文摘gydF4y2Ba

糖尿病心脏障碍在心脏手术显示几个临床问题与离子失衡有关。然而,离子失衡的机制由心麻痹和糖尿病心脏在很大程度上是不清楚。我们假设离子转运蛋白可能是调节不同的糖尿病心脏和不同离子失衡的调节离子转运蛋白可能涉及糖尿病心脏cardioplegic被捕后。在这项研究中,我们修改了Langendorff-free心麻痹方法和确定相关离子转运蛋白cardioplegia-induced被捕后在野生型和db / db的心。Na的增强表达gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba- kgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba2氯gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba转运蛋白1 (NKCC1)在db / db的心比野生型的心。增强NKCC1活动观察左心室的db / db cardioplegia-induced被捕后小鼠与野生型相比。Slc26a6的表达和活性,主要ClgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba/ HCOgydF4y2Ba_3gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba换热器在心脏组织,增强左心室条db / db的老鼠比野生型。的ClgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba运输活动在左心室条db / db小鼠与野生型相比显著增加。Slc26a6有趣的是,表达式,以及碳酸酐酶IV Slc26a6支持酶,增加在db / db心脏条与野生型相比,心脏。因此,加强ClgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba运输活动和表达NKCC1和Slc26a6 db / db cardioplegia-induced被捕后心脏组织可以更深入地了解增强酸中毒和ClgydF4y2Ba^−gydF4y2Bamovement-mediated db / db心脏功能障碍。因此,我们建议增强ClgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba流入和HCOgydF4y2Ba_3gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba射流通过NKCC1 Slc26a6提供更多的酸性环境中糖尿病心脏cardioplegic被捕后。这些转运蛋白被认为是潜在的治疗靶点开发下一代的心麻痹在糖尿病心脏对缺血再灌注损伤保护的解决方案。gydF4y2Ba

1。介绍gydF4y2Ba

在体外循环下心脏手术和零星的心麻痹,术中缺血期间可能发生的损害赔偿之间多剂量注入心麻痹的解决方案或分配不当导致解决方案远端冠状遮挡(总gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]。此外,潜在的再灌注损伤发生在每个注入心麻痹解决方案和切除后主动脉cross-clamp [gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]。然而,众所周知,缺血再灌注(IR)损伤心脏手术期间与死亡率和发病率增加相关(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]。心麻痹的解决方案提供关于心肌保护作用的全球红外维护伤缺血期间的pH值(gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。然而,保护作用红外受伤的心麻痹是限制性的。因此,组合cardioplegic解决方案的挑战和药理代理人获得进一步的保护作用已经解决(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

2型糖尿病在全世界影响近四亿人。在2012年至2030年之间,有一个预计的69%和20%成人糖尿病患者数量的增加在发展中国家和发达国家,分别是(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]。这些病人显示恶化心脏手术后临床结果与非糖尿病患者相比(gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]。在缺血,胞质H的积累gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba提供了一个更大的驱动力NagydF4y2Ba^+gydF4y2Ba- hgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba换热器(新人道)。细胞内钠的积累gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba由新人道刺激CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}通过Na涌入gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/ CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}换热器(NCX)。随后的胞质钙积累gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}与心脏功能障碍的发病机理有关gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。虽然心血管方法改进结果在过去的几十年,仍有临床问题与糖尿病心脏功能障碍有关,如心律失常、心力衰竭细胞凋亡,(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba),这将导致增加离子失衡。众所周知,红外受伤或cardioplegia-induced损伤后心脏手术是由细胞离子通道异常;没有研究关注不同的离子通道的工作是否cardioplegia-induced被捕后在糖尿病患者的心肌。适当的心肌保护专门为糖尿病患者心麻痹心脏手术后需要减少发病率。gydF4y2Ba

