癌症。还有证据表明MMP调节肿瘤微环境中的炎症，这在愈合组织过程中起着重要作用。探讨炎症和神经元损伤，MMP9涉及两个过程，它们的调节似乎由两种蛋白质调节：肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素6（IL-6）。然而，其他重要基因涉及转录因子的分子调节，蛋白质激酶B（akt）和p65。此外，Triticum vulgare提取物（TVE）调节与炎症过程相关的生物标志物，包括P65蛋白。虽然没有证据表明TVE可能参与其他炎症标记的生物调制作为AKT，但我们想评估TVE是否能够（1）调节AKT（PAKT）的磷酸化作为体外炎症过程的早期标记（2）影响体外模型中的MMP9蛋白表达。BV-2细胞（小鼠的小鼠）已被用作模拟炎症和神经元损伤病理的体外模型。这里，MMP9似乎参与了通过炎症标记激活的细胞迁移。 We simulate an inflammatory preclinical model treating BV-2 cells with lipopolysaccharide (LPS) to induce proinflammatory activation affecting pAKT and p65 proteins. TVE is revealed to restore the native expression of AKT and p65. Additionally, TVE extract modulates also the protein concentration of MMP9. Nevertheless, immunofluorescence confocal analyses revealed that both AKT and MMP9 are regulated together, synchronously. This work seems to demonstrate that two important genes can be used to monitor the beginning of an inflammatory process, AKT and MMP9, in which TVE seems able to modulate their expression of inflammation-associated molecules.

1.介绍

在许多情况下，人体组织修复的不同过程与细胞损伤有关。与细胞损伤相关的现象包括但不限于炎症反应、坏死和线粒体功能障碍[1- - - - - -4］．

查看上述列表，大型演员由炎症反应表示，其中，细胞损伤的开始对受损细胞内的促炎症标记表达的开放方式开放。但是，通常很难理解售价为准炎症分子过程;实际上，许多科学家可以列出以下生物分子标志物，包括肿瘤坏死因子-α（TNF-α.白细胞介素1 β (IL-1β)、白介素6 (IL-6)和一氧化氮(NO)作为炎症过程的“指纹”[5，6］．尽管如此，核因子kappa beta（nf-κ..b）是参与炎症反应的重要转录因素，导致该过程的主要效应器[7］．NF -κ..B途径在各种临床损伤条件下激活，包括脑中的损伤和缺血[8］．出于这些原因，NF-κ..B的表达及其在BV-2细胞中的表达常被用作小胶质细胞炎症的临床前模型[9，其中NF-κ..B核表达调节多个参与炎症的基因;该列表包括酶、细胞因子、受体和细胞粘附分子[10］．到目前为止，为了调查体外这种过程，许多科学家们使用了来自小鼠小鼠的BV-2细胞培养物。实际上，BV-2细胞中的脂多糖（LPS）的刺激会影响促丝瘤激活的其他信使蛋白质调节，例如糖原合酶激酶（GSK-3β）蛋白质和磷蛋白-激酶B（PKB或PAKT）[11］．此外，炎症的分子场景包括重要的蛋白质/酶。有其他重要证据表明基质金属蛋白酶(MMPs)是缺血/再灌注诱导的脑损伤的主要行为者[12，13]，通过NF-以依赖方式κ..B也是。特别地，在实验动物模型中的脑缺血后，MMP9是上调的[14］．此外,肿瘤坏死因子-α.和IL-1β据报道旨在诱导MMP的生产[15- - - - - -17］．研究炎症模型中涉及的复杂分子网络，似乎有助于研究炎症的早期标志物和作为基质金属蛋白酶的末端效应器之间的关系。研究针对起始驱动基因(即AKT)和最终效应因子(MMPs)影响促炎反应的新治疗方法的可能性，似乎是一种有希望的临床治疗方法，用于炎症过程驱动病理行为的所有病理[18］．小麦提取物(TVE)在BV-2模型中被证实可以调节多种促炎信使rna，但在上述模型中AKT和MMP9的表达并没有很好地证明其有效性。然而，其他重要的研究表明，TVE通常用于治疗不同的皮肤病理状况，包括溃疡、烧伤和营养不良疾病[5，其中再上皮化或组织再生过程与炎症过程相关。事实上，有报道称Fitostimoline产品(TVE)的活性成分能够加速组织修复、趋化和纤维化细胞的成熟以及愈合过程[19- - - - - -22］．实际上，看着TVE活动周围的整个场景，我们询问自己是否可以在标记为“生物活性化合物”的药物化合物类别内部。用于建立生物活性化合物的定义的定义之一：“摘要植物生物活性化合物是植物产生的对人和动物具有药理或毒理学作用的化合物“[23］．然而，当在高剂量（例如维生素和矿物质）上摄取时，生物分子诱导药理学（好的）或毒理学（坏）效果。通常，植物中的生物活性化合物衍生为二次化合物。实际上，我们想皂化生物活性化合物的定义，如下所示：“植物衍生的次生代谢物，利用人和动物的药理或毒理学作用。”目前工作的目标是建立TVE是否可以作为生物活性化合物，调节AKT和MMP9蛋白表达在体外系统中，与炎症的主要作用者为NF-κ..B。

