模拟正畸牙移动过程中巨噬细胞的压缩和拉伸应变的影响

摘要

在正畸牙齿运动(OTM)治疗矫正错位牙齿的位置，从而改善口腔健康和生活质量的过程中，连接牙齿和周围骨骼的牙周韧带(PDL)内的成纤维细胞、巨噬细胞和其他免疫细胞暴露在压缩和拉伸应力中。虽然PDL成纤维细胞通过机械转导性触发释放细胞因子参与了OTM的生物学调控，但尚不清楚巨噬细胞是否也以类似的方式对压力和紧张做出反应从而影响或介导OTM。将RAW264.7巨噬细胞接种在常规的6孔细胞培养板上加压，或接种在Bioflex板上进行张力测定，并预培养24小时。为体外模拟生理正畸压拉应变2 h, 4 h, 24 h, 48 h，玻璃盘(2 g/cm²）置于或分别附着的巨噬细胞各向同性拉伸为16％。我们测定细胞数目，细胞毒性和基因/蛋白表达Vegf-a/ VEGF-A（巨噬细胞介导的血管生成），Mmp-8/9(细胞外基质重组)和COX-2/ PG-E2，il - 6/ IL-6，和TNF-α/ TNF-αRT-qPCR和ELISA检测促炎介质。仅在2小时后，压缩应变而不是拉伸应变导致细胞数量显著减少。MMP-8和MMP-9expression was significantly enhanced within 24 h of compressive and in part tensile strain. Significantly increasedVegf-a在压力作用4小时内检测到/VEGF-A的表达，但在施加拉伸应变时没有检测到。促炎介质的表达COX-2/ PG-E2，il - 6/ IL-6，和TNF-α/ TNF-α在施加压应变或拉应变后2-4 h，显著增加。我们的研究结果表明，巨噬细胞在OTM过程中较早地对压缩和拉伸应变做出反应，促炎细胞因子的基因表达增强，这可能影响PDL成纤维细胞、成骨细胞和免疫细胞，触发或增强OTM背后的生物机制和破骨细胞形成。

1.简介

错位的牙齿的正畸矫正具有重要医学意义，因为它表明，牙齿的咬合不正可能与龋齿的发病率增加有关[1，2]、牙龈炎、牙周炎及牙龈萎缩[3，4]。特别值得一提的是，未经治疗的乳牙龋齿非常普遍，目前影响到全世界5.32亿儿童[五]，因而被世界卫生组织称为“全球最重要的健康负担” [6]。因此，正畸具有用于这些疾病的发生和发展的一个重要的预防功能。为了实现正畸牙齿移动（OTM）纠正错开齿的位置，机械力是由在移动方向可移动的或固定的矫正器具的装置应用于牙齿。此施加的力导致的拉伸和压力区的形成在牙周膜（PDL），纤维状和蜂窝结缔组织锚固在颚骨的牙槽牙。尽管它的纤维性质，PDL是咀嚼设备的长期健康有大量细胞结构是必不可少的。施加矫正力到牙齿之后，有骨插座和细胞在PDL内的初始倾翻受到压缩或拉伸的机械应变[7，8]。在PDL中发现的主要细胞群体由成纤维细胞，而且成骨细胞和免疫细胞如巨噬细胞，白细胞和T细胞9也存在于人民自由党中。已知PDL成纤维细胞(PDLF)负责调节组织稳态和胶原结构蛋白的形成[7，8]。此外，它们在先天免疫防御中发挥调节功能[7]，并在OTM过程中发挥主要的中介作用。因此，它们在基础正畸研究中得到了深入的研究[10-14，特别是考虑到它们对压力或拉力矫正力的反应。施加压力可增加PDLF中促炎酶、细胞因子和趋化因子的合成[11，14，15]。特别是，前列腺素的表达是由于环氧合酶-2 (COX-2)活性的增加。这促进可溶性和膜连接RANK-L(核kappa b配体的受体激活物)表达的增加[11]以及促炎细胞因子的白细胞介素等-1（IL-1），IL-6，肿瘤坏死因子α(肿瘤坏死因子-α），以及趋化因子如IL-8 [14，16]。这些反过来进一步增强RANK-L的表达和增加的基质金属蛋白酶的释放[17]，促进细胞外基质的降解[7从而引发了OTM的PDL的转变。由PDLF增强发布的RANK-L [18]增加RANK-L的到骨保护素的比例（OPG），其充当RANK-L的可溶性诱饵受体。这促进了破骨细胞形成和骨吸收在PDL的压力区[7]，由于RANK-L与RANK受体破骨细胞前体细胞的表面上的结合为它们分化成成熟破骨细胞[必不可少19]。

