mir - 135 a减轻Silica-Induced针对NF -肺纤维化κB /炎症信号通路

文摘

硅接触触发炎症反应和肺纤维化是一种严重的职业或环境肺部疾病,没有有效的治疗方法。复杂的生理和分子机制silica-induced肺损害尚未完全了解。mir - 135 a抑制炎症、细胞凋亡和肿瘤细胞增殖。但miRNA135a的角色参与silica-induced肺损害在很大程度上仍未知。我们调查了角色和mir - 135——一个潜在机制silica-induced肺纤维化。目前研究表明硅接触引起mir - 135水平的减少,但增加炎症介质。转导的慢病毒表达mir - 135 a减少炎症介质水平从silica-treated小鼠肺组织,改善肺纤维化符合表达下调αsma但增强钙粘蛋白。此外,mir - 135 a超表达抑制肺组织p-p65水平。过度的mir - 135 a抑制剂加强TLR4和NF -蛋白质水平κB在BEAS-2B细胞活化。的抑制剂注入PDTC NF -κB,进一步强化了mir - 135 - a -介导的改进硅引起的炎症和肺纤维化。集体数据显示mir - 135 a抑制NF -κB可能通过激活目标TLR4缓解silica-induced炎症反应和肺纤维化。

1。介绍

暴露的石英(二氧化硅)几个月能引起矽肺病,严重的全球职业或环境肺部疾病没有有效的治疗方法(1]。矽肺患者的流行病学研究表明,更容易患肺结核和自身免疫性疾病(2,3]。吸入二氧化硅导致自由微小颗粒的吞噬作用活化的巨噬细胞和上皮细胞在肺组织中触发炎症介质的释放4]。炎症反应导致epithelial-mesenchymal过渡(EMT),刺激纤维母细胞增殖和细胞外基质(ECM)沉积的生产,如I型胶原蛋白(Col1) [5- - - - - -8]。ECM的过度沉积导致进步巨大肺纤维化和损害呼吸功能(9]。主要组织病理学特点潜在矽肺病很调查。然而,复杂的生理和分子机制参与肺损害尚未完全了解。

小分子核糖核酸(microrna)的一类内源性短单链第22 - 25非编码rna的核苷酸长度,在大多数真核细胞是守恒的。主microrna (pri-miRNAs)最初是基因组的转录和裂解microrna的前身(pre-miRNAs)包含大约70个核苷酸。可以出口到这些pre-miRNAs细胞质的地方进一步裂解生成成熟的microrna。microrna能组装成RNA-induced沉默复杂(RISC)和指导enzyme-containing复杂目标信使核糖核酸(mRNA)序列,基因表达的差别导致对这些目标的乳沟mRNA和/或抑制他们的翻译。microrna来自1 - 5%的人类基因组负责沉默超过30%的蛋白编码基因。许多非编码microrna参与生理过程,和他们的异常表达会影响一些病态,包括传染病、癌症、神经退行性疾病。一些证据显示功能障碍的microrna在肺纤维化10,11]。mir - 135 a展览表达下调表达在某些疾病和癌症,及其upregulation可以抑制炎症、细胞凋亡和癌症细胞增殖(12- - - - - -14]。mir - 135 a也可以抑制心肌纤维化(15),但加剧肾纤维化在糖尿病肾病16]。mir - 135 a antigen-exposed肺的表达增加,致敏小鼠(17]。mir - 135 a促进肺组织的炎症反应,野百合碱(MCT)诱导肺动脉高血压(PAH)在大鼠(18,19但抑制肺癌细胞的迁移和入侵(20.]。然而,角色和mir - 135 a的分子机制silica-induced肺损害仍有待探讨。