2。材料和方法

2.1。triticum vulgare提取物（tve）

Triticum vulgare，甘草属植物植物的二项式科学名称，是众所周知的小麦植物。它在农村卫生部大量的，意大利那不勒斯实验室的受控条件下生长。优惠券标本是DF / 237/2014，它沉积在意大利萨勒诺大学医用植物学链的植物标本中。市售的种子是从意大利北部的Consorzio Agrario Lombardo Veneto购买。用于本文的种子的批次数为12/001-B10148 / 201/04。triticum vulgare提取物（tve-damor）是特异性细胞耐温护照的含水提取物，通过已经描述的复杂和特定方法获得的[24］．这是Farmaceutici Damor(意大利那不勒斯)的礼物。

2.2。细胞系

永生小鼠BV-2细胞系(ICLC ATL03001, Interlab cell line Collection，意大利Banca biatus e cell Factory)在添加10%胎牛血清(FBS)、1%青霉素-链霉素(Invitrogen)和1%谷氨酰胺(Invitrogen)的Dulbecco 's Modified Eagle 's培养基(DMEM, Invitrogen)中培养。培养物在37°C的5% CO中生长₂直到80%的融合。为了进行处理和分析，当细胞在PBS中使用胰蛋白酶/EDTA溶液达到融合时进行细胞分裂。根据下面研究的不同分子测定，我们使用了两种不同的播种方式。

2.2.1。ELISA测试的MMP9测定

将BV-2小鼠微胶质细胞接种在12孔板中，以获得具有和没有LPS的每种浓度的三种不同的实验。按照以下部分中所述收获培养基以进行分析。

2.2.2。通过共聚焦免疫荧光分析AKT，MMP9和P65蛋白表达

将BV-2小鼠微胶质细胞接种在8孔室载玻片（CS）（Lab-Tek1 Champer Slide TM System，Nalge Nunc International，Naperville，IL，USA），在650年填充5000个细胞/井 μ.L最后的体积。制备CS，以获得3个重复的3个不同的实验。处理后，用70%乙醇溶液将细胞直接固定在载玻片上10分钟，然后按照制造商的说明用机械键取出载玻片孔。如免疫荧光部分所述，对AKT、MMP9和p65亚基进行免疫荧光(IF)检测。

2.3。体外治疗

BV-2细胞和细胞接种于12孔板。用LPS和TVE处理细胞。BV-2细胞系暴露于浓度为5%、10%和20%的TVE。TVE预刺激12小时后，用脂多糖- (LPS, Sigma)模拟炎症刺激(100 ng/mL, 24小时)培养细胞。我们共进行了六次腔室载玻片，以进行三种不同浓度的含LPS和不含LPS的TVE。

此外，我们将BV-2细胞与PAKT的两种特异性抑制剂进行治疗，Wortmannin（1 μ.M;#9951, EuroClone，米兰，意大利)和LY294002 (50μ.M;#9901, Euroclone，米兰，意大利)。我们分别使用这两种抑制剂处理BV-2细胞，并分别与LPS联合使用，以验证pAKT状态下的功能作用。对照组避免任何化合物。最后，我们评估了7种不同的处理，如下:(A)对照，(B) LPS， (C) Wortmannin， (D) LY294002， (E) Wortmannin+LPS， (F) LY294002+LPS， (G) TVE+LPS(图)1(一))．