OTM期间PDL成纤维细胞中的中介作用是很好的研究;然而，功能和在OTM的上下文中接收的压缩或拉伸应变巨噬细胞的作用还没有研究。在这项研究中，我们因此集中在暴露于OTM期间不同时间范围中发生压缩或拉伸的机械应变的巨噬细胞的表达谱中，为了更好地了解的巨噬细胞的PDL中的转化过程期间OTM的作用。

2.材料和方法

2.1。在体外细胞培养实验

RAW264.7巨噬细胞从CLS购买（400319，细胞系服务有限公司，的Eppelheim，德国），并在高葡萄糖DMEM中培养（D5796，Sigma-Aldrich公司，慕尼黑，德国）补充有10％FBS（P30-3306，PAN-Biotech公司，艾登巴赫，德国），1％L-谷氨酰胺（SH30034.01，GE医疗欧洲，慕尼黑，德国），和1％抗生素/抗真菌剂（A5955，Sigma-Aldrich公司）。或 (2 h和4 h孵化),500000(24小时孵化),或250000 (48 h孵化)RAW264.7巨噬细胞被播种压力实验到标准6-well聚苯乙烯板(353046、BD、海德堡、德国)或拉伸加载实验6-well Bioflex板块(bf - 3001,邓恩Labortechnik Asbach,德国)和preincubated 24小时没有任何机械应变允许依从性。模拟正畸在PDL压缩区域的压力，压力为2 g/cm²按照已建立并公布的模拟正畸压力应用方法，将RAW264.7巨噬细胞在70%融合培养条件下分别培养2h、4h、24h和48h(图图1（a）)[10，12-14]。同时，在同样的6孔板上，在没有压力(控制)的情况下培养2、4、24、48小时RAW264.7个巨噬细胞。静态各向同性拉伸应变16%用于RAW264.7巨噬细胞在细胞培养条件下为70% confluency通过球形硅胶的邮票从油井底部插入灵活Bioflex膜2 h, 4 h, 24小时和48小时根据建立和发布方法模拟拉伸矫正变形体外实验（图图1（b）)[20.，21]。In parallel, RAW264.7 macrophages were again cultured on the same Bioflex 6-well plates without stretching for 2 h, 4 h, 24 h, and 48 h.

2.2。细胞数评定

After the appropriate incubation time, we harvested RAW264.7 macrophages with a cell scraper in 1 ml PBS and quantified the cell number with a Beckman Coulter Counter Z2™ (Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany) according to the manufacturer’s instructions.

2.3。通过LDH测定细胞毒性的测量

我们进行的乳酸脱氢酶（LDH）测定（04744926001，罗氏，曼海姆，德国）来评估细胞毒性。为此，我们根据制造商的说明使用细胞上清液。简单地说，我们混合50 μl取上清50μl新鲜配制的LDH溶液(22)μl催化剂与1ml染料混合)，室温暗置孵育30分钟。在加上25之后μl停止溶液时，我们使用ELISA阅读器(Multiskan GO Microplate分光光度计，Thermo Fisher Scientific)测量490 nm处的吸光度(LDH活性)，减去690 nm处的背景吸光度。