巨噬细胞吞噬作用的二氧化硅粒子对肺部的炎症反应是至关重要的。B类清道夫受体(SR-B1)巨噬细胞识别和缆索二氧化硅粒子的等离子体膜然后导致后续规范NLRP3 inflammasome激活(21]这不仅需要核因子κB - (NF -κB -)介导upregulation NLRP3连同pro-IL-1b还多个蛋白质的组装包括NLRP3, ASC, pro-caspase-1激活caspase-1 [22,23]。NF -κB和inflammasome需要激活silica-induced肺部炎症和肺纤维化(24- - - - - -26]。NF -κB是一个家族的转录因子与抑制剂和同事,我κB如果条件下蛋白质。我κNF - B单元界限κB到细胞质和抑制它绑定目标基因的启动子区域。快速转录因子,NF -自由κB亚基当分离的抑制剂可以把从细胞质到核促进基因转录响应刺激或压力(27,28]。增强的肿瘤坏死因子-的生产α(肿瘤坏死因子-α),炎症介质中扮演关键角色的发展silica-induced肺损伤(29日),先于inflammasome激活响应硅在肺部。激活TNF -α受体是涉及我的泛素化和退化κB (30.,31日]。激活NF -κB可以绑定到基因的启动子区域包括TNF -α和胶原蛋白在肺的老鼠暴露于二氧化硅(25,32,33]。toll样受体4 (TLR4)是一种蛋白质,这种蛋白质在人类由TLR4基因编码。激活的激活NF - TLR4的结果κb因为NF -κB在silica-induced肺损伤的发病机制中扮演重要角色,它一直被视为一个潜在的目标削弱肺部损伤后硅接触(26,34,35]。然而,目前尚不清楚microrna调节NF -κB通路silica-induced肺纤维化。

在目前的研究中,mir - 135——一个被确认在肺组织中表达下调炎症介质的表达显著增加硅接触。转导的慢病毒表达mir - 135 a的肺组织炎症介质的表达减少silica-treated老鼠和提高了silica-induced肺纤维化。mir - 135在肺组织过度降低p-p65和TLR4硅接触。此外,沉默内生mir - 135显著增加了TLR4蛋白质水平的激活和增强NF -κB通路BEAS-2B细胞。相比之下,mir - 135 a的超表达相反对TLR4蛋白质和NF -激活的影响κB在BEAS-2B细胞。的抑制剂注入PDTC NF -κB,进一步加强mir - 135 - a -介导的提高二氧化硅引起的炎症和肺纤维化。综上所述,我们的数据表明,mir - 135——这是抑制硅吸入缓解肺纤维化后通过针对TLR4抑制NF -κB通路。

2。材料和方法

2.1。动物

雄性C57BL / 6小鼠的实验动物设施安置在湖南SJA实验动物有限公司有限公司依法所有动物实验进行指导的护理和使用实验动物。诱导肺纤维化的二氧化硅曝光,雄性老鼠C57BL / 6(6)是用戊巴比妥钠麻醉(美国Sigma-Aldrich)通过腹腔内注射;然后,小鼠气管内的灌输与50μl生理盐水含有二氧化硅或没有粒子悬浮(美国Sigma-Aldrich 50毫克/公斤)。老鼠牺牲硅滴剂4周后,收集和肺组织进行分析。PDTC治疗的小鼠腹腔注射PDTC(美国Sigma-Aldrich 100毫克/公斤)或生理盐水每天一次从第一天到21天。

2.2。肺纤维化的苏木精和伊红染色和评估

一夜之间,肺组织被固定在4%多聚甲醛在4°C,然后与石蜡嵌入。五μ米厚的部分连续削减然后用苏木精和伊红染色())来评估肝纤维化的严重程度。简而言之,肺部分与二甲苯deparaffinized然后水化下行酒精系列。部分简要洗在蒸馏水和哈里斯的苏木精染色方案(美国Sigma-Aldrich) 10分钟之后,在自来水清洗5分钟。部分酸浸泡在1%酒精连续30秒和洗水去除多余染料的部分然后蘸氨水和自来水冲洗。在eosin-phloxine复染色的部分解决方案30 - 60秒,通过梯度酒精脱水升序和二甲苯的清除。细胞核应该是蓝色但细胞质粉红色到红色的部分。

肺纤维化的严重程度评估根据先前描述的方法(36];得分系统从0(正常的肺)到4(字段)的总纤维闭塞是受雇于肺样本。意味着纤维化评分与六个随机测量单个字段在每一个部分。

