评估Arf6删除拉钮——985年Neutrophil-Like分化细胞和小鼠中性粒细胞:对粘附和迁移的影响

文摘

化学引诱物传感、粘性和迁移是至关重要的事件的招募中性粒细胞(中性粒细胞)炎症或感染的网站。缺陷在白细胞粘附和迁移导致免疫缺陷疾病复发感染的特征。在这项研究中,我们评估Arf6在中性粒细胞粘附的作用在体外和迁移到炎症网站使用PMN-Arf6条件基因敲除小鼠(cKO)。在PMN-like拉钮- 985沉默Arf6 fMLP-mediated粘附β2整合素配体,ICAM-1和纤维蛋白原β1 /β2整合素配体纤连蛋白显著减少。此外,超表达野生型Arf6促进基底和fMLP-induced粘附固定化整合素配体,而超表达的显性负Arf6有相反的效果。使用Elane-Cre删除鼠标菌株,我们报告的Arf6删除水平炎症中性粒细胞隔绝背空气袋相比是更强的幼稚细胞从骨髓分离。在PMN-Arf6 cKO小鼠中性粒细胞的招聘到空气背袋注射LPS或化学引诱物fMLP明显减弱。受损的细胞迁移与减少的细胞表面表达CD11a和CD11b Arf6 cKO中性粒细胞。我们的研究结果强调Arf6调节中性粒细胞的活动,可能回收整合蛋白,这个妥协中性粒细胞迁移到炎症的网站。

1。介绍

多形核中性粒细胞(中性粒细胞)生成造血干细胞位于骨髓(BM) [1]。他们是先天免疫系统的关键细胞参与对病原体的第一道防线。在感觉到危险信号和炎症介质,中性粒细胞开始沿着血管壁滚动。公司通过血管内皮逮捕和轮回后,中性粒细胞迁移到炎症网站。所有这些过程涉及细胞粘附分子的分子机制(如交付和激活的中性粒细胞整合蛋白(2,3]。整合蛋白是所有哺乳动物细胞中表达。动态过程依赖于各种Rab的功能和Arf小gtpase通过endosomal回收通路调节细胞表面整合素的表达和细胞内signalling-mediated配体结合活动(4]。的β2整合蛋白LFA-1和Mac-1主要整合蛋白调节leukocyte-endothelium交互所需的中性粒细胞外渗和细菌杀死。突变共同整合素β缺2链CD18导致白细胞粘附I型,一种罕见的疾病表现为白细胞增多和复发性感染(5- - - - - -8]。然而,中性粒细胞等整合蛋白表达α4β1,α5β1,αvβ3 (9]。

事件的正确时机导致中性粒细胞的激活是通过整合外部监管的信号被跨膜受体启动许多细胞内信号通路控制的各种G蛋白包括小gtpase [10]。小gtpase切换到活跃的和不活跃的构象时绑定到三磷酸鸟苷(三磷酸鸟苷)和鸟苷二磷酸(GDP),分别。GTPase-Activating蛋白质(空白)和鸟嘌呤核苷酸交换因子(gef)特定的小gtpase调节这个周期(11]。这些小gtpase,包括那些Arf的家庭,如Arf6,在调解中扮演角色整合素由外向内和由内向外信号和关键部件调节中性粒细胞粘附动力学和迁移10,12]。Arf6与其他arf的不同之处在于,它专为质膜和endosomal隔间,似乎是源于个体蛋白质环境(13]。

Arf6已经涉及到不同的信号通路和细胞等功能重塑的肌动蛋白细胞骨架和吞噬作用14- - - - - -16]。过度Arf6或监管机构在癌症细胞的表明一个重要的角色在细胞粘附、迁移,和入侵行为(17,18]。在中性粒细胞和PMN-like细胞的表达Arf6 (HL-60或拉钮- 985骨髓白血病细胞)之前已经报道过(19,20.]。Arf6中扮演的角色N-formyl-Methionyl-Leucyl-Phenylalanine (fMLP)受体介导下游信号通路导致激活磷脂酶D(骑士)和超氧化物生产中性粒细胞或分化拉钮- 985细胞(19,20.]。的几位cytohesin(车车)家庭Arf-GEFs表达的中性粒细胞(10,20.- - - - - -23]。药物抑制CTH-1 SecinH3或沉默CTH-1抑制fMLP-mediated膜易位Arf6 Arf1和阻止Arf6激活中性粒细胞(20.]。最近的研究表明,CTH-1不同调节激活白细胞β2整合蛋白LFA-1和Mac-123,24]。