2.4。总RNA的分离和纯度评估

RNA分离按前面所述进行[13]。简单地说，我们使用500从RAW264.7巨噬细胞中提取总RNAμl peqGOLD TriFast™(PEQLAB, Erlangen，德国)每口井，并根据制造商的说明进行进一步加工。我们在20分钟内重悬产生的颗粒μl无核酸酶水(T143，卡尔罗斯，卡尔斯鲁厄，德国)，并立即在冰上冷却。我们测定了280 nm和260 nm的光密度(纳米光度计N60, Implen，德国慕尼黑)，以评估洗脱总RNA的纯度和数量。

2.5。反转录(cDNA合成)

我们使用标准量的每个样本100 ng RNA用于cDNA合成，以及0.5 ngμl random hexamer primer (0.1 nmol, Life Technologies), 0.5 μl oligo-dT18引物(0.1 nmol, Life Technologies)μl 5x M-MLV缓冲液(Promega)， 0.5μl dNTP mix (40 nmol, dNTP, Carl-Roth), 0.5 μl RNase抑制剂(40 U, Life Technologies)和0.5μl reverse transcriptase (200 U, Promega), and added nuclease-free H₂O（卡尔 - 罗斯）至10的最终体积 μ湖The samples were incubated at 37°C for 60 min, and the reverse transcriptase was heat-inactivated at 95°C for 2 min. To minimize experimental variations, synthesis of cDNA was performed concurrently for all samples. We stored cDNA at −20°C until use.

2.6。实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR的）

为[前描述根据MIQE质量控制准则进行RT-qPCR的扩增13，22使用Mastercycler®ep realplex-S热循环器(Eppendorf AG，汉堡，德国)。RT-qPCR反应，我们使用SYBR®Green JumpStart™Taq ReadyMix™(7.5μl, Sigma-Aldrich®, S4438), the respective primer pairs (7.5 pmol, 0.75 μl-3.75 pmol/primer), and 15 μl nuclease-free H₂O (T143, Carl-Roth GmbH)，加入各自的cDNA溶液(1.5μl，稀释1:5)。我们进行了45个循环(初始热激活95℃/5 min，每个循环95℃/10 s变性，60℃/8 s退火，72℃/8 s延伸)的双链cDNA扩增。在每个延伸步骤结束时，在521 nm处检测到SYBR®Green I荧光。引物由Eurofins MWG Operon LLC(美国亨茨维尔;高纯度无盐纯化HPSF®)，未进行修改(表)1)。根据MIQE准则[如前所述他们用NCBI底漆-BLAST结构13，20.，22]。两个内参基因组合(EEF1A1和SDHA)，在研究的条件下，它们在RAW264.7巨噬细胞中稳定表达(数据未显示)。相对基因表达量计算为2^-ΔCQ同 [23，24]。对每一对引物和RT-qPCR运行时，进行无模板对照，无cDNA。

2.7。酶联免疫吸附测定（ELISA）

细胞培养物上清液储存于-80℃直至使用和在冰上解冻。ELISAs were performed with cell culture supernatants only after 4 h of mechanical strain according to the manufacturer’s instructions (Vascular Endothelial Growth Factor-A: MBS043195, Tumor Necrosis Factor-α：MBS335449，MyBioSource;前列腺素E2：MBS266212，MyBioSource;白细胞介素6：MBS335514，MyBioSource）。

2.8。统计方法

在进行统计分析之前，将所有绝对数据值除以未处理应变的对照组各自的算术平均值，得到相对于这些对照组的归一化数据值，设为1。使用GraphPad Prism 8.0(标准化)(归一化)相对基因表达在施加压力/拉力期间，包括对照组，然后使用独立的非参数双侧Kruskal-Wallis进行统计评估测试。为了在每个孵育时间(2、4、24和48 h)对对照组的压缩/张力进行统计比较，使用了Dunn多重比较后置试验。蛋白分泌数据采用独立非参数双侧Mann-Whitney分析测试。显著性水平为 。