２.４.ELISA法测定MMP9蛋白表达

使用市售的试剂盒（Cytokine，R＆D，Bio-Techne，Milan）评估MMP9蛋白浓度作为BV-2细胞培养物的上清液。将细胞培养基以4000rpm离心5分钟。根据制造商的说明，通过酶联免疫测定（ELISA）测量MMP9的水平。同意制造商的指示，所有实验均以三份进行，并评估校准曲线。通过多风格仪器及其软件（Spectrastar Nano，Euroclone，米兰，意大利）进行价值的收购和它们的浓度计算。

2．5．免疫荧光法测定p65蛋白核浓度

量化NF-κ..BV-2细胞中的B p65亚基通过共聚焦免疫荧光方法进行。通过专用的关键，在药理治疗结束时除去腔室载玻片的塑料盖。将载玻片通过乙醇（70％，10分钟）固定，然后在磷酸盐缓冲盐水中冲洗（PBS 1x 10分钟）。为了检测p65亚基，我们使用多克隆抗体（1：100;在室温下1小时; NF-κ..B p65 (D14E12) XP1 Rabbit mAb #8242, Cell Signaling Technologies, Leiden, Netherlands)。洗涤后应用荧光二抗(1:50;室温下黑暗30分钟;Anti-rabbit IgG Fab2 Alexa-Flour 488， #4412S, Molecular Probes, Cell Signaling Technologies, Leiden, Netherlands)。细胞核反染色使用含有DAPI的特殊荧光抗褪色试剂(ProLong1 Gold antifade Reagent with DAPI #8961, Molecular Probes Cell Signaling Technologies, Leiden, Netherlands)。样品置于4℃保存至观察。NF-的可视化、核迁移和定量κ..B p65亚单位使用共聚焦显微镜(AXIO vert 200, Zeiss, Wetzlar, Germany)及其用于图像采集和数字成像处理的专用软件(AXIOvision version 4.2.3.1, Zeiss, Wetzlar, Germany)。这些图像是在40倍的放大倍数下获得的。每个场分别获得5张不同的图像(DAPI, green, merge (M)， bright field (BF)，和BF+M)，并在对应的图中报告。

为了量化每种颜色通道（蓝色和绿色）的信号，我们必须在合并图像上绘制矢量，以便获得报告IF的强度的图表，观察在细胞质和细胞核中的IF信号。载体分析40个不同点/细胞，横跨核和细胞质。向量的长度等于6 μ.m。AQUA频谱的强度是通过在由绿色通道获得的那些中由蓝色通道获得的值之间的比率（如果r）计算。P65的核蛋白表达与水上颜色的存在有关。Aqua Spectrum的范围范围如下： ．实际上，我们重叠了BF图像以验证核内的水色颜色的位置[5］．

2.6。免疫荧光法测定AKT蛋白胞液浓度

我们重复了上一节中描述的相同程序，以检测两种形式的AKT，蛋白磷酸化(pAKT)和未磷酸化(总AKT)。单克隆抗体检测总AKT (1: 100;RT时1小时;AKT pan (40D4) XP1 Mouse mAb #2920, CST, Leiden, Netherlands)，磷酸化AKT用多克隆抗体检测(1:100;RT时1小时;pAKT (D9E) Rabbit mAb #4060, CST, Leiden, Netherlands)。洗涤后应用两种荧光二抗(1:50;室温下黑暗30分钟;Anti-mouse IgG Fab2 Alexa-Flour 535， #4412S(红色)和Anti-rabbit IgG Fab2 Alexa-Flour 488， #4412S(绿色)，Molecular Probes, CST，莱顿，荷兰)。细胞核反染色使用含有DAPI的特殊荧光抗褪色试剂(ProLong1 Gold antifade Reagent with DAPI #8961, Molecular Probes CST, Leiden, Netherlands)。 In the AKT experiments, the vector analyzed 40 different points/cell, inside the cytoplasm. The length of the vector was the same with that used for the p65 protocol (6 μ.m）。将与AKT和PAKT相关联的红色和绿色光谱分别组合，我们获得了由绿色和红色（绿色/红色）之间的比率（如果r）计算的三种不同的额外光谱。观察黄光谱（Y）何时观察到 ．同时,当 ，我们观察了典型的石灰（l）颜色;否则，对于 ，我们观察到一个典型的橙色(O)颜色。我们将BF图像重叠，以验证BV-2细胞细胞质中黄色、石灰色和橙色的位置(图)1和2)．