2.3。实时定量聚合酶链反应

肺组织中提取总RNA,试剂盒试剂(美国热)。互补脱氧核糖核酸合成HiFi-Script cDNA合成设备(CoWin生物科学,中国)根据指令。实时PCR与SYBR绿色PCR进行主混合(美国热)。为每个目标基因引物和探针的浓度(mir - 135 a和炎症介质)根据指令进行优化。β肌动蛋白基因作为参考控制。基于2相对基因表达进行了分析^{- - - - - -ΔΔt}方法(37]。对于每一个肺组织,目标基因检查一式三份。所有的引物序列为目标基因(表所示1)。

2.4。免疫荧光

在肺组织染色部分进行了如前所述[38]。10μm cryosections被封锁,5%正常山羊血清PBS中含0.05% Triton x - 100 1小时(h)在室温下(RT)。然后部分被孵化与钙粘蛋白抗体(ab11512 Abcam)、波形蛋白(# 3932,CST),或αsma(14-9760-82,英杰公司)在一夜之间在4°C。与PBS洗涤后,部分被孵化与FITC-conjugated二级抗体在室温下1 h。正常血清作为消极的控制。荧光信号检测使用尼康Eclipse E600荧光显微镜(尼康,东京,日本)。代表图像捕获至少15随机地区的失明的方式为每个实验,并使用ImageJ平均强度进行了分析软件(可用https://rsb.info.nih.gov/ij/美国,马里兰州贝塞斯达)。细胞核与DAPI染色在PBS(分子探针)10分钟。

2.5。免疫印迹

蛋白质的表达水平的变化在小鼠肺组织被免疫印迹检测。简而言之,肺组织被单一化裂解缓冲(里帕裂解缓冲:25毫米Tris-HCl pH值7.5,150毫米氯化钠,NP-40 1%, 1毫米EDTA与1毫米PMSF pH值8.0,1毫米Na₃签证官₄和蛋白酶抑制剂(Cocktail-P2714σ))。蛋白溶解产物(30 ng)受到了sds - page凝胶。然后从凝胶转移蛋白质PVDF膜。5%脱脂牛奶的膜被封锁TBST三(20毫米- - - - - -盐酸、150毫米氯化钠和0.05% tween-20)和孵化anti-p65抗体(ab16502 Abcam) anti-p-p65抗体(ab86299 Abcam), anti-TLR4抗体(19811 - 1 - ap, ProteinTech) anti-p-IKBα(ab133462 Abcam), anti-IKBα(ab32518 Abcam), anti-p-IKKα(ab38515 Abcam), anti-IKKα(ab32041 Abcam),或者反β肌动蛋白抗体(60008 - 1 - ig ProteinTech)一夜之间在4°C。然后,相应的二次抗体(1:5000年,ProteinTech)共轭与合在室温下申请了90分钟。膜被暴露于发射极耦合逻辑(# 6883 CST烽火™发射极耦合逻辑)。分析了乐队的ImageJ软件。规范化的目标蛋白质的水平β肌动蛋白。

2.6。慢病毒载体系统

pri - mir - 135 a或消极的控制序列插入到pGCsil-GFP向量(GENECHEM)来生成一个lentivirus-mediated mir - 135 a构造(lv - mir - 135 a)和慢病毒控制向量(LV-control)。病毒包装过程如下。在细节,lv - mir - 135 - a或LV-control构造(20μ1.0 g)与菲尔普包装向量(15μ(10 g)和菲尔普2.0信封向量μg)是cotransfected HEK293T细胞使用Lipofectamine 2000(表达载体)。培养基是由超速离心法收集和集中后48 h的转染。该病毒被整除,储存在-80°C。最后的慢病毒的效价 。

2.7。慢病毒转导的肺组织

为期6个月的老鼠(旧)中被戊巴比妥钠麻醉,气管内的灌输与60μl LV-control或lv - mir - 135 a ( )。十四天后,老鼠接受二氧化硅或盐水。肺组织被治疗后3周后进行分析。

2.8。BEAS-2B细胞培养和转染

1640年10%的边后卫BEAS-2B细胞培养介质。hsa - mir - 135 a模仿(50 nM)或抑制剂(100海里)转染到细胞Lipofectamine 2000(英杰公司)根据制造商的说明进行DNA质粒。