心脏的离子转运蛋白的丰度和多样性是参与离子体内平衡。因此,研究检查离子转运体的变化在糖尿病心肌cardioplegia-induced被捕后是至关重要的。在这项研究中,我们的目标是解决下面的请求。这些转运蛋白有助于pH值调制cardioplegic被捕后?和野生型有什么区别(WT)和糖尿病的心?虽然心肌细胞动作电位离子性质已经完善(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba),离子转运蛋白的活动是否保持cardioplegic逮捕了2型糖尿病的心仍是未知的。因此,我们假设的不同的表达水平和活性离子转运蛋白WT和糖尿病的心之间将发生,差别可能有助于了解糖尿病的机制心cardioplegic被捕后。在目前的研究中,我们评估了离子转运体功能差异db / db和WT老鼠cardioplegia-induced被捕后。gydF4y2Ba

2。材料和方法gydF4y2Ba

2.1。动物gydF4y2Ba

一个实验性2型糖尿病小鼠模型的高葡萄糖(db / db, BKS.Cg-Dock7mgydF4y2Ba^{+ / +gydF4y2Ba}Leprdb / J;男性,年龄8周)和正常葡萄糖WT老鼠(C57BL / 6,男,年龄8周)是位于特定的无菌动物设施李吉尔丫癌症和糖尿病研究所的Gachon大学。老鼠被安置在单独的通风笼控制湿度(50%)和温度(21.4°C)。所有实验老鼠心脏的维护和隔离程序从老鼠跟着Gachon大学指南和被批准的Gachon Gachon大学动物保健和使用委员会(ACUC采购- 2016 - 0037)。gydF4y2Ba

2.2。心麻痹输液gydF4y2Ba

动物实验都是由一个单一的心脏外科医生。动物是镇静和5%异氟烷麻醉室。我们交付心麻痹通过修改Langendorff-free心麻痹方法(gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。镇静后,胸骨切开术和蛤壳切口很快被公开执行整个胸腔;在主动脉夹层主动脉夹紧进行了。右心房心耳被切除,防止左心膨胀期间注入心麻痹。23 g针插入在左心室(LV);针插入站点是LV的顶点,这是精心挑选的,以避免造成冠状动脉受伤。上面的程序进行开始之前的心颤。23 g针连接心麻痹或常规的解决方案。histidine-tryptophan-ketoglutarate (HTK)溶液在5°C (Alsbach-Hahnline Custodiol,化学GMBH,德国)是管理使用滚柱泵每克1毫升/分钟心脏重量。在输液过程中,升主动脉夹着nontoothed DeBakey钳。 During cardioplegia infusion, care was taken to ensure that no LV distension was present and that coronary arteries were properly cleared by the cardioplegia solution. All procedures and infusion volume were identical between Regular and HTK solution infusions.

2.3。心脏地带的准备gydF4y2Ba

心麻痹输液后,心被收获,和LV进行分离。简单地说,切碎的心脏带(gydF4y2Ba )gydF4y2Ba在每个孵化HTK解决方案在冰上。分离LV是保存在HTK或常规的解决方案,直到所需的后续实验。孤立的心脏成像条在1小时内完成。HTK和常规的解决方案的组成如表所示gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。常规的解决方案可以被视为HEPES-buffered生理盐溶液由相同的像血清电解质组成。了解心麻痹交付方法和隔离收获后心脏地带的心脏,示意图如图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

2.4。分析氯gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba-HCOgydF4y2Ba_3gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba换热器(CBE)心脏活动带gydF4y2Ba

细胞内的pH值(酸碱度gydF4y2Ba_我gydF4y2Ba使用2)测量gydF4y2Ba ,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba - - - - - -gydF4y2Ba(bis) -羧乙基5 - (6)-carboxyfluorescein (Teflabs BCECF-AM # 0061年,奥斯丁TX) 440年和495年的双重激发波长和发射波长530 nm。孤立的心脏在盖玻片是孵化6条gydF4y2BaμgydF4y2Ba普朗尼克BCECF-AM和0.05% f - 127 (P3000MP,英杰公司)室在室温下15分钟。条是与心麻痹液灌注前至少5分钟测量pH值gydF4y2Ba_我gydF4y2Ba在37°C。cardioplegic休息pH水平获得了从最初BCECF荧光比率(gydF4y2Ba )gydF4y2Ba第一个60秒的pH值在灌注成像。cardioplegic休息pH值被定义为pH cardioplegia-induced被捕后休息。Slc26a6是Cl之一gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba-HCOgydF4y2Ba_3gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba换热器(CBE)的家庭。CBE活动以有限的存在gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba饱和HCOgydF4y2Ba_3gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba媒体。测量是由灌注组织免费ClgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba-HCOgydF4y2Ba_3gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba媒体(0 ClgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba/ HCOgydF4y2Ba_3gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba、表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。CBE活动的决心从山坡上的衍生品(gydF4y2BaΔgydF4y2BapH值gydF4y2Ba_我gydF4y2Ba/秒)的pH值增加的开始gydF4y2Ba_我gydF4y2Ba在自由氯gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba-HCOgydF4y2Ba_3gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba媒体。采用CCD摄像头监控发射波长(光度)连接到显微镜(日本奥林巴斯);所有图片分析MetaFluor系统(设备)分子。gydF4y2Ba

