文摘
树突状细胞(dc)是最有效的抗原- - - - - -呈递细胞和链接的先天免疫传感环境适应性免疫反应的起始,这可能是针对验收或消除抗原的承认。在癌症患者,尽管DCs将目前的肿瘤抗原T淋巴细胞,诱导tumor-eliminating响应,这是经常不是这样。了复杂的肿瘤微环境免疫反应,块效应机制,推动其他支持肿瘤生长。慢性炎症在肿瘤微环境被认为导致这种监管/耐受性的感应反应。在各种介质的调节开关在慢性炎症是“antidanger信号”伴侣蛋白,热休克蛋白27 (Hsp27)被描述,有趣的是,与细胞迁移和乳腺癌细胞的耐药性。因此,在这里,我们研究了Hsp27的表达在monocyte-derived dc的分化(Mo-DCs)健康的捐赠者和乳腺癌患者和评估他们的表面表型、细胞因子分泌模式,和lymphostimulatory活动。表面表型和淋巴细胞增殖进行评估通过流式细胞术,干扰素(干扰素),γ和白介素- 10 (IL)分泌,通过ELISA和Hsp27表达,通过定量聚合酶链反应(qPCR)。Mo-DCs从癌症患者DC成熟标志的表达减少,减少诱导同种异体淋巴细胞增殖的能力,并增加il - 10分泌。与乳腺癌细胞系coculture,健康的捐赠者的Mo-DCs显示类似的表型变化中发现病人的细胞。有趣的是,患者单核细胞gm - csf和il - 4受体表达低于健康的捐赠者的单核细胞和Hsp27表达明显更高的在病人的Mo-DCs(以及在肿瘤样本)。两种现象可能导致乳腺癌患者的表型偏见Mo-DCs和可能潜在的目标发展的新的免疫治疗乳腺癌的方法。
1。介绍
单核吞噬细胞树突细胞(dc),专业从事幼稚T细胞抗原表达,因此,启动和控制免疫的免疫原性或耐受性响应(1- - - - - -3]。在癌症的情况下,DCs的感应是至关重要的一个强有力的免疫反应;另一方面,缺陷在他们分化/成熟可以有利于肿瘤逃避(4]。复杂的肿瘤细胞与宿主免疫系统之间的关系是动态的,和不同的刺激可以诱发异构的直流子集5,6]。肿瘤immunoenvironment呈现慢性炎症导致癌症发展和进展和增加的积累myeloid-derived抑制细胞(7]。
肿瘤细胞产生影响DC分化的几个因素。热休克蛋白(休克)是一个伴护蛋白质细胞引起的家庭压力。热休克有凋亡特性和积极参与肿瘤细胞增殖和入侵8]。小热休克蛋白27 (Hsp27)在防止毒性的作用由炎症条件。此外,Hsp27的表达诱导单核细胞产生il - 10,这是一个强有力的抑制剂的Th1反应和不断发现提升在人类癌症9- - - - - -11]。
乳腺癌是女性中最常见的侵入性癌症;在这种背景下,Hsp27与肿瘤生长相关的监管和人类乳腺癌耐药(11- - - - - -14]。Banerjee等人表明,治疗与Hsp27导致单核细胞分化为巨噬细胞耐受性,这些类似于巨噬细胞被发现在乳腺肿瘤(15]。Laudanski et al。(2007)报道,外生抑制Hsp27在单核细胞导致未成熟树突状细胞的分化,和它的激活与受损antitumoral免疫反应(10]。考虑到这个理论框架,我们的目标是评估monocyte-derived DCs的表型和生物学功能从乳腺癌患者以及在这一过程中Hsp27的角色。
2。材料和方法
2.1。主题和研究设计
这是一个前瞻性单盲研究便利抽样,根据研究人员的可用性乳腺癌患者接受乳房切除手术。协议的国家伦理委员会批准的研究(CONEP) (695 / CEP)和在医院进行了佩罗拉Byington(107/06),巴西圣保罗。样品只有在获得知情同意的捐助者。外周血单核细胞(PBMCs)获得从18岁女性健康志愿者50年(32)和20个女性患者(33 - 62岁)。组织学诊断证实14导管乳房癌,4乳房小叶癌,2导管和小叶乳腺癌癌(pT1 - 4,pN0 - 2和M0)。
起初,我们获得了DCs来源于单核细胞在体外文化与il - 4和gm - csf, TNF -α对DC成熟。病人和健康的捐赠者的Mo-DC表型特征是通过流式细胞术和功能活动文化和细胞因子分泌混合淋巴细胞反应。之后,Mo-DCs培养有或没有乳腺癌细胞系的表型和功能特性。单核细胞的il - 4和gm - csf受体进行了流式细胞术。肿瘤样本被用来评估Hsp27表达定量聚合酶链反应(PCR)。