3.结果

3.1。压力和张力处理对细胞数量和细胞毒性的影响

压缩应变对细胞存活有显著影响( ， ）和细胞毒性( ， ）的RAW264.7巨噬细胞。Compressive strain decreased cell number already after 2 h of application time significantly ( ）同a constant reducing effect up to 48 h ( ;数字图2（a）)。这与细胞毒性试验的结果一致。我们观察到在施加压力2小时后巨噬细胞内乳酸脱氢酶(LDH)的释放明显增强( ）同a maximum effect after 48 h ( ，数字2 (b))。尽管各向同性拉伸应变对细胞数量也有显著影响( ， ),直到48小时( ，数字图2（a）)。在与该行中，我们检测到的拉伸应变的施加期间中的细胞毒性没有显著变化（ ， ;数字2 (b))。

3.2。压力和张力处理对细胞外基质的巨噬细胞诱导重塑的影响

基质金属蛋白酶(MMPs)负责细胞外基质重组。巨噬细胞对压力处理的反应是增强的基因表达MMP-8after 24 h andMMP-9已经过了4小时(MMP-8： ;MMP-9： ）申请时间(MMP-8： ， ;MMP-9： ， ;数字3)。相反，拉伸应变只受影响MMP-8（ ， ）但不是MMP-9在巨噬细胞的基因表达。我们观察到在显著上升MMP-824h后基因表达( ）和48 h ( ）拉伸应变（图图3（a）)。在48小时的研究期间，我们没有观察到任何变化MMP-9在拉伸时在巨噬细胞基因表达（ ， ;数字图3（b）)。

3.3。压力和张力治疗对巨噬细胞诱导的血管生成的影响

接下来，我们研究了压缩和拉伸应变对巨噬细胞诱导的血管生成的影响。血管内皮生长因子-a (VEGF-A)负责压力区牙齿运动期间发生的血管新生和对缺氧状态的调节。压缩力应用增强Vegf-agene expression significantly after 2 h ( ),4 h ( ),及24小时( ）压力处理( ， ;数字4(一))。After 48 h of ongoing compression, there was no amplifiedVegf-a可检测到基因表达( ，数字4(一))。因此，我们检测到加压处理4小时后VEGF-A的分泌明显增强( ;数字4(一))。与此相反的压缩力，我们观察到对无拉伸应变的效果Vegf-a48h内巨噬细胞基因表达( ， ）或VEGF-A分泌( ;数字4 (b))。

3.4。压力和张力处理对促炎基因表达的影响

压缩力处理导致的上调肿瘤坏死因子α（TNF-α）gene expression already after 2 h ( ）4小时后的最大诱导量( ）在巨噬细胞( ， ;数字5(一个))。因此,肿瘤坏死因子-α4 h后分泌明显增强( ;数字5(一个))。环氧化酶-2（COX-2）gene expression was already significantly enhanced after 2 h of pressure application ( ）但从第4小时起出现了平缓的上调( ）至48小时( ）（ ， ;数字5 (b))。In line with that, secretion of COX-2 product prostaglandin E2 (PG-E2) was significantly enhanced as well after 4 h ( ;数字5 (b))。在紧张的巨噬细胞,白细胞介素-6（il - 62 h后基因表达明显诱导( ）24小时后效果最佳( ）的压缩力处理( ， ;数字5 (c))。同样，我们观察到施加压力4小时后IL-6蛋白分泌明显增强( ;数字5 (c))。类似于拉伸应变引起的稍微但显著增强基因表达TNF-α2小时后( ）及4h ( ）拉伸( ， ;数字5 (d))，在4小时后也能在蛋白水平上复制( )。与此同时，我们也观察到的基因表达增加COX-2已经过2小时( ）至48小时( ）的拉伸应变( ， ;数字5 (e))，对4 h后PG-E2分泌有显著影响( )。il - 64 h后，巨噬细胞分泌IL-6和in的基因表达明显增强(mRNA: ;分泌: ）和24h (mRNA: ）的拉伸(图5 (f))。