2.5。Na的分析gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba- kgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba2氯gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba在心脏条转运蛋白1 (NKCC1)活动gydF4y2Ba

NKCC1活动基于pH值的速度测量gydF4y2Ba_我gydF4y2Ba减少,引起细胞内NHgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba吸收(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]。管理20毫米NHgydF4y2Ba_4gydF4y2BaCl在NH正规溶液初始碱性化介导的gydF4y2Ba_3gydF4y2Ba扩散;然后,pH值gydF4y2Ba_我gydF4y2Ba减少由于NH吗gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba脉搏。在第二个阶段,pH值gydF4y2Ba_我gydF4y2BaNH后回收率gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba脉冲被定义为酸化率(gydF4y2BaΔgydF4y2BapH值gydF4y2Ba_我gydF4y2Ba/秒)。最初的线性酸化率拟合线性方程使用原点软件(版本8.0,OriginLab Inc .)。酸化率之间的差异有或没有布美他尼是用来计算bumetanide-sensitive NKCC1活动。gydF4y2Ba

2.6。分析氯gydF4y2Ba^−gydF4y2BaMQAE运输活动的心脏gydF4y2Ba

胞内氯gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba用N -溴化(ethoxycarbonylmethyl) 6-methaxyquinolinium (MQAE E3101,热费希尔)。增加MQAE荧光代表减少ClgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba浓度,同时降低荧光代表增加ClgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba浓度。LV带盖玻片的孵化与5毫米MQAE在室温下30分钟,然后用HTK或常规解决方案,直到达到稳定的基线信号。MQAE荧光信号记录至少3分钟获得基线信号,之后转向自由Cl灌注解决方案gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba-HCOgydF4y2Ba_3gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba媒体(0 ClgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba/ HCOgydF4y2Ba_3gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba、表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。这是添加HCO紧随其后gydF4y2Ba_3gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba解决方案(HCOgydF4y2Ba_3gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba、表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。MQAE荧光测量在360 nm励磁,和光发射在530 nm收集与CCD相机(光度)。的ClgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba运输活动决心从山坡上的衍生品(MQAE荧光单元/秒)的第一个荧光跟踪自由Cl - 55秒gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba-HCOgydF4y2Ba_3gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba媒体。gydF4y2Ba

2.7。共焦成像的心脏组织gydF4y2Ba

冰冻的心脏组织免疫荧光研究部分(10gydF4y2BaμgydF4y2Ba米厚)与冷甲醇固定(Slc26a6 ZO-1)或4%多聚甲醛(NKCC1) 10分钟。疣状如前所述执行(gydF4y2Ba18gydF4y2Ba)使用1:100稀释NKCC1 (ab59791 Abcam) ZO-1(# 33 - 9100热费希尔)和Slc26a6 (pa5 - 37970热费希尔)抗体。简单,结合抗体检测与罗丹明(715-025-151,杰克逊ImmunoResearch)和FITC(713-095-003,杰克逊ImmunoResearch)(1: 100稀释)。玻璃上盖玻片放置幻灯片(霜gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba,Fisher) DAPI-included Fluoromount-G™(电子显微镜科学,哈特菲尔德,PA),使用LSM 700共焦显微镜和图像分析通过Fluo-view软件(德国卡尔蔡司)。无污点的样本作为消极的控制(NC)。gydF4y2Ba