Arf6击倒在中性粒细胞粘附和迁移的影响还有待研究。Arf6损耗的终末分化人类中性粒细胞是不可能的,和Arf6基因敲除的小鼠胚胎杀伤力的结果(25]。为了规避这些问题,我们沉默Arf6 PMN-like拉钮- 985细胞粘附评价固定化整合素配体在体外,我们生成PMN-specific Arf6条件敲除小鼠(cKO)来评估中性粒细胞贩卖体内。数据表明Arf6调节中性粒细胞粘附到整合素配体纤连蛋白、纤维蛋白原和ICAM-1。我们还分析了表型PMN-Arf6 cKO老鼠。免疫印迹证实Arf6的耗竭小鼠中性粒细胞。Arf6损耗减少炎症stimulus-mediated中性粒细胞招募到空中鼠标袋和减少细胞表面的表达β2整合蛋白LFA-1 Mac-1。

2。材料和方法

2.1。试剂

RPMI 1640胎牛血清的边后卫,汉克的平衡盐溶液(hbs)磷酸盐(PBS)和EDTA是购自欧洲野牛(St-Bruno、QC、加拿大)。从Calbiochem Calcein-AM购买(美国圣地亚哥,CA)。Dibutyryl环腺苷酸(dbcAMP),N-formyl-Methionyl-Leucyl-Phenylalanine (fMLP)、二甲亚砜(DMSO),脂多糖(LPS)大肠杆菌O26: B6和纤维蛋白原买来MilliporeSigma(奥克维尔,加拿大)。ICAM-1和纤连蛋白从研发系统公司购买(明尼阿波利斯,美国)。Percoll购买从通用电气医疗集团(Baie-D 'Urfe, QC,加拿大)。重组小鼠集落刺激因子(gm - csf)和重组小鼠肿瘤坏死因子-α从生物基本购买Inc .(马坎,加拿大)和PeproTech(美国新泽西州落基山),分别。合成N-myristoylated Arf6氨基酸(2 - 13)N-myristoylated争夺肽来源于CanPeptide Inc . (Pointe-Claire、QC、加拿大)。膜联蛋白V-FITC 7-amino-actinomycin D (7 aad)买来BD生物科学(美国加利福尼亚州圣何塞)。

2.2。抗体

V450-conjugated鼠anti-mouse CD11b(克隆M1/70) PE-conjugated鼠anti-mouse CD11a(克隆2 d7),和APC-conjugated鼠anti-mouse Ly6G(克隆1 a8)马伯买来BD生物科学(加拿大在米西索加)。多克隆anti-PI3激酶p85购买从北部生物技术(泰梅库拉、钙、美国)。anti-actin抗体从MilliporeSigma购买(马坎,加拿大)。Anti-Arf6鼠单克隆IgG2b(克隆3 a - 1)是来自圣克鲁斯生物技术(美国达拉斯,TX)。

2.3。人类中性粒细胞中性粒细胞的隔离

静脉血液收集在一个健康的成年志愿者异柠檬酸抗凝剂的解决方案。中性粒细胞是准备像前面描述的那样26]。白细胞被沉淀纯化2%右旋糖酐T500删除红细胞在离心Ficoll-Paque缓冲消除单核细胞。污染红细胞被移除到20年代低渗的溶解在水中,在哈佛商学院和中性粒细胞resuspended, pH值7.4,包含1.6毫米Ca^{2 +}但没有毫克^{2 +}。

2.4。细胞凋亡的测量

人类中性粒细胞孵化表明合成的浓度N-myristoylated肽1 h在37°C。细胞凋亡是由膜联蛋白监测V-FITC染色(5μL)和流式细胞术分析使用FACSCalibur血细胞计数器(BD生物科学,米西索加、加拿大)。

2.5。细胞培养

拉钮1640年RPMI - 985细胞生长补充10% heat-inactivated的边后卫和PMN-like细胞分化的0.3毫米dbcAMP如前所述[3天23,24]。

2.6。细胞转染核和Arf6向量构造

拉钮- 985进行了细胞转染Nucleofector II (Amaxa生物系统公司、德国科隆)24 h后的分化与0.3毫米dbcAMP 3μ克Arf6核(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)或nonsilencing核工器(试剂盒,多伦多,加拿大),使用程序u - 002和我们的内部缓冲区转染如前所述26]。nucleofection后,细胞迅速转移到分化培养基(RPMI 1640补充10% heat-inactivated的边后卫和0.3毫米dbcAMP)。细胞在48 h postnucleofection监控功能。