4。讨论

在我们的研究中，我们观察到对指示机械应变和OTM在这些细胞的介导作用模拟牙齿移动（OTM）中的巨噬细胞的表达谱的拉伸和压缩应变的影响。巨噬细胞与促炎细胞因子指示OTM在无菌免疫应答中起主要作用的增强表达反应以压缩或拉伸的机械应变相当迅速。与此相反，参与血管形成或细胞外基质重塑的基因似乎被压缩应变来大多调节。

施加压力对巨噬细胞产生依赖时间的细胞毒性作用，其表现为压力处理2小时后细胞数量减少，LDH释放增加。由于细胞毒性作用可能会影响巨噬细胞对机械应变的反应，施加压力的实验应尽可能缩短时间。随着时间的推移，细胞毒性增加对表达结果的偏倚影响不能完全排除。然而，这种细胞数量的增加和减少与实验时间相对成比例，而促炎细胞因子的上调是非常深刻的，发生的很早，在RT-qPCR中早在2h后就有意义。这表明，在2-4小时的短时间内，观察到的机械应变诱导效应最多只部分受到同时升高的细胞毒性的影响。与巨噬细胞相比，如前所述，PDL成纤维细胞(PDLF)似乎对压力处理更有抵抗力[10]。In contrast to macrophage cell number being reduced up to 80%, PDLF cell number was only reduced to 50% within 48 h of pressure application [10]。此外，巨噬细胞对压力的反应使LDH的释放增强了10倍，而PDL成纤维细胞在压力处理48小时后LDH的释放仅增加了2倍[10提示巨噬细胞对PDL中OTM过程中发生的压力的反应比PDLF更敏感。与我们的数据相反，使用人类单核细胞来源巨噬细胞的研究报告称，在循环压力施加8小时后，存活细胞达95% [25]。拉伸菌株对巨噬细胞无细胞毒性作用，48h内细胞数量仅略有减少。与巨噬细胞相比，PDLF在拉伸时由于转化生长因子的增强而出现增殖β(TGF -β)表达式7，16，26，27]。这些数据表明巨噬细胞对拉伸应变比压缩应变更有抵抗力。

PDL中的血管是OTM相关组织重构的活跃参与者，因为它们负责氧气和营养供应。我们知道，OTM导致了氧供应的变化，血管被压缩和拉伸[7，27]。VEGF-A是一种参与血管重塑和血管生成的生长因子[28]。OTM期间，新的血管和现有血管中的PDL的血管舒张的形成在压力区诱导的[29]。PDLF已知参与该反应，因为它们增强Vegf-a施加压力后24小时内的表达[14]。在我们的研究中，巨噬细胞也对压力反应增强Vegf-a基因和VEGF-A蛋白在处理2h - 4h内表达，但在拉伸时无变化。这些数据表明，在OTM过程中，巨噬细胞参与并诱导PDL压缩区血管的新生和血管生成。

正畸力影响PDL的细胞外基质，因为它们提高基质金属蛋白酶（MMP）的基因表达[7]。MMPs参与正常生理过程中细胞外基质的分解和组织重塑[30.，31]。MMPs是锌离子依赖的蛋白水解酶[30.]，在发育过程中由多种细胞产生[32]，炎性疾病，退行性关节病[33]，肿瘤侵袭[34，以及伤口愈合[31]。基质金属蛋白酶可分为几个亚群，即胶原酶(MMP-1、MMP-8和MMP-13)、明胶酶(MMP-2和MMP-9)、stromelysin、膜型基质金属蛋白酶和其他亚家族。MMP-8等胶原酶已被证实可由PDLF表达[35]，并在OTM期间在PDL的受拉区域内发生对PDLF的拉力而上调[17，而据报道，在施加压力24小时、48小时和72小时后，它们被下调[17]。我们检测到有显著的上调MMP-824小时后，巨噬细胞的压缩和拉伸应变。这与之前的研究结果一致，即机械因素可能参与巨噬细胞中MMP的表达[36]。这些数据表明，PDL中的巨噬细胞也可以影响MMP的表达，从而影响OTM。