2.2。Mo-DC文化
我们跟着Barbuto等的方法。16]。PBMCs分离Ficoll-Paque梯度( ),resuspended,播种12-well盘子AIM-V媒介。隔夜孵化后37°C,不依从细胞被移除,贴壁细胞培养在gm - csf和il - 4 (50 ng / mL;研发、明尼阿波利斯,美国)在AIM-V媒介。第五天,TNF -α(50 ng / mL;研发、明尼阿波利斯,美国增加了对直流激活。在文化进一步2天后,细胞收获与冷RPMI 1640和流式细胞术分析。文化效率计算的百分比细胞移除从贴壁细胞的总数。
在transwells肿瘤coculture整除的肿瘤发生的(MCF7)和转移性(SKBR-3)乳腺癌细胞系( 100年μL(媒介)用移液器吸取(6.5毫米直径,0.4μ米孔隙大小聚碳酸酯transwell过滤器)(康宁生命科学容积、Schiphol-Rijk荷兰)Mo-DC文化(5th天)。7天之后,收获了DCs冷RPMI 1640表型和功能特性。
2.3。流式细胞术的免疫细胞的数量
单核细胞和Mo-DCs根据它们的大小和粒度进行了分析。检测特定的表面抗原,免疫细胞( 细胞)是沾染了异硫氰酸荧光素(FITC),藻红蛋白(PE),或对HLA-DR PE-Cy5-conjugated鼠单克隆抗体(摩),CD11c, CD86, CD116, CD124或用鼠标同形像控制(美国CA Caltag实验室、伯林盖姆)和分析FACSCalibur血细胞计数器(美国加利福尼亚州圣何塞,正欲)赢MDI2.8软件。至少10000的事件是每个抗体分析获得。标记的表达确定的数量和平均荧光强度(MFI)阳性细胞。
2.4。T淋巴细胞隔离通过花结AET-Treated绵羊红细胞和外源的T细胞增殖试验
不依从的PBMC细胞附着试验后获得以前健康的捐赠者与S - 1小时孵化(2-aminoethyl) isothiouronium溴化氢溴酸盐,(让)治疗羊红细胞。T淋巴细胞,坚持红细胞(R +),形成圆花饰,提交了一份聚蔗糖梯度900 g为35分钟,从红细胞颗粒分离解集和溶解的红细胞在低渗盐溶液(0.899% NH4Cl) 2分钟。之后,这些细胞被洗两次RPMI 1640补充heat-inactivated 10%胎牛血清(FCS)和2毫米谷酰胺(R10介质),在250 g离心10分钟去除红细胞碎片。T淋巴细胞在高钙(混合淋巴细胞反应)来评估诱发lymphoproliferation Mo-DC能力在体外。
DCs的能力健康的捐赠者和乳腺癌患者刺激同种异体T细胞在这个试验评估。所有的实验中使用的T细胞是来自健康的志愿者和乳腺癌患者。在这个试验,DCs是刺激细胞和T淋巴细胞应答细胞。后者被添加 细胞/。在每个试验中,所有的测试进行了使用两个复制。适当控制设置在每个96孔板(合演,剑桥,英国)。刺激器DCs辐照25 Gy。T细胞与CFSE染色。直流T细胞比例(1:30)成立,和盘子培养7天的37°C湿润有限公司5%2孵化器。增殖指数由FlowJo软件。计算结果的比例(%)通过控制荧光的原因是/ DCs治疗T细胞培养荧光是乘以100,除以控制荧光意味着/ DCs治疗的原因没有T细胞培养荧光的意思。细胞因子分析的文化上层清液被冻结了。
2.5。量化干扰素-γ并通过ELISA il - 10
干扰素-γ和il - 10含量lymphocyte-DC外源的文化上层清液进行了测试使用商用定量酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(美国加利福尼亚州圣何塞,正欲)。
2.6。实时定量聚合酶链反应