Arf6编码序列在帧与EGFP subcloned pEGFP-N3表达载体使用EcoRI / BglII限制网站。Arf6 (Q67L)突变缺陷三磷酸鸟苷水解和Arf6 (T27N)突变所产生的缺陷在三磷酸鸟苷结合PCR扩增,和核苷酸的变化被直接测序验证。分化拉钮- 985细胞转染使用20如上所述μ克的质粒DNA。荧光绿色荧光蛋白⁺活细胞排序在48 h posttransfection使用BM FACSAria II细胞分选仪。绿色荧光蛋白⁺和7 aad^{- - - - - -}细胞被发现670 525/25 nm带通和长传球过滤器,分别使用波长488纳米的激光。GFP细胞反应监控^{- - - - - -}/ 7 aad^{- - - - - -}- - - GFP⁺/ 7 aad^{- - - - - -}分化拉钮(补充图- 985细胞。1和补充表1)。

2.7。粘附细胞外基质蛋白

一夜之间,九十六孔板被涂在4°C与1μg / mL ICAM-1, 150年μ50 g / mL纤维蛋白原,或μ在NaHCO g / mL纤连蛋白₃0.1米,pH值9.6。中性粒细胞或分化拉钮- 985细胞含有calcein-AM井和分布式( 细胞)刺激前10⁶M fMLP为30分钟37°C在黑暗中。坚持细胞细胞溶解在H₂O和数量估计使用一个标准的曲线从calcein-labeled细胞溶解产物如前所述[23,24]。

2.8。代PMN-Specific条件敲除小鼠(cKO)

Arf6-floxed老鼠一直在前面描述的(27,28]。杰克逊实验室的C57Bl / 6小鼠(美国我巴尔港)。卡尔加里保罗Kubes博士(美国,加拿大)提供了转基因Elane-Cre老鼠表达Cre重组酶的控制下中性粒细胞弹性蛋白酶(Elane)启动子29日]。Elane-Cre老鼠backcrossed C57Bl / 6小鼠。交配的Arf6-floxed老鼠Elane-Cre老鼠生成PMN-Arf6 cKO老鼠([30.- - - - - -33)和补充图。2)。老鼠基因型研究中使用包括野生型C57Bl / 6 (Cre^{- / -})、杂合的(Cre^{+ / -})和纯合子(Cre^{+ / +})Crerecombinase-expressing老鼠,老鼠Arf6-floxed (液氧^{+ / +}Cre^{- / -}),PMN-Arf6 cKO老鼠杂合的(液氧^{+ / +}Cre^{+ / -})或纯合子(液氧^{+ / +}Cre^{+ / +})Cre转基因。(年龄)- 12 - 18-week-old和sex-matched老鼠在活的有机体内和在体外实验。所有试验程序进行根据指南的加拿大委员会批准的动物保健和楚de魁北克委员会动物使用和住房。

2.9。血液细胞计数

鼠标下颌静脉血液滴收集EDTA-coated超小型电子管,和10μL的血液用于生成完整的血液公式使用scil兽医abc + +血液学分析仪(scil动物保健公司Inc .,巴里,加拿大)。

2.10。从大英博物馆净化小鼠中性粒细胞

小鼠中性粒细胞分离从性别和年龄的BM老鼠(12 - 18周)。安乐死老鼠之后,大英博物馆从3到5老鼠刷新切割股骨和胫骨的使用27-gauge针和1毫升注射器充满hbs补充10% EDTA的边后卫和1毫米。通过40 BM细胞被过滤μm细胞筛到50毫升锥形管离心机(10分钟,1 700 rpm), resuspended Percoll 45%解决方案,然后分层到一个3步骤与3毫升不连续梯度层各为55%,65%,81%等张Percoll解决方案。离心后(30分钟,1600克),中性粒细胞收集Percoll层界面的81%和65%。细胞被洗与哈佛商学院和resuspended包含0.1% BSA在哈佛商学院。细胞进一步纯化负选择使用EasySep™小鼠中性粒细胞浓缩设备根据制造商的协议(干细胞技术有限公司,公元前的温哥华,加拿大)。