2.8。Na的分析gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/小时gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba换热器(新人道)心脏活动带gydF4y2Ba

新人道活动是基于测量pH值的回收率gydF4y2Ba_我gydF4y2Ba,细胞内钠引起的gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba吸收在常规的解决方案如前所述gydF4y2Ba19gydF4y2Ba,gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。减少后的短暂,洒遍20毫米NH的细胞内的pH值gydF4y2Ba_4gydF4y2BaCl解决方案,0 NagydF4y2Ba^+gydF4y2Ba解决办法是灌注。没有恢复从0 Na的酸化gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba解决方案。然后,细胞内的pH值gydF4y2Ba_我gydF4y2Ba恢复了NagydF4y2Ba^+gydF4y2Ba包含常规的解决方案,恢复率被定义为新人道活动通过测量从山坡上的衍生品的第一- 55秒的pH值gydF4y2Ba_我gydF4y2Ba复苏的痕迹。gydF4y2Ba

2.9。血清葡萄糖浓度的测量gydF4y2Ba

老鼠与异氟烷麻醉(≈3%在空气中)被吸入。胸部开放充分暴露心脏,和血液收集使用25 g针(Kovax-syringe 1毫升,韩国)的心。然后,收集血液离心15分钟在1500 rpm。然后,收集上清液,血清葡萄糖水平测量使用血糖仪(绿色十字标记,韩国)。gydF4y2Ba

2.10。西方墨点法gydF4y2Ba

从小鼠心脏组织分离和刺激表示心麻痹1人力资源解决方案。溶菌产物的心脏组织匀浆得到裂解缓冲(包含(150毫米)氯化钠,20三,2 EDTA, 1% Triton x - 100和蛋白酶抑制剂混合物)和治疗如前所述[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]。30.gydF4y2BaμgydF4y2Bag变性蛋白样品受到了sds - page。蛋白质与NKCC1可视化(ab59191 Abcam) phosphoNKCC1 (# ABS1004,微孔),Slc26a6 (ab172684 Abcam), CA IV (sc - 74527,圣克鲁斯生物技术),GAPDH (ma5 - 15738热费希尔)NHE1 (Novusbio nbp1 - 76847)gydF4y2BaβgydF4y2Ba肌动蛋白(A3854σ)使用增强荧光抗体(ECL)解决方案(热科学)。蛋白质带的强度是规范化的gydF4y2BaβgydF4y2Ba肌动蛋白作为蛋白质加载控制。gydF4y2Ba

2.11。隔离Di-8-ANEEPS单个心肌细胞的染色gydF4y2Ba

心脏肌细胞隔离执行根据先前生成的协议(gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。的LV 8-week-old老鼠被注射EDTA缓冲区包含(130毫米)氯化钠,氯化钾,0.5 NagydF4y2Ba_2gydF4y2Ba阿宝gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba,10玫瑰,10牛磺酸、10葡萄糖,10(2、3)丁二酮单肟(BDM,西格玛奥德里奇,B0753)和5 EDTA。心被删除,和10毫升EDTA缓冲区被注入左心室。灌注缓冲区(3毫升)注入LV包含(130毫米)氯化钠,氯化钾,0.5 NagydF4y2Ba_2gydF4y2Ba阿宝gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba,10玫瑰,10牛磺酸、10葡萄糖,10年来,1 MgClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba。胶原酶缓冲(30毫升)含0.5毫克/毫升胶原酶II型(17101515,热科学)和0.05毫克/毫升蛋白酶十四(P5147,西格玛奥德里奇)注入LV,直到心是透明且柔软。组织被温柔地嘲笑到1毫米gydF4y2Ba^3gydF4y2Ba块,被转移到50毫升锥形管。停止与5%的边后卫缓冲区包含灌注缓冲区被添加到细胞悬液。悬架是过滤100gydF4y2BaμgydF4y2Ba过滤器和离心机在300×3分钟gydF4y2BaggydF4y2Ba。上层清液被分离细胞颗粒包含心脏细胞。确定连接结构,3gydF4y2BaμgydF4y2BaL(10毫米di-8-ANEPPS(19541,开曼群岛,安阿伯市MI)和2.5gydF4y2BaμgydF4y2BaL 20%的普朗尼克f - 127涨跌互现。新孤立心脏细胞被转移到poly-L-lysine-coated盖滑落,孵化与混合di-8-ANEPPS染料在4°C(10分钟)。染色后,混合染料用DMEM之前共焦成像。gydF4y2Ba