2.7。tve摄取和pakt调制曲线

使用Lambert-Beer方程，通过多阅读器仪器及其软件(SPECTROstar Nano, EuroClone, Milan, Italy)计算TVE的吸收。我们使用在293 nm波长处获得的光密度(OD)值来评估TVE的浓度;这个波长表示TVE的最大外径。通过分析7种不同浓度的TVE在同一实验介质中的浓度，得到了标定曲线。通过比较TVE浓度和治疗开始(T0)和结束(T1)，评估TVE的摄取情况。我们假设浓度的差异(T0-T1)与BV-2细胞摄取TVE有关。我们分别用5%、10%和20%的TVE联合LPS处理BV-2细胞，评估TVE的摄取情况。如上所述，对相同实验的细胞进行pAKT和AKT免疫荧光检测。评估TVE摄取与pAKT/AKT比值之间的关系，得出剂量-反应曲线。

2.8。免疫荧光法测定MMP9蛋白胞液浓度

如果在用于P65和AKT标记的过程之后以相同的方式执行MMP9。通过多克隆抗体检测MMP9蛋白（1：100;在室温下1小时; MMP9（D603H）XP兔MAB＃13667，CST，莱顿，荷兰）。洗涤后，施加荧光二抗（在黑暗中，在室温下30分钟;抗兔IgG Fab2 Alexa-Flow 535，＃4412s（红色）分子探针，CST，莱顿，荷兰）。如上所述进行核备受染色。为了在同一实验中展示MMP9和P65，我们同时执行这两个标记，对于P65的MMP9和GREEN进行红色。这些实验的目的是找到与MMP9和P65表达和与P65核定位相关的AQUA光谱相关的细胞质光谱y。分析荧光强度的定量，每次实验分析并由图表报告。

2.9。在Silico.炎症标志物分析

为了评估炎症的“指纹”标记之间的相互作用，P65和MMP9，我们评估了13条制品，其中研究人员通过ELISA，Western印迹和/或免疫荧光研究了上述基因的蛋白质表达。在每篇文章中，我们评估为促炎剂（PIA）能够增加标记物的蛋白质表达的分子或化合物。虽然我们被认为是抗炎剂（AIA）能够恢复PIA促进的相同蛋白质表达的治疗。看着每篇文章的结果，我们评估了与其对照相比每种蛋白质的倍数和每种治疗的折叠电荷。

为了对结果有一个快速的解释，我们为每一篇文章制作了一张热图来可视化PIA, AIA，研究的标记，以及它们的修改。根据评估的折叠装药强度得到最终的热图可视化(图)3.)．我们在这部分工作中使用的文章涵盖了以下主题:脑损伤[25，26，炎症机制[27- - - - - -32和癌症[33- - - - - -37］．这些分析中包含的论文规格见表1．