2.11。空气袋实验

背侧空气袋是由皮下注射无菌空气在天0和3如前所述34]。7天,有限合伙人(500 ng), fMLP (10⁷米),或者同样体积的稀释剂(1毫升PBS)注入空气袋。老鼠被有限公司₂窒息后4 h,空气袋洗两次0.9毫升hbs含有10% EDTA的边后卫和5毫米。空气袋灌洗液体在3500 rpm,离心机和丸resuspended 2毫升灌洗的解决方案使用磨Z迷你自动细胞计数细胞计数器(美国ORFLO,凯彻姆,ID)。

2.12。rt - pcr分析

中性粒细胞的BM 5老鼠纯化,提取总RNA (~ 10⁷细胞)使用RiboZol RNA提取试剂(美国Amresco,梭伦,哦)根据制造商的协议。RNA (1μg)是反向使用RNA转录cDNA EcoDry预混料(豆类Clontech,山景城,美国)和Taq DNA聚合酶(新英格兰生物学实验室,惠特比,加拿大)。GAPDH是作为内部控制用于PCR扩增。放大条件如下:30个周期在95°C(变性,30年代),56°C(退火、30年代),和68°C(扩展,30年代)。引物序列如下:Arf6(5 - - - - - -ATCCTGTACAAGTTGAAGCTGGGC-3和5 - - - - - -CATCCCACACGTTGAACTTGACG-3 )和GAPDH(5 - - - - - -AACTTTGGCATTGTAGAAGG-3和5 - - - - - -ACACATTGGGGTTAGGAACA-3 )。

2.13。西方墨点法

蛋白质决定7.5 -20%梯度sds - page和转移到Immobilon-PSQ PVDF膜(微孔,体态、加拿大)。西方的屁股使用Arf6执行(1/200)和肌动蛋白(1/1000)或PI3激酶p85(1/1000)抗体蛋白的内部控制加载。蛋白质是可视化HRP-conjugated anti-mouse二级Ab(1/20000)和西闪电+发射极耦合逻辑检测系统(PerkinElmer,伍德布里奇,加拿大)。

2.14。分析β2整合素细胞表面表达

表示,BM中性粒细胞的被试gm - csf (100 ng / mL)和肿瘤坏死因子(100 ng / mL)为20分钟37°C和/或刺激与fMLP 15分钟在37°C的分析β2整合素细胞表面表达。中性粒细胞获得从大英博物馆和有限合伙人或fMLP-injected空气袋在100年resuspendedμ与1 L冷PBS和孵化μL (anti-CD11a、CD11b Ly6G Abs(或同形像控制免疫球蛋白)30分钟在4°C。中性粒细胞被洗两次,100年resuspendedμL冷PBSβ2整合素细胞表面表达是监测如前所述23,24]。

2.15。统计分析

数据是 至少有三个独立的实验。使用未配对的学生进行了统计分析 - - - - - -测试和单向方差分析。的值 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。Arf6调节拉钮- 985为配体的粘附β2整合蛋白LFA-1 Mac-1

药物抑制Arf-GEF CTH-1 SecinH3中性粒细胞和沉默的CTH-1 PMN-like细胞减少fMLP-induced报道反应,包括激活和招聘的Arf6质膜(20.]。CTH-1也协调激活的β1,β2整合蛋白(23,24]。然而,目前尚不清楚失调在整合素激活抑制CTH-1强调的是由于激活受损Arf6和定位错觉Arf1 SecinH3治疗和/或cytohesin的另一个成员的家庭,比如cytohesin-3表达在中性粒细胞(20.,23]。Arf6沉默在拉钮- 985细胞如前所述[20.]。如图1(一),siRNA-treated拉钮- 985细胞表现出~ 65%减少细胞内水平Arf6 nonsilencing siRNA相比,细胞转染。我们第一次调查的影响沉默Arf6人类ICAM-1固定化细胞粘附,表面粘附分子表达的内皮细胞,促进中性粒细胞粘附在血管内皮炎症外渗和迁移到网站。沉默的Arf6拉钮- 985细胞导致减少基底粘附和ICAM-1 fMLP-mediated附着力降低 相比,细胞转染nonsilencing siRNA(图1 (b))。