2.12。细胞内的pH值校准gydF4y2Ba

BCECF-AM的比率(Teflabs)被转换为pH值单位如前所述[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba,gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]。短暂,心脏条孵化的校准解决方案(pH值5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,和8.5)在室温下为5分钟。pH值校准曲线的方程gydF4y2Ba (gydF4y2Ba :gydF4y2Ba比BCECF价值;gydF4y2Ba :gydF4y2Ba最大比例;gydF4y2Ba :gydF4y2Ba最低比率;BCECF pKa值:6.97)。BCECF荧光比率转换为pH值的变化gydF4y2Ba_我gydF4y2Ba(gydF4y2BaΔgydF4y2BapH值gydF4y2Ba_我gydF4y2Ba)值,其次是校准曲线。gydF4y2Ba

2.13。DNA转染gydF4y2Ba

开发人类SLC26A6和CA IV pCMV6-AC-mKate向量;提供的原始克隆是Shmuel Muallem(美国国立卫生研究院的贝塞斯达)。质粒转染2000年Lipofectamine遵循制造商的协议(11668019,表达载体),曾描述(gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

2.14。统计分析gydF4y2Ba

结果表示为gydF4y2Ba 。gydF4y2Ba方差分析有统计学意义决定的每个实验(gydF4y2Ba ,gydF4y2Ba ,gydF4y2Ba和gydF4y2Ba )。gydF4y2Ba统计两组样本的平均值之间的差异进行了分析使用学生的gydF4y2Ba - - - - - -gydF4y2Ba测试。gydF4y2Ba

3所示。结果gydF4y2Ba

3.1。增强NKCC1蛋白质在db / db心脏组织gydF4y2Ba

我们首先确定糖尿病小鼠模型的高葡萄糖水平。db / db老鼠提供一个2型糖尿病小鼠模型(gydF4y2Ba24gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba26gydF4y2Ba),我们证实了高葡萄糖水平的db / db老鼠血清(图gydF4y2Ba2(一个)gydF4y2Ba)。我们推测(NagydF4y2Ba^+gydF4y2Ba]gydF4y2Ba_我gydF4y2Ba变更NKCC1转运蛋白在糖尿病心肌高于正常心肌,这可能导致cardioplegia-induced被捕后心肌损伤。我们测量NKCC1差异蛋白表达野生型和db / db心脏组织之间。增强NKCC1蛋白表达在LVgydF4y2Ba^{db / dbgydF4y2Ba},而没有区别的表达磷酸化NKCC1 (pNKCC1)蛋白质检测野生型和db / db心脏,和总NKCC1蛋白质增加在db / db(数字gydF4y2Ba2 (b)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba2 (c)gydF4y2Ba)。接下来,我们还研究了NKCC1蛋白质的表达与疣状心脏组织。如数据所示gydF4y2Ba2 (d)gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba2 (f)gydF4y2Ba,NKCC1表达式在db / db与野生型相比,增强心脏组织。gydF4y2Ba

