文摘
活性氧化物种(ROS)是重要的炎症介质。电子逃离线粒体电子传递链(等)在氧化磷酸化(OXPHOS)线粒体呼吸链复合物(RC)导致活性氧的生产。细胞抗氧化酶是重要的维持活性氧释放在生理水平。据报道,BoHV-1感染引起生产过剩的活性氧和氧化线粒体功能障碍在细胞培养。在这项研究中,我们发现RC复合物的化学干扰TTFA(抑制剂RC复杂II),南3(抑制剂RC复杂的IV)和寡霉素(ATP合酶抑制剂)持续感染病毒生产下降,表明钢筋混凝土的整体流程为病毒复制复合体是重要的。病毒感染显著增加亚基的表达SDHB(琥珀酸脱氢酶)和MTCO1(细胞色素c氧化酶亚基我),钢筋混凝土复合体II和IV的关键组件,分别。抗氧化酶的表达包括超氧化物歧化酶1 (SOD1) SOD2,过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶4 (GPX4)不同病毒感染后的影响。线粒体蛋白质TFAM(转录因子)刺激通过核呼吸因子1 (NRF1)或NRF2线粒体生物起源的主要监管机构。有趣的是,病毒感染在后期阶段(16 h后感染)刺激TFAM表达但NRF1和NRF2的水平下降,这表明病毒感染激活TFAM信号NRF1或NRF2独立的。总的来说,这项研究提供的证据表明,BoHV-1感染与RC复合物相关分子的表达,改变抗氧化酶,以及线粒体biogenesis-related信号NRF1 / NRF2 / TFAM,这与先前的报告,病毒感染诱发ROS生产过剩和线粒体功能障碍。
1。介绍
牛疱疹病毒1型(BoHV-1)是一个家庭的病毒Herpesviridae和亚科Alphaherpesvirinae。急性病毒感染引起的疾病在所有年龄段的牛和品种,包括呼吸道炎症和生殖系统(1]。免疫抑制和粘膜损害由于病毒感染可能引发继发性细菌或病毒感染,最终导致疾病称为牛呼吸道疾病复杂(BRDC)、牛(最重要的疾病2,3]。通常,BRDC的发病高峰出现在年轻的小腿不超过6个月大的时候,一个潜在的原因导致死亡(4]。BoHV-1感染和BRDC全球牛行业造成巨大的经济损失(3]。
线粒体是重要的细胞细胞器参与能量代谢等多种功能,程序性细胞死亡、先天免疫。细胞作为一个“强国”,线粒体ATP编排生产中发挥核心作用[5]。一般来说,细胞能量是由三个代谢途径,也就是说,β氧化、三羧基的周期和氧化磷酸化(OXPHOS)。OXPHOS代谢途径,包括multiprotein呼吸链复合物(RC)我IV和ATP合酶(ATP酶),产生大约90%的细胞ATP (6,7]。OXPHOS期间,电子穿过线粒体电子传递链(等)在RC复合体,和建立一个质子梯度内线粒体膜作为ATP的能源生产。与此同时,电子可能逃离等(8),特别是在复杂的I, II, III,与分子氧和反应形成过氧化物自由基(O2−⋅),它可以转化成各种组件的ROS (9- - - - - -11]。因此,电子逃离等活性氧的主要来源是一代。在生理条件下,ROS产生在较低水平,作为第二信使调节不同的生物过程(12),而过多的活性氧是有毒的和能破坏细胞组件如脂质、蛋白质、核酸、碳水化合物(13,14],虽然有许多细胞内抗氧化酶、超氧化物歧化酶等1 (SOD1) SOD2, 4 (GPX4)、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶(CAT),负责维护氧化还原内稳态的令人不安的ROS生成与多样化的机制(15]。
积累的研究表明,线粒体作为抗病毒先天免疫反应的一个平台在脊椎动物中,主要取决于激活视黄acid-inducible基因I - (rig - I)受体信号和线粒体外膜的参与适配器蛋白质小牛(线粒体抗病毒信号蛋白质)来防止病毒入侵(16,17]。因此,有利于病毒感染或发病机理,线粒体通常被入侵的病毒(18]。援助在这努力,病毒已经开发出不同方法影响线粒体功能。例如,人类免疫缺陷virus-1答蛋白质减少线粒体大小和损害线粒体分裂增加核裂变和核聚变蛋白质的表达水平dynamin-related蛋白1 (Drp1)神经元[19],牛痘病毒抑制OXPHOS等增加活性氧产量在感染巨噬细胞(20.],甲型流感病毒可以把病毒蛋白PB1-F2通过Tom40渠道进入线粒体,从而削弱了先天免疫反应介导的线粒体(21]。病毒1型单纯疱疹病毒,基因关闭BoHV-1,卖价病毒蛋白被发现抑制线粒体呼吸通过阻断等功能(22]。BoHV-1感染损害线粒体膜电位,增加活性氧的水平,并减少ATP生产(23),而这些对细胞有害的影响机制不清楚。