作为替代方法,我们是暂时性的过表达野生型Arf6-GFP, dominant-positive Arf6-GFP (Q67L)和显性负Arf6-GFP (T27N)拉钮- 985细胞。使用此策略,高达50%的细胞GFP阳性(GFP⁺)(补充图。2)。然而,没有一个结构有任何检测影响粘附ICAM-1 GPP的种群混合⁺和GFP-negative (GFP^{- - - - - -})拉钮- 985细胞被使用(数据没有显示)。为了规避这个问题,GPF⁺流式细胞仪细胞分类。拉钮- 985表达野生型Arf6-GFP相比,更可行的细胞(GFP⁺/ 7 aad^{- - - - - -})表达显性负Arf6筛选后得到(补充表1)。此外,fMLP-induced粘附ICAM-1相比减少nonsorted拉钮- 985细胞(数据未显示)。然而,基底和fMLP-mediated粘附ICAM-1是增强细胞中表达野生型Arf6-GFP(图1 (c))。相比之下,拉钮- 985细胞表达显性负Arf6坚持不佳相比,固定化ICAM-1细胞表达野生型Arf6-GFP,分别(图1 (c))。

而激活的β2整合素LFA-1所需CTH-1在中性粒细胞,CTH-1报道抑制fMLP-mediated激活β2整合素Mac-1在中性粒细胞(23]。CTH-1不同的分子机制调节LFA-1和Mac-1整合蛋白没有被调查,但可能涉及Arf6。要测试这个可能性,我们评估的影响沉默Arf6拉钮- 985细胞的粘附在纤维蛋白原,Mac-1整合素配体。基底和fMLP-mediated粘附在细胞纤维蛋白原下降了~ 50%为Arf6沉默相比,拉钮- 985细胞治疗或没有消音器负控制核(图1 (d)),从而表明CTH-1并不限制通过Arf6 Mac-1信号的激活。

第三种方法,我们也试图使用合成抑制Arf6 myristoylated Arf6N末端肽(35]。然而,Arf6抑制肽的浓度或控制myristoylated炒肽高于1μM细胞毒性为中性粒细胞(补充图。3)。当使用1μ米,Arf6 fMLP-induced中性粒细胞粘附抑制肽没有影响固定化β2整合素配体(补充图。3)。

3.2。抑制Arf6信号减少固定化细胞粘附纤连蛋白

在接下来的一系列的实验,我们监测的影响沉默Arf6 fMLP-mediated拉钮固定纤连蛋白- 985细胞粘附,aβ1 /β2整合素配体。如图2(一个)纤连蛋白、基底粘附是减少Arf6-silenced拉钮- 985细胞。Arf6击倒也减少细胞粘附fMLP-mediated增长62%相比,细胞转染与控制nonsilencing核(图2(一个))。的影响overexpressing Arf6-GFP(野生型、dominant-positive和显性负)在拉钮- 985细胞粘附纤连蛋白也被调查。GFP转染效率(40至50%⁺细胞)是不足以影响基底或fMLP-induced粘附纤连蛋白(数据没有显示和补充图。2)。因此,拉钮- 985细胞overexpressing野生型Arf6和显性负Arf6被流式细胞仪进行排序。超表达的野生型Arf6-GFP显著增加基底和fMLP-mediated粘附纤连蛋白相比,控制GFP^{- - - - - -}细胞(图2 (b))。拉钮- 985细胞的粘附表达显性负Arf6相比,可大大降低纤连蛋白细胞表达野生型Arf6(图2 (b))。

3.3。LFA-1和Mac-1表达式BM-Extracted中性粒细胞在Arf6 cKO小鼠模型

拉钮- 985细胞的转染和可以作为替代细胞研究中性粒细胞的功能。然而,这些细胞不具备二次颗粒和表达CD11b水平低,与中性粒细胞,刺激dbcAMP-differentiated拉钮- 985细胞fMLP不会增加细胞表面表达CD11b [36]。由于完成生殖系删除Arf6胚胎致死(25),一个可能的途径研究Arf6是使用特定的鼠标的功能Cre菌株在中性粒细胞专门摧毁Arf6。为了实现这些目标,Arf6-floxed老鼠了Elane-Cre老鼠表达Cre重组酶的控制下粒细胞弹性蛋白酶启动子(29日]。图3(一个)显示外周血粒细胞计数在PMN-Arf6 cKO老鼠轴承(液氧^{+ / +}Cre^{+ / -})或两个Cre重组酶转基因产品(液氧^{+ / +}Cre^{+ / +})是相同的Arf6-floxed (液氧^{+ / +})和纯合子Elane-Cre(Cre^{+ / +}老鼠)。