3.2。NKCC1活动增强,LV的db / db心脏HTK-Induced被捕后带gydF4y2Ba

NKCC心脏组织活动带与20毫米NH检查gydF4y2Ba_4gydF4y2BaCl脉冲技术和决心通过灵敏度布美他尼,选择性NKCC1抑制剂。有趣的是,cardioplegic逮捕了HTK保存酸化属性,不是最初的碱性化,由北半球gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba脉冲(数据没有显示)。因此,我们决定复苏的NH状态gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba脉冲技术(常规溶液灌注紧随其后HTK逮捕1分钟)模仿的再灌注后心脏骤停。的碱性NHgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba脉冲在LVgydF4y2Ba^WTgydF4y2Ba和LVgydF4y2Ba^{db / dbgydF4y2Ba}(图gydF4y2Ba3(一个)gydF4y2Ba)。LV的酸化速率gydF4y2Ba^{db / dbgydF4y2Ba}条增加而LVgydF4y2Ba^WTgydF4y2Ba带(图gydF4y2Ba3 (b)gydF4y2Ba)。确认NHgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba^+gydF4y2Bapulse-induced pH值的变化gydF4y2Ba_我gydF4y2Ba,我们测量pH值gydF4y2Ba_我gydF4y2BapH值的变化相比,孤立的单个心肌细胞和心脏带(图gydF4y2Ba3 (c)gydF4y2Ba)。NHgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba^+gydF4y2Bapulse-induced pH值跟踪心脏地带和心肌细胞之间有相同的模式。此外,我们确定了连接结构在刚使用membrane-specific染料di-8-ANEPPS孤立的心脏细胞。共焦图像到达沾di-8-ANEPPS(绿色,图gydF4y2Ba3 (d)gydF4y2Ba)获得。pH值校准曲线的心脏带应用于所有pH值的变化实验(补充图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

3.3。增加在db / db Slc26a6心脏组织的表达gydF4y2Ba

的ClgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba/ HCOgydF4y2Ba_3gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba换热器(CBE)介导ClgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba吸收和酸化的pH值gydF4y2Ba_我gydF4y2Ba通过HCOgydF4y2Ba_3gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba流出。尽管AE3参与CBE,我们专注于Slc26a6,主要表达在老鼠的心脏相比AE3 [gydF4y2Ba27gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。评估的表达Slc26a6 WT和db / db的老鼠,我们进行免疫印迹分析WT和db / db心脏组织。有趣的是,在db / db老鼠Slc26a6表达增强(数字gydF4y2Ba4(一)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba4 (b)gydF4y2Ba)。在db / db心脏组织,CA IV是适度的表达增加,然而,并不是统计(数据不同gydF4y2Ba4(一)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba4 (b)gydF4y2Ba)。膜相关CA IV与HCO交互gydF4y2Ba_3gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba转运蛋白促进HCO的形成gydF4y2Ba_3gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba运输该公司(gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba]。我们确认immunolocalization Slc26a6心脏组织。在LV Slc26a6的表达gydF4y2Ba^{db / dbgydF4y2Ba}LV的2.7倍gydF4y2Ba^WTgydF4y2Ba(数据gydF4y2Ba4 (c)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba4 (d)gydF4y2Ba)。这些结果表明,增强表达的Slc26a6促进ClgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba通量在db / db心脏组织。gydF4y2Ba

3.4。支持函数的CA IV SLC26A6活动和增强CBE db / db心脏活动带gydF4y2Ba

CBE活动是否维护cardioplegic被捕后仍然未知。LV的CBE活动gydF4y2Ba^{db / dbgydF4y2Ba}条适度增加与LVgydF4y2Ba^WTgydF4y2Ba条cardioplegic逮捕后(数字gydF4y2Ba5(一个)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba5 (b)gydF4y2Ba)。增强蛋白质的表达Slc26a6和CA IV将CBE活动增加。因此,我们探讨了机制CA IV和SLC26A6-mediated变化gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba。CA静脉增强SLC26A6活动(数据gydF4y2Ba5 (c)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba5 (d)gydF4y2Ba)。CA IV和SLC26A6没有相互作用(数据未显示);然而,CA IV促进了ClgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba/ HCOgydF4y2Ba_3gydF4y2Ba^−gydF4y2BaSLC26A6的交换活动。确认的参与Slc26a6、蛋白激酶C受体激动剂佛波醇12-myristate 13-acetate (PMA),称为Slc26a6抑制剂(gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba心麻痹液),增加了。CBE活动抑制了PMA的治疗在心脏带(数字gydF4y2Ba5 (e)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba5 (f)gydF4y2Ba)。确认Cl的效果gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba运动通过NKCC Slc26a6,胞内氯的变化gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba浓度在LVgydF4y2Ba^WTgydF4y2Ba和LVgydF4y2Ba^{db / dbgydF4y2Ba}考察了条MQAE荧光猝灭的技术。MQAE荧光通常增加0 Cl的存在gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba媒体由于减少细胞内ClgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba浓度(gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]。有趣的是,ClgydF4y2Ba^−gydF4y2BaLV的运输活动gydF4y2Ba^{db / dbgydF4y2Ba}条是0 Cl大幅度增加gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba媒体与MQAE荧光猝灭(图技术gydF4y2Ba5 (g)gydF4y2Ba)。这些结果表明,增强表达Slc26a6促进ClgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba运输活动在db / db cardioplegia-induced被捕后心脏组织。gydF4y2Ba