总mRNA Mo-DC和乳腺癌细胞肿瘤是孤立使用Illustra RNAspin迷你隔离设备(美国通用电气医疗集团,皮斯卡塔韦)。总mRNA的浓度决定通过测量吸光度在使用GeneQuant pro 260海里(Amersham生物科学,英国剑桥大学)。反转录进行实时定量聚合酶链反应,其中包含DNAse我避免DNA污染(Promega,麦迪逊,欧洲大学协会)。mRNA Hsp27表达进行了分析使用电力SYBR绿色主人混合(应用生物系统公司、沃灵顿、英国)根据制造商的指示。褶皱的变化目标基因表达之间的各种团体决定使用比较Ct (2−ΔΔCt)方法,正火后glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)和β肌动蛋白表达作为内部参考。
2.7。统计分析
比较样本建立统计学意义的由一个未配对 - - - - - -测试。结果被认为是具有统计学意义的时候 。我们使用了GraphPad棱镜7统计程序(OSB软件,圣保罗,巴西)分析结果。
3所示。结果
成熟的DC膜标记流式细胞术进行了分析,并从乳腺癌患者获得Mo-DCs HLA-DR较少,CD11c CD86, CD80、CCR7表达相比Mo-DCs从健康的捐赠者(图1(一))。此外,病人的Mo-DCs较低lymphostimulatory容量和干扰素-分泌少γ和更多的il - 10(数据1 (c)和1 (d))控制。
(一)
(b)
(c)
(d)
因此,我们评估的影响肿瘤细胞在健康的捐赠者的Mo-DC成熟。两个不同的人类乳腺癌细胞系,MCF7 SKBR-3,当出现在Mo-DC分化、成熟dc的频率下降引起的,即使TNF -α(补充数据2(一个)- - - - - -2 (c)),减少了Mo-DCs诱导lymphoproliferation(图的能力2 (d)),以及减少了IFN -γ分泌在cocultures(图2 (e))。与之相反,Mo-DCs从患者获得不受影响,无论是表面(数字2(一个)- - - - - -2 (c))也在他们的功能表型(数字2 (d)- - - - - -2 (f)当暴露于肿瘤细胞。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
的组合granulocyte-macrophage集落刺激因子(gm - csf)和interleukin-4 (il - 4)诱导分化的Mo-DCs附着外周血白细胞。依照他们的贫穷分化成Mo-DCs,外周血单核细胞从乳腺癌患者表现出低水平的gm - csf (CD116)和il - 4受体(CD124)表达式比健康的捐赠者的细胞(数字3(一个)和3 (b))。
(一)
(b)
Hsp27乳腺癌细胞是一种免疫调节蛋白表达的。在这项研究中,确定Hsp27的表达在肿瘤,正常乳腺组织,和Mo-DCs从病人健康的捐赠者和定量rt - pcr和Hsp27的表达明显高于肿瘤(图4(一)),在Mo-DCs(图4 (b))患者检测。
(一)
(b)
4所示。讨论
在这项研究中,我们研究了肿瘤的影响,在活的有机体内的肿瘤细胞,在体外Mo-DCs。我们分析了其表面表型、细胞因子分泌和lymphostimulatory活动和指出,细胞来自患者或健康的捐赠者接触肿瘤细胞呈现特征,可以归因于细胞耐受性的功能。此外,我们还注意到这些特征增加协会的表达抗炎伴护Mo-DCs Hsp27的病人。
Mo-DC代期间,单核细胞培养中包含gm - csf和il - 4,细胞因子驱动他们分化成不成熟的dc,后5天。在那之后,TNF -α添加作为一种成熟的刺激。健康的捐赠者Mo-DCs相比,乳腺癌患者Mo-DCs显示表面表型暗示贫穷能够诱导T细胞活化和细胞因子,同样地,将使感应宽容而不是反应抗原呈现。这种偏见是维护甚至肿瘤坏死因子刺激后,这是众所周知的,驱动直流成熟和增强抗原递呈功能(17,18]。肿瘤内异常分化可能产生缺陷的DCs可导致肿瘤逃避免疫系统反应(19]。表型和功能障碍的DCs源自乳腺癌患者单核细胞被描述在先前的研究20.,21]。immunoenvironment癌症和炎症之间的关系被广泛接受。先前的研究表明,肿瘤诱导耐受性DCs,因此,减少有效的免疫反应,从而使肿瘤生长(6,22,23]。在乳腺癌中,缺乏成熟的DC在病人与疾病的阶段和持续时间密切相关(24]。