中性粒细胞从大英博物馆纯化使用Percoll密度梯度immune-magnetic -浓缩紧随其后。量化的Ly6G⁺CD11b⁺细胞流式细胞仪Percoll后密度梯度表示,84.4%的细胞中性粒细胞。中性粒细胞纯度达到99.9%后-浓缩步骤(图3 (b))。监控Arf6基因记录使用qPCR表明Arf6 mRNA水平下降了~ 36% ~ 40%,分别在BM-derived从小鼠中性粒细胞轴承(液氧^{+ / +}Cre^{+ / -})或两个(液氧^{+ / +}Cre^{+ / +})Cre重组酶等位基因相比,中性粒细胞从控制Arf6-floxed纯化小鼠(图3 (c))。数据显示,完成删除Arf6 BM-derived没有实现的中性粒细胞Elane-Cre鼠标的压力。我们下一个评估β2整合素细胞表面表达BM-derived各种控制和中性粒细胞Arf6 cKO老鼠。未灌注的和gm - csf - / TNF-primed中性粒细胞刺激或不是fMLP之前监测LFA-1和Mac-1通过流式细胞术使用CD11a CD11b抗体,分别。不管老鼠基因型,BM-derived中性粒细胞LFA-1表达了类似的水平(图4(一))。此外,刺激fMLP启动和gm - csf /肿瘤坏死因子或其组合对LFA-1的水平没有显著影响细胞表面表达(图4(一))。相比之下,刺激与fMLP或启动与gm - csf / TNF Mac-1的增强的表面表达。gm - csf /肿瘤坏死因子启动的综合效应和fMLP刺激表面接触Mac-1添加剂。然而,没有差别在Mac-1表面表达BM Arf6-cKO老鼠相比,中性粒细胞液氧^{+ / +}或者是Cre^{+ / +}应变(图4 (b))。

3.4。招募中性粒细胞的空气袋Arf6 cKO老鼠

我们也评估的水平Arf6在炎症性中性粒细胞招募到小鼠的空气袋4 h 500 ng有限合伙人的接受。相对于控制液氧^{+ / +}Cre^{- / -}老鼠,中性粒细胞招募到空气袋液氧^{+ / +}Cre^{+ / +}老鼠~ 65%减少Arf6蛋白表达(图5(一个))。接下来的实验评估的影响Arf6删除招聘的中性粒细胞与intrapouch注射LPS或fMLP发起的。收集细胞注射后4小时炎症趋化因子,快速崛起的时候,就在中性粒细胞招聘的高峰期在小鼠模型(34,37]。一方面,LPS-mediated招募中性粒细胞的空气袋液氧^{+ / +}Cre^{+ / +}老鼠是显著降低39%,不受影响液氧^{+ / +}Cre^{+ /- - - - - -}小鼠相比液氧^{+ / +}控制(图5 (b))。减少中性粒细胞招募在响应fMLP intrapouch注入的。然而,fMLP-mediated中性粒细胞招募到空气袋液氧^{+ / +}Cre^{+ / +}老鼠降低了40%,在中性粒细胞计数之间没有区别液氧^{+ / +}Cre^{+ / -}和液氧^{+ / +}组(图5 (c))。相比之下,中性粒细胞招聘由intrapouch注射LPS或者fMLP不是野生型和之间的不同Cre转基因组(补充无花果。4和4 b)。

我们下一个评估通过流式细胞仪的细胞表面表达LFA-1和Mac-1空气袋中性粒细胞。中性粒细胞从野生型、杂合的和纯合子Cre转基因小鼠迁移,以应对intrapouch注射LPS或fMLP显示类似水平的CD11a和CD11b表达式(补充无花果。4摄氏度和4 d)。综上所述,这些数据表明,细胞表面的表达β2整合蛋白不改变小鼠的表达Cre转基因。然而,中性粒细胞招募了反应注射LPS或fMLP空气袋液氧^{+ / +}Cre^{+ / +}老鼠表现出低水平的细胞表面CD11a相比液氧^{+ / +}Cre^{+ / -}和液氧^{+ / +}动物(数据5 (d)和5 (e)左面板)。细胞表面的表达CD11b也减少空气袋的中性粒细胞液氧^{+ / +}Cre^{+ / +}老鼠(图5 (d)和5 (e),对面板)。,数据显示,减少中性粒细胞迁移到网站的炎症Arf6 cKO老鼠轴承两种Cre转基因与删除Arf6走强和减少细胞表面表达的β2整合蛋白。