2.9。统计数据

所有的数据都表示为 。分析使用GraphPad Prism 5.0 (GraphPad软件,圣地亚哥,CA)。组之间的差异计算使用单向方差分析测试。mir - 135 a表达的相关性与纤维化严重程度使用皮尔逊相关检查。一个值< 0.05被认为是统计学意义。

3所示。结果

3.1。硅诱导小鼠肺纤维化

mir - 135 a心中有antifibrosis效果(15]。为了调查mir - 135的作用(s) - silica-induced肺纤维化,老鼠是灌输与硅诱导气管内的肺纤维化。他染色表现出更多的严重纤维化肺部分硅滴剂后28天,相比与控制(图1(一))。我们采用分级数值刻度0 - 4确定肺纤维化的严重程度(36]。范围0表示没有纤维化,但规模1到4代表光强烈的纤维化。肺部纤维化的分数是高得多的部分从小鼠暴露于二氧化硅比控制老鼠表现出规模0纤维化(图1 (b))。

二氧化硅引起上皮细胞减少,但增加肺间质细胞。我们发现全球低钙粘蛋白的表达,一种上皮细胞标记(图1 (c))。这些数据表明硅滴剂导致肺纤维化。

3.2。减少表达mir - 135 a Silica-Instilled小鼠的肺组织

rna提取检测mir - 135 a的表达和炎症介质包括IL-1b, TNF -αTGF -β和干扰素-γ在肺组织控制和silica-instilled老鼠用实时定量荧光PCR (QF-PCR)。发现,il - 1的水平,TNF -αTGF -β和干扰素-γ在silica-instilled显著调节肺(数据2(一个)- - - - - -2 (d)),表明silica-induced肺纤维化的炎症反应。然而,mir - 135 a的表达更低硅接触后肺组织,相比控制(图2 (e))。此外,mir - 135表达显示高与分数水平成负相关的肺组织纤维化的硅滴剂(图2 (f))。这些数据表明mir - 135 a可能抑制对silica-induced肺纤维化的影响。

3.3。mir - 135在肺组织修复减弱肺纤维化

因为二氧化硅滴剂显著降低肺和mir - 135 a的表达可能抑制silica-induced肺纤维化,我们下一个中mir - 135 a在肺部气管内的滴剂的慢病毒携带mir - 135 a或控制基因决定的角色在肺纤维化mir - 135 a。老鼠被暴露于二氧化硅后14天慢病毒滴注法。肺组织分析了硅接触后21天。mir - 135 a水平肺后显著增加lv - mir - 135 a的滴剂,相比LV-Ctrl滴剂和mir - 135 -一个表达下调后硅接触(图3(一个))。他染色显示严重silica-induced纤维化肺部分从老鼠过表达基因的控制。但silica-induced纤维化减轻小鼠的肺中mir - 135 a(图3 (b)),这是符合纤维化的定量数据显示一个较低的分数mir - 135 - a -中老鼠,老鼠相比,控制硅接触后(图3 (c))。

纤维化被标记的表达进一步评估肺上皮细胞或间充质细胞的部分。恢复mir - 135 -钙粘蛋白表达升高和降低αsma表达后硅滴剂(数字3 (d)和3 (e))。然而,波形蛋白硅接触(图后没有显示出明显的变化3 (f))。这些集体数据显示mir - 135 a恢复减轻silica-induced肺纤维化。

3.4。mir - 135在肺组织修复变弱Silica-Induced肺纤维化的炎症反应

炎症介质的表达被QF-PCR进一步监控。IL-1b一致,表情,TNF -αTGF -β和干扰素-γ二氧化硅后显著增加,但他们的表达显示弱很多mir - 135 - a -中肺,而控制老鼠后硅接触(图4),表明mir - 135 a恢复变弱silica-induced肺纤维化的炎症反应。