3.5。活动和蛋白表达之间的NHE1 WT和db / db HTK-Induced被捕后gydF4y2Ba

的ClgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba/ HCOgydF4y2Ba_3gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba交流促进钠gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba加载,NagydF4y2Ba^+gydF4y2Ba端依赖酸挤压NHE1等机制,主要的pH值调节器(gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。我们核实后新人道活动的作用和蛋白表达cardioplegia-induced被捕。心麻痹后,没有区别的新人道活动(数据gydF4y2Ba6(一)gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba6 (c)gydF4y2Ba)。的蛋白表达NHE1 LV之间没有区别gydF4y2Ba^WTgydF4y2Ba条和LVgydF4y2Ba^{db / dbgydF4y2Ba}带(图gydF4y2Ba6 (d)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba6 (e)gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

4所示。讨论gydF4y2Ba

我们假设糖尿病心肌更加脆弱的心麻痹后注入比心肌正常葡萄糖条件下,随着各种离子通道参与(NagydF4y2Ba^+gydF4y2Ba]gydF4y2Ba_我gydF4y2Ba体内平衡是改变。阳离子通量通过NKCC缺血后被证明是意味深长地增加1型糖尿病的心,和抑制NKCC揭示了降低缺血性损伤在糖尿病的心gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]。在这项研究中,我们发现增强NKCC1蛋白质和LV NKCC1活动增加gydF4y2Ba^{db / dbgydF4y2Ba}。NKCC upregulation及其糖基化破坏ClgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba体内平衡(gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]。增强表达的NKCC1 db / db Cl的心脏可能提供协同失调gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba浓度与增强Slc26a6公司。在LV增强的CBE活动gydF4y2Ba^{db / dbgydF4y2Ba},ClgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba运输活动的Slc26a6 LVgydF4y2Ba^{db / dbgydF4y2Ba}增加与LV相比gydF4y2Ba^WTgydF4y2Ba。此外,Slc26a6活动在db / db可能进一步提高CA IV的参与。Cl的动力学gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba流量在一定程度上解决了在糖尿病小鼠几乎40年前(gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]。的ClgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba/ HCOgydF4y2Ba_3gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba交换机、编码gydF4y2BaSlc4a3gydF4y2Ba和gydF4y2BaSlc26a6gydF4y2Ba在心脏组织中表达的基因,gydF4y2Ba27gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba,gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]。又被称为酸装载机和调解HCOgydF4y2Ba_3gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba射流和ClgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba涌入诱导酸化的pH值gydF4y2Ba_我gydF4y2Ba。Slc26a6称为主导运输车心脏心室(gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]。虽然复杂的监管机制构成的各种离子转运蛋白,我们发现增强表达Slc26a6和ClgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba运输活动db / db的心,表明有效Slc26a6阻滞剂可能有效调节pH值的2型糖尿病患者的心。gydF4y2Ba

在这项研究中,我们解决了pH值调制cardioplegic被捕后被WT和糖尿病的心之间差别监管。心麻痹,细胞内酸中毒提供缺血再灌注损伤的主要来源,假设图和机制gydF4y2Ba7gydF4y2Ba。基于我们的研究结果,db / db的心观察增加NKCC, CBE, ClgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba运输活动引起的增强NKCC和Slc26a6表达式。已经解决,增强表达和功能的心脏NKCC观察在充血性心力衰竭和心肌重构gydF4y2Ba37gydF4y2Ba]。增强NKCC db / db心脏活动在当前的研究中也可能提供病理提示糖尿病的心。gydF4y2Ba