免疫细胞之间的相互作用和肿瘤已经被一些研究调查,为新疗法铺平了道路/治疗策略和指示新的治疗靶点。使用乳腺癌细胞系coculture monocyte-derived树突细胞,我们获得的结果表明肿瘤微环境不仅能够阻止DC成熟但也似乎有系统性影响,防止直流的正常分化,至少从血液单核细胞,从而影响这些核心抗原递呈细胞,甚至在任何成熟的刺激。肿瘤immunoenvironment是复杂和动态的,各种组件,其中是一个高度异构髓细胞炎症的人口,可能支持肿瘤生长和防止肿瘤宿主免疫(25]。肿瘤恶化导致组织重构、代谢改变,血管生成,组织细胞因子变化的环境,和细胞招聘,导致状态类似于慢性炎症(26,27]。同时,临床和实验报告显示,这样的炎性微环境有利于骨髓抑制细胞肿瘤浸润和进展27- - - - - -31日]。
成熟的DCs的频率获得血液单核细胞分化的乳腺癌患者,健康的捐赠者,相比是较低的。自从gm - csf和il - 4这个分化(用于诱导的细胞因子32- - - - - -34),我们调查了两细胞因子受体的表达在外周血单核细胞从病人和健康的捐赠者。结果表明损失在两种细胞因子受体表达的患者PBMCs。炎症反应的细胞因子信号转导和细胞因子基因表达的调控是由热休克蛋白(休克)35]。Hsp27、小Hsp家族的重要一员,一直在追究其升高细胞内的表达及其作用增加恶性肿瘤的标记在人类乳腺肿瘤细胞(13,36,37]。Banerjee等人报道在乳腺癌患者血清Hsp27水平升高,反过来,似乎倾向分化的单核细胞巨噬细胞耐受性,减少破坏瘤的活动和高proangiogenic能力,促进肿瘤的生长15]。Laudanski等人证明Hsp27治疗DC分化水平降低il - 4和GM-CSF-stimulated单核细胞培养(10]。Hsp27的表达,因此,调查,结果显示高表达在乳腺癌组织相比,正常乳房组织。如前所述,Hsp27已被证明是调节在乳腺癌(38与耐药相关),(36)和描述为能够驱动免疫细胞对公差(10,15]。我们的发现,因此,同意这些数据和建议Hsp27表达不仅由抗原递呈细胞肿瘤细胞也可能导致免疫逃避机制在乳腺癌,倾向于DCs的偏见的分化诱导,而不是回应。
DCs是高度专业化的抗原呈递细胞,一个重要的角色在适应性免疫的初始化和控制,确定免疫原性或耐受性响应(1,2,10,38,39]。Le Naour等人描述Mo-DC分化的基因表达和蛋白质组分析变化/成熟和报道,在未成熟DC分化Hsp27的表达是最大的DCs (40]。此外,人类Hsp27治疗外源性刺激单核细胞产生il - 10和降低TNF -α水平(41]。因此,我们观察到,乳腺癌和Mo-DCs从乳腺癌患者相比更Hsp27表达nontumor组织或健康的捐赠者Mo-DCs。因此,成熟表型和监管活动,我们观察到在Mo-DCs乳腺癌患者可能会造成部分高架Hsp27表达在肿瘤细胞和肿瘤微环境,可能由当地DCs(因为,至少Mo-DCs从病人显示这个高表达)。
5。结论
我们的研究表明,Hsp 27表达升高,已经描述在乳腺癌,也出现在Mo-DCs来自患者单核细胞。这些细胞的表面和功能表型可能暗示耐受性的偏见,这将有利于肿瘤逃避和增长。此外,我们确定一个低表达患者gm - csf和il - 4受体的单核细胞,这表明这些细胞因子和细胞之间的相互作用可能会低于最优时病人的细胞,这一现象可能导致他们的表型的影响,同样,肿瘤逃避。虽然我们不能有因果联系较低表达的细胞因子受体Hsp27表达更高,可以设想这样的互动如何在复杂的肿瘤immunoenvironment可能导致免疫抑制网络,促进肿瘤的生长,因此,可能的治疗目标调制。
数据可用性
可以访问所有数据,支持手稿在本文中并没有数据限制。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
这项工作是企业管理学院德基金会支持的“尽管做Estado de圣保罗(FAPESP)必须占州政府和慰问Nacional de Desenvolvimento Cientifico e学府(CNPq)。作者感谢佩罗拉Byington医院临床援助,主要是病人和志愿者没有他们这项研究是不可能的。