正畸力引起无菌性炎症反应[27]。生产和促炎细胞因子，酶和组织激素包括TNF分泌α， COX-2、PG-E2和IL-6被报道参与OTM相关的组织反应[37]。正畸力的一个主要反应是由可诱导的环氧合酶isoform 2 (COX-2)合成前列腺素，如PG-E2 [11]。临床和动物研究已经确定了cox -2合成的前列腺素对骨吸收的介导作用[15，38]。前列腺素E₂尤其似乎能够介导炎症反应，并通过激活破骨细胞诱导骨吸收[39]。IL-6调节炎症中的免疫反应[39]，具有自分泌和旁分泌作用，刺激破骨细胞形成和预形成破骨细胞的骨吸收活性[40]。IL-6的功能与TNF-重叠α和il - 1β。它已经被报道，IL-6分泌在正常的人骨还可以通过IL-1被调节α/β和肿瘤坏死因子-α[39]。

我们很早就观察到TNF-α，COX-2,il - 6在巨噬细胞和TNF基因表达α巨噬细胞分泌的PG-E2和IL6在2 - 4小时内受到压力或拉力的作用。相比之下，PDLF基因表达增加COX-2和il - 6只在24小时内。我们的数据与之前研究循环压力应用于人类单核细胞来源巨噬细胞的实验一致，也显示TNF-的分泌增强α和IL-6 [25]。这些数据表明，受到机械应激的巨噬细胞合成炎症介质是对正畸压力和拉力的一种非常早期的初始反应，极有可能触发并强化了使正畸牙齿移动的生物学机制。

5.研究的局限性和可推广性

该研究让巨噬细胞正畸牙齿移动过程中发生的机械刺激的反应的第一印象。不过，也有与本研究相关的一些限制。我们使用永生化的鼠RAW264.7巨噬细胞和未骨髓衍生的巨噬细胞或人外周血单核的巨噬细胞。两种细胞类型也可用于这些实验，但在隔离和处理更加困难，并且可以根据鼠标的遗传背景或人类供体状态示区别。然而，这一事实限制了我们的研究结果具有普遍性，如复制性人PBMC是不确定的。更多的实验需要具有从关于其的机械力的反应不同来源的巨噬细胞。ELISAs were performed with cell culture supernatants only after 4 h of mechanical strain, as no additional information was expected to be gained from also testing protein expression at the other time points. From RT-qPCR results, significant differences to the untreated controls were found as early as after 4 h of mechanical strain with no major expression changes occurring thereafter. The corresponding results from both analyses after 4 h confirm that gene expression of investigated genes is reflected at the protein level—corresponding protein expression levels for the other time points studies in RT-qPCR are thus to be expected.

6。结论

我们的研究结果表明,巨噬细胞反应早期的拉伸和压缩应变发生在矫正牙齿运动(移动)和促炎细胞因子的基因表达增强,这反过来又影响PDL成纤维细胞,成骨细胞,免疫细胞和触发或增强的生物机制使增加osteoclastogenesis和移动。此外，巨噬细胞还可能在OTM过程中影响血管生成和细胞外基质重构。

数据可用性

用来支持这项研究的结果的数据是可用的，请相应的作者。

利益冲突

作者声明，本论文的发表不存在任何利益冲突。

致谢

作者要感谢伊娃Zaglauer夫人和工程硕士生物学。席鲍尔的支持。艾格尼丝施罗德和基督教Kirschneck收到来自德国科学基金会（DFG）（SCHR1622 / 1-1和KI2105 / 2-1）的资金。

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