的HCOgydF4y2Ba_3gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba调制的Slc26a6心透露在几个报告(gydF4y2Ba27gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。的角色也已经解决,Slc26a6 ClgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba草酸/换热器草酸分泌而不是ClgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba/ HCOgydF4y2Ba_3gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba换热器在唾液腺gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]。虽然我们解决增强Slc26a6表达式在db / db的心,ClgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba窗口Slc26a6运输机需要澄清。它还一直在仔细考虑增强ClgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba运输活动db / db的心。此外,心脏的生理和病理作用和交联作用NKCC和Slc26a6目前不清楚,和Cl背后的机制gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba监管不能从当前的结果得出结论。可能,高架NKCC Slc26a6将提供有利的情况下提升ClgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba运输活动db / db的心。此外,ClgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba流入和HCOgydF4y2Ba_3gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba射流Slc26a6可能促进糖尿病心肌细胞内酸化在cardioplegia-induced逮捕。gydF4y2Ba

当前研究的结果显示几个重要的局限性。技术的限制,目前的研究是在性常温的温度,偏离了心脏手术(Egar等人就讲过gydF4y2Ba39gydF4y2Ba]。然而,我们的研究的力量在我们修改了Langendorff-free方法,它模拟主动脉cross-clamp后立即应用和心脏手术期间cardioplegia-induced被捕的初始阶段。此外,2型糖尿病模型(db / db鼠标)高的血清葡萄糖水平被用来评估心肌心麻痹的效果。临床上,2型糖尿病患者更容易比I型糖尿病和心脏疾病需要心脏手术。因为1和2型糖尿病的病理生理意义及其对心肌的影响是不同的,我们的研究在临床相关设置。我们的研究结果表明,有必要开发专门用于糖尿病患者心麻痹。因此,这项研究表明,调制ion-transporting活动的db / db的心可能是一个有效的策略防止心脏损害包括酸中毒和水肿在糖尿病患者心麻痹输液。gydF4y2Ba

数据可用性gydF4y2Ba

所有数据和数据用于支持本研究的结果包括在本文中。gydF4y2Ba

的利益冲突gydF4y2Ba

作者宣称他们没有利益冲突与这篇文章的内容。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

JHH和学校造成了观念和设计手稿和cardioplegia-induced模型中数据的采集和分析;萨尔重新分析和确认数据;MJJ、银和萨尔文章的草稿,获得数据,或重组并修改它至关重要的知识内容;和JHH画动画示意图。Minjeong霁,李Seok,唱啊李同样贡献了这工作。图纸的数据gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和gydF4y2Ba7gydF4y2Ba被宋庆熙香港博士和绘制Minjeong霁。gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

这项工作是由韩国国家研究基金会(NRF)授予由韩国政府资助(MSIT) (2016 r1d1a1b03933680(学校))和格兰特吉尔医疗中心Gachon大学项目(2018 - 07年的朋友,JHH;朋友2017 - 16,SIL)。gydF4y2Ba

补充材料gydF4y2Ba

补充图1:酸碱LV心脏条校正曲线的5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0和8.5。BCECF-AM的比率(Teflabs)被转换为pH值单位如前所述[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba,gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]。短暂,心脏条孵化的校准解决方案(pH值5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,和8.5)在室温下为5分钟。pH值校准曲线的方程gydF4y2Ba (gydF4y2Ba :gydF4y2Ba比BCECF价值;gydF4y2Ba :gydF4y2Ba最大比例;gydF4y2Ba :gydF4y2Ba最低比率;BCECF pKa值:6.97)。BCECF荧光比率转换为pH值的变化gydF4y2Ba_我gydF4y2Ba(gydF4y2BaΔgydF4y2BapH值gydF4y2Ba_我gydF4y2Ba)值,其次是校准曲线。gydF4y2Ba(gydF4y2Ba补充材料gydF4y2Ba)gydF4y2Ba