4所示。讨论

Arf6定位到质膜在细胞,细胞溶质,endosomal隔间。Arf6调节胞外分泌,各种受体的内吞作用,回收endosomal回收途径和重构的肌动蛋白细胞骨架38]。这些细胞过程影响细胞运动、细胞分裂,吞噬作用,胆固醇体内平衡(39- - - - - -42]。细胞迁移是必不可少的白细胞炎症(网站的招聘5]。我们之前报道,Arf-GEF cytohesin-1 (CTH-1)控制Arf6激活,吞噬作用β1,β2-dependent中性粒细胞的粘附内皮细胞或固定化整合素配体(23,24]。然而,我们所知的生物学功能在中性粒细胞Arf6整合素激活炎症和招聘网站仍然稀少。我们的研究结果表明,Arf6调节中性粒细胞粘附ICAM-1,纤维蛋白原,纤连蛋白。结果在PMN-specific Arf6条件敲除(PMN-Arf6 cKO)小鼠表明消融Arf6减少中性粒细胞趋化现象的肽,LPS-mediated招聘到空气袋。招募中性粒细胞减少到空气袋与细胞表面的表达减少β2整合蛋白Mac-1 LFA-1。

Arf6调节粘附和吞噬作用通过控制细胞表面的表达β1整合蛋白[43- - - - - -45)和俱乐部γ受体(46),分别。通过调节的交付β1整合素通过回收核内体回到质膜,Arf6坐标细胞粘附、迁移、和癌症细胞入侵(17,47- - - - - -49]。删除在内皮细胞破坏肝细胞生长factor-stimulated Arf6β1整合素回收,药物抑制Arf6-GEF抑制肿瘤血管生成和增长27]。在许多情况下,Arf6活动的抑制或沉默Arf6导致胞内保留和积累β1整合素和导致减少细胞粘附和迁移27,43,50]。虽然α4β1,α5β1整合蛋白纤连蛋白受体的功能,应该强调,纤连蛋白也被报道是一个β2整合素配体(51- - - - - -53]。未来的研究应该确定Arf6损耗影响的表面表达和回收β1整合素Arf6 cKO中性粒细胞。

一些中性粒细胞功能受到Arf6监管包括脱粒[20.],NADPH氧化酶活性[19,20.],吞噬作用[23),和趋化性23]。击倒的Arf6选择性GEF CTH-1有相反的影响中性粒细胞整合素功能,抑制LFA-1-dependent附着力,提高Mac-1,α4β1 -,α5β1-dependent粘附[23,24]。然而,的能力CTH-1 LFA-1诱导激活,抑制中性粒细胞的整合素活动不能归咎于Arf6有两个原因。首先,过度ICAM-1 Arf6增强附着力,纤维蛋白原,纤连蛋白。第二,显性负Arf6或沉默Arf6废除和减少绑定固定化整合素配体,分别。尽管抑制CTH-1对活跃水平没有影响Arf1 fMLP,我们以前显示的招聘Arf1膜明显受损(20.]。它不是排除Arf1会影响附着力的定位错觉,细胞分化和整合素fMLP-induced期间聚集和激活中性粒细胞趋化作用[44,54- - - - - -56]。

转基因小鼠表达Cre重组酶修复启动子的控制下,如中性粒细胞白明胶酶(GE-Cre或Elane-Cre),溶菌酶(LysM-Cre),或者MRP8 (MRP8-Cre)被用来摧毁一个基因在中性粒细胞(30.]。LysM-Cre和GE-Cre在中性粒细胞和巨噬细胞生成条件基因敲除,而MRP8-Cre对中性粒细胞是更有选择性。此外,Cre介导删除效率是部分和根据不同组织中白细胞纯化(30.]。白明胶酶缺失的中性粒细胞损害宿主免疫力但没有炎症的影响中性粒细胞招聘网站(32]。在这项研究中,Elane-Cre老鼠被用来诱导Arf6在中性粒细胞缺乏。在Arf6-cKO老鼠,我们观察到Arf6 mRNA水平BM中性粒细胞下降了约40%,删除效率不是不同的老鼠之间有一个或两个Cre等位基因。此外,没有显著减少内源性Arf6蛋白质的水平可以达到在BM中性粒细胞(数据没有显示)。这最有可能解释了为什么fMLP-mediated细胞表面的表达β2整合蛋白在控制和gm - csf - / TNF-primed细胞Arf6-cKO中没有降低中性粒细胞分离从大英博物馆。BM中性粒细胞是天真和部分未成熟的细胞。更有效的删除Arf6成熟检测不到发炎和迹象的中性粒细胞不能排除但不容易评估由于低水平的循环在小鼠中性粒细胞。因此,我们评估了表型的中性粒细胞招募到空中鼠标袋后注射fMLP或有限合伙人,已知两个受体激动剂激活受体与Arf6活化和信号(19,20.,35]。水平的内生Arf6耗尽了约65%的空气袋的中性粒细胞Arf6 cKO老鼠表达两种Cre等位基因。删除Arf6与中性粒细胞减少招聘到空气袋以应对fMLP或有限合伙人和减少表面的表达LFA-1和Mac-1炎性中性粒细胞。综上所述,删除的数据表明,Arf6影响招募中性粒细胞炎症网站通过整合素细胞表面表达的调制和活动。Arf6淘汰赛是不完整的,可能不均匀中性粒细胞内耗尽。这可能意味着炎症可能会间接的空气袋模型支持的招募中性粒细胞Arf6部分耗尽。此外,功能可能存在冗余的Arf小gtpase [56]。