3.5。mir - 135 a恢复在肺组织中抑制NF -κB信号Silica-Induced肺纤维化

NF -κB信号通路在silica-induced纤维化加剧炎症反应;世行结果显示增加p-p65, NF -的一个组成部分κ复杂,在肺硅接触。mir - 135 a超表达减少p-p65水平硅滴剂后,控制老鼠相比(数字5(一个)- - - - - -5 (c))。激活TLR4 (toll样受体4)导致增加p-p65,和硅接触导致TLR4的增加,但mir - 135超表达TLR4水平下降(数字5(一个)和5 (d))。虽然没有预测目标网站mir - 135 - 3UTR TLR4和NF -κ组件使用TargetScan版本6.0,我们获得应用和功能丧失实验策略调查mir - 135 a是否调节TLR4的表达和NF -κB组件。转染的mir - 135 a抑制剂BEAS-2B细胞沉默内生mir - 135 -调节TLR4蛋白水平的激活和增强NF -κB通路。相比之下,转染的hsa - mir - 135 a为BEAS-2B细胞TLR4蛋白质和NF -相反的影响κB激活(数据5 (e)- - - - - -5(左))。这些数据表明mir - 135 a抑制NF -κB可能激活通过针对TLR4 silica-induced肺纤维化。

3.6。抑制NF -κB改善mir - 135 - a -介导的保护对Silica-Induced肺纤维化的影响

自NF -κB激活促进silica-induced炎症和纤维化,我们进一步研究了mir - 135 a是否削弱了炎症和纤维化的监管NF -κB激活。Silica-induced纤维化发现mir - 135 - a - PDTC过表达小鼠腹腔内注射后,NF -的抑制剂κB信号。p-p65和TLR4显示低得多的老鼠当mir - 135 a超表达PDTC治疗相结合,与生理盐水组(数据相比6(一)- - - - - -6 (d))。一致,mir - 135 a超表达抑制silica-induced纤维化。PDTC治疗进一步阻碍了纤维化发展mir - 135 a -过表达小鼠(数字6 (e)和6 (f))。和抑制纤维化的PDTC符合进一步升高钙粘蛋白的表达,但进一步的抑郁水平αsma mir - 135 - a -过表达小鼠PDTC注入(数字6 (g)和6 (h))。PDTC注射没有影响(图波形蛋白表达6(我))。因此,抑制NF -κB改善mir - 135 - a -介导的保护对silica-induced肺纤维化的影响。

3.7。抑制NF -κB改善mir - 135 a的抗炎效应Silica-Induced肺纤维化

Silica-induced炎症也发现mir - 135 - a -过表达后小鼠腹腔内注射PDTC。PDTC治疗升高mir - 135 -一个表达式(图7(一))。炎症介质的表达、IL-1b TNF -αTGF -β和干扰素-γ被削弱mir - 135 - a -过表达小鼠后硅接触。他们的表达水平进一步降低PDTC注射后mir - 135 - a -过表达小鼠(数据7 (b)- - - - - -7 (e)),表明抑制NF -κB提高mir - 135 - a -介导的改进硅引起的炎症和肺纤维化。综上所述,这些集体数据显示,mir - 135 a可能改善肺纤维化和炎症反应的监管NF -κB通路。Silica-induced mir - 135的表达减少,破坏了它的保护作用在炎症和肺纤维化。

4所示。讨论

在这项研究中,我们发现mir - 135作为保护因素缓解silica-induced炎症反应,通过抑制NF -肺纤维化κB激活。硅接触导致减少mir - 135 a的表达抑制保护途径。

硅接触会导致炎症反应,加剧了异常肺胶原蛋白的合成和沉积。缺乏有效治疗后肺纤维化硅曝光,这提示科学家专注于探索纤维化的分子机制的发展。microrna调解mRNA平移压迫或不稳定和调节基因的表达。microrna展示空间的具体表达式。近年来,microrna是作为各组织纤维化的新目标。Let-7i抑制白细胞介素- 6 (il - 6)和胶原蛋白的表达,抑制血管紧张素II-induced心脏纤维化(39]。mir - 125 b和miR-22明显从肝纤维化患者肝组织中表达下调40]。microrna也报道,参与各种肺部疾病的发病机理41]。miR-29防止PI3K-AKT诱导的磷酸化TGF -β1,减少细胞外基质合成人类肺成纤维细胞(42]。Let-7d表达下调是在肺患者特发性肺纤维化(IPF)。抑制Let-7d触发上皮间充质转变(EMT) [43]。