2.10。统计分析

实验至少进行了3次，数据表示为在3次独立实验中获得的值的SEM平均值。对照组与治疗组采用单因素方差分析(ANOVA)进行统计学比较。的 值被认为是显着的。

3.结果与讨论

看着模拟分子炎症机制的体外模型的文献，在几个领域中使用BV-2细胞[5，9，11，18］．以前，我们证明这种细胞培养系统调制炎症介质，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α.），白细胞介素1beta（IL-1β)、一氧化氮(NO)和核因子kappa beta (NF-κ..b），在LPS刺激后[5］．在这项研究中，我们证明我们的实验反应了其他研究报告的细胞行为，包括炎症的机制[27- - - - - -32］．我们特别强调了上述促炎信使(TNF-)的诱导α.，IL-1β、NO和NF-κ..b）[5］．然而，添加普通小麦提取物(TVE)，与LPS联合显示了对特定炎症标志物的抗炎作用，恢复了p65的细胞质水平，并降低了其核表达[5];其他作品报道了这种机制，其中P65恢复（P65的核染色的减少）是良好的抗炎信号[11，27- - - - - -32］．然而，除了上述四个标记之外，没有其他标记与“早期炎症分子”概念有关。此外，该研究不仅显示出BV-2细胞中P65的恢复（图4）还证明了AKT标记的诱导，在LPS后增加其磷酸化同种型，作为炎症过程的模拟。虽然LPS + TVE组合降低了PAKT / AKT之间的比率（图2)，实际上，与其他两种化学pAKT抑制剂的比较显示其磷酸化状态下降(图)1(一))．此外，TVE似乎通过剂量效应方式影响PAKT状态（图1 (b))，其中TVE浓度的摄入在5%和10%时表现出显著影响，而在20%时则没有显著影响(图)1 (b))．实际上，看着PAKT / AKT的比例，TVE治疗似乎发挥着一种抗炎调节剂，显着影响PAKT表达（图2)．AKT蛋白的这种表型描述已被其他研究人员报道[11］．特别是，这项工作描述了其他两个基因，GSK-3β和Notch-1，参与小胶质细胞炎症模型[11及脑癌的分子机制[38), GSK-3β似乎调控NF-的表达κ..B [39］．nf-的激活κ..B是通过磷酸化和随后的降解抑制剂介导的κ..(我κ..B)和p65亚基的核迁移[5］．此过程随后导致自由NF的易位κ..B蛋白（p65）促进促进促炎基因如促炎细胞因子（TNF-）的核核α.IL-6和IL-1β)、环氧化酶-2 (COX-2)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS) [39，40］．到目前为止，已知NF-κ..B在不同类型的病理过程中发挥转录激活程序内的枢轴作用[5，11，16，38］．尽管如此，其他研究人员报告说NF-κ..B也参与了神经元凋亡的分子途径[9]及疟疾感染[18］．在这两篇论文中，科学证据报告说nf-κ..B也与MMP9蛋白质调制相关[9，18］．我们的结果表明，p65不仅在BV-2细胞中被调节(图4）但P65的调制也与MMP9表达同时相关（图3.)．在我们的体外模型中，LPS处理后p65核表达的上调在10%的TVE存在时被逆转，这有力地支持了TVE的抗炎作用。需要强调的是，我们的定量方法(共聚焦IF)证明了p65在我们的模型中的影响[5]，在BV-2细胞中以统计学显着的方式影响MMP9蛋白的表型表达和分泌（图3.)．实际上，与另外两种PAKT化学抑制剂的比较证实了其​​磷酸化状态的降低（图1(一))．此外，我们的结果似乎得到了我们在硅分析的有力支持，在13篇文章中有8篇研究p65和MMP9共同作为炎症标志物。在这些研究中，87.5%(7/8)的研究表明p65和MMP9蛋白的PIA表达同时上调，并在AIA治疗后恢复[26，30.- - - - - -33，35，36］．此外，我们的硅分析还显示，pAKT、MMP9和p65被认为是炎症标志物，并被高良姜(一种可能的脑疾病炎症调节剂)调节不足[26］．关于这一效应的可能机制，我们与其他研究一致，即伴随调节NF-κ..B和MMP9已被证实[11，18］．在涉及“早期炎症”过程中的分子周围的前面和过去的工作，我们强调了介质，如IL-1，TNF-α.，IL-6，NO和PGE2，促进组织修复和改造的过程由于损害遭受。众所周知，TVE的特异性制备作用于成纤维细胞活化和促进组织修复和愈合过程的方法[19- - - - - -21，发挥抗炎作用，使炎症的愈合过程进入再生过程。最后，但并非最不重要的方面，我们可以假设，TVE提取物作为一种生物活性化合物，查看其非细胞毒性作用和从植物中提取的生物活性化合物的定义[23］．

4.结论

TVE的非细胞毒性特性能够调节AKT、p65和MMP9的蛋白表达，这些蛋白也参与炎症相关病理，包括伤口损伤，在愈合过程中作为生物活性化合物发挥作用。

数据可用性

1.所有用于支持本研究结果的原始图片、图形和图表的数据都包含在文章中。2.原始文件(原始数据)关于图片，数字，图表，和任何电子文件生成的数据用于支持本研究的发现，可从通信作者要求。

利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

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