Arf6整合素影响活动的机制仍有待调查。抑制Arf6 Arf6或沉默的中性粒细胞减少骑士激活和颗粒胞吐(20.]。Phosphoinositol-4-phosphate-5-kinase也是一个下游效应器Arf6 [57]。骑士和phosphoinositol-4-phosphate-5-kinase导致的规定β1,β2整合素功能在各种白细胞(58- - - - - -60]。在中性粒细胞胞内LFA-1驻留在二次颗粒和高度exocytosable白明胶酶可怜的颗粒,而Mac-1被确认在分泌小泡,在白明胶酶和二次颗粒(61年,62年]。Arf6 cKO中性粒细胞代表另一种模型来理解Arf6调节整合素的动态回收和保留在核内体和颗粒/泡数量。

总之,我们的数据突出显示Cre炎性中性粒细胞介导删除Arf6更有效的与他们的天真的BM同行相比。删除Arf6降低中性粒细胞粘附整合素配体和迁移到网站的炎症。Arf6 cKO中性粒细胞可以用来解剖Arf6如何影响炎症介质的传感,细胞极性在迁移过程中,和其他功能响应。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果中包括文章和文件的补充信息。本文的数据没有显示可从相应的或第一作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这个项目是由加拿大卫生研究院的科研资助研究(拖把- 119494)和加拿大创新基金会的贡献(25601项目)。

补充材料

补充表1:可行的细胞(7 aad的数量^{- - - - - -})绿色荧光蛋白⁺和绿色荧光蛋白^{- - - - - -}拉钮- 985细胞复苏后48 h posttransfection后排序。补充图1:GFP的表达结构通过流式细胞仪分析48 h posttransfection拉钮- 985细胞。补充图。2:代PMN-Arf6条件KO小鼠和老鼠基因型用于这项研究。补充图3:N-myristoylated Arf6抑制肽诱导细胞凋亡,noncytotoxic抑制肽的浓度并不抑制fMLP-induced中性粒细胞粘附。(一)人类中性粒细胞被孵化的N-myristoylated Arf6抑制肽和炒1 h在37°C肽,细胞凋亡是确定材料和所述方法( ,一式三份测量)。(罪犯)Calcein-labeled中性粒细胞被孵化的抑制或炒肽(1μ米)1 h与fMLP之前刺激(10⁶米)30分钟。(B)粘附固定化ICAM-1 ( 独立进行实验一式三份)。(C)粘附固定化纤维蛋白原( 独立进行实验一式三份)。(D)粘附固定化纤连蛋白( 独立进行实验一式三份)。补充图。4:中性粒细胞迁移到空气袋和细胞表面的表达β2整合蛋白在空气囊的小鼠中性粒细胞轴承一个或两个Cre转基因产品。大量的中性粒细胞招募到鼠标空气袋注射有限合伙人(A)或(B) fMLP 4 h监控(PBS 老鼠;有限合伙人: - - - - - -46个老鼠;和fMLP - - - - - -36老鼠)。(C) Ly6G⁺细胞被封闭的评估细胞表面表达CD11a(左面板)和CD11b(右面板)中性粒细胞招募到空中鼠标袋注射LPS ( 老鼠)。(D)的细胞表面表达CD11a(左面板)和CD11b(右面板)中性粒细胞招募到空中鼠标袋注射fMLP ( - - - - - -10老鼠)。(补充材料)

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