mir - 135 a显示了在某些条件下的保护作用。我们的研究显示,mir - 135 - mir - 135的表达下降和恢复,改善了肺纤维化。mir - 135 a也抑制嗜酸性粒细胞和肥大细胞的渗透到鼻粘膜和减轻allergen-induced炎症(44]。此外,mir - 135 a过度保护人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)机械拉伸引起的损伤45]。mir - 135 a目标NHE9限制胶质母细胞瘤细胞的生长和迁移(46]。然而,mir - 135——促进发展的一些疾病。mir - 135 a加速肾纤维化通过TRPC1的规定,这就增加了合成细胞外基质蛋白在糖尿病肾损伤(16]。mir - 135 a消融压制胰腺癌增长体内(12]。mir - 135 a充当onco-miRNA促进膀胱癌细胞的增殖针对PHLPP2和FOXO1 [47]。因此,mir - 135 a对疾病的影响取决于它的目标基因。

证据支持miRNA-based策略的新疗法治疗和预防一些疾病。miravirsen管理目标mir - 122减少病毒RNA水平在慢性丙型肝炎患者临床2期试验,表明改善肝纤维化(48]。研究适用于脂质载体交付miR-34a抑制小鼠肺肿瘤负担(49]。也报道称,恢复microrna的表达可能代表一种治疗的病理IPF (50]。目前的研究显示mir - 135 a的交货改善了silica-induced纤维化和炎症,表明治疗策略针对mir - 135 a为病人提供了潜在的好处。然而,系统性的介绍microrna的副作用。交付的microrna的治疗目标组织仍然是一个巨大的挑战。

炎症反应是一个复杂的生理反应有害刺激包括二氧化硅。但其失调往往导致等多种病理纤维化。几个microrna,包括mir - 133 a, miR-29, mir - 221, mir - 223, mir - 155, mir - 652,扮演着角色在特定的炎性疾病40]。TGF - mir - 326控制表达式β1和其他profibrotic基因如Smad3 Ets1,基质金属蛋白酶9 (MMP9) IPF (51]。Silica-induced胶原沉积引起矽肺病,直接由细胞因子控制。硅激活NF -κB,增强TNF的表达α,最重要的细胞因子之一。据报道,一些microrna调节NF -κmir - 892激活NF - bκ在乳腺癌细胞(B活动52]。mir - 181 b抑制NF -的激活κB的信号通路调节血管炎症(53]。和miR-26a抑制NF -κ我活动减弱胶原蛋白表达在心脏成纤维细胞54]。目前的研究显示mir - 135 a恢复减毒p-p65, NF -的一个组成部分κB在二氧化硅复杂。但仍未被探索如何mir - 135 a抑制p-p65水平以及是否mir - 135 a与mRNA结合p65或其他分子,使磷酸化p65。虽然TLR4的表达是受在BEAS-2B mir - 135 a细胞,没有预测目标站点TLR4和NF -κB组件。因此,它还有待开发如何mir - 135 a范围TLR4和NF -水平κB激活。还未知是否mir - 135 a调节其他途径或分子缓解silica-induced肺纤维化。

我们的数据显示,mir - 135 a是表达下调后硅接触。但目前尚不清楚如何mir - 135 a表达控制silica-induced肺纤维化。癌基因,原癌基因,同事的启动子区域mir - 122控制它的表达式(55]。炎症介质也会影响microrna的表达。il - 6和Stat3绑定到上游启动子区域miR-21和增加其表达在人类肝细胞和肝星状细胞(HSC) [56]。TGF -β可以抑制miR-29或Let-7d表达式(57]。mir - 181 b表达式是由TNF -α在内皮细胞(ECs) (53]。证据还显示了NF -κB范围miR-26a表达式在心脏成纤维细胞54]。因此,值得进一步调查是否激活炎症介质或NF -κB调节mir - 135 a表达后硅内化。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这个问题是由湖南省自然科学基金资助(2018 jj2628)。

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