在这项研究中,我们关注的是识别关键分子的表达谱在RC复合物和抗氧化酶,以及线粒体biogenesis-related信号NRF1(核呼吸因子1)/ 2 / TFAM(线粒体转录因子信号)。我们的数据表明,BoHV-1感染增加的表达SDHB MTCO1,组件在线粒体RC复合物,这是支持的增加TFAM信号的表达式,因为TFAM线粒体生物起源的关键转录监管机构。此外,我们发现病毒感染广泛影响抗氧化酶的表达,比如SOD1猫,GPX4, SOD2 mRNA和蛋白水平。某些组件的异常表达在RC复合物和抗氧化酶以及NRF1/2 / TFAM信号与以前的报告,相关病毒感染刺激生产过量的活性氧和线粒体功能障碍。这些发现增加我们的知识,了解有关生产活性氧和线粒体损伤的机制由于病毒感染。
2。材料和方法
2.1。细胞和病毒
MDBK细胞在DMEM (Gibco BRL)补充10%马血清(美国UT HyClone实验室、洛根)。BoHV-1 MDBK细胞(Colorado1污点)传播。整除的病毒股储存在−70°C到使用。该病毒滴定与结果表示为TCID MDBK细胞50/毫升使用Reed-Muench公式计算。
2.2。抗体和化学品
以下化学抑制剂和抗体被用于这项研究:2-thenoyltrifluoroacetone (TTFA)(σ,# T27006),寡霉素(σ,# O4876),烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶(NOX)抑制剂二苯基碘鎓(DPI)(σ,# D2926), SOD1多克隆抗体(ABclonal # A0274 1: 1000), SOD2多克隆抗体(ABclonal # A1340 1: 1000),猫多克隆抗体(ABclonal # A11780 1: 1000), GPX4多克隆抗体(ABclonal # A11309 1: 1000), OXPHOS抗体鸡尾酒(Abcam # ab110413 1: 2000), TFAM多克隆抗体(热费希尔科学,68789年# pa5 - 1: 1000), NRF1抗体(GeneTex # pa5 - 40912, 1: 1000), NRF2抗体(Abcam # ab137550 1: 500),微管蛋白抗体(Abcam # ab18251 1: 3000),β肌动蛋白兔马伯(细胞信号技术,# 4970,1:2000),合标记anti-mouse免疫球蛋白(细胞信号技术,# 7076,1:3000),以及合标记anti-rabbit免疫球蛋白(细胞信号技术,# 7074,1:3000)。
2.3。免疫印迹分析
层的MDBK细胞感染BoHV-1 60毫米菜( )2、4、8、16个小时。细胞溶解产物是准备使用裂解缓冲(Triton x - 100 1%, 50 mM氯化钠,EDTA 1毫米,1毫米EGTA, 20毫米氟化钠、焦磷酸钠20毫米,1毫米phenylmethylsulfonyl氟化物,0.5 g / mL亮抑酶肽,苯甲脒1毫米,和1毫米在20毫米Tris-HCl原钒酸钠,pH值8.0)。各自的样本煮5分钟Laemmli样品缓冲,和所有样本在8%或10% sds - page分离。抗体用于西方的屁股上面。分析影响ROS对检测到的表达蛋白质,MDBK细胞60毫米菜是用溶剂DMSO溶液预处理或DPI (5μ米)1 h,然后感染病毒( )16 h DPI (5μ米)或DMSO溶液治疗。细胞溶解产物准备使用裂解缓冲如上所述受到免疫印迹分析。
2.4。相对量化信使rna的存在
总RNA提取使用试剂盒从感染细胞或细胞无毒性LS试剂(Ambion,猫:10296010)后,制造商的指示。刚做好的总RNA (1μg)被用作模板合成第一链cDNA与商业随机六聚物引物使用ThermoScript™rt - pcr系统工具包(表达载体,目录# 11146 - 024)后,制造商的指示。的互补产品被用作实时定量PCR模板测量表明基因的mRNA水平gene-specific引物。对于这些研究,我们分析了SOD1(正向引物:5 - - - - - -GTTGGAGACCTGGGCAATGT 3和反向引物:5 - - - - - -TCCACCCTCGC CCAAGTCAT-3 ),SOD2(正向引物:5 - - - - - -CCCATGAAGCCTTTCTAA TCCTG-3和反向引物:5 - - - - - -TTCAGAGGCGCTACTATTTCCTTC-3 ),猫(正向引物:5 - - - - - -CGCGCAGAAACCTGATGTC-3和反向引物:5 - - - - - -GGAATTCTCTCCCGGTCAAAG-3 ),GPX4(正向引物:5 - - - - - -TCACCAAG TTCCTCATTGACAAGA-3和反向引物:5 - - - - - -TTCTCGGAACACAG GCAACA-3 )(24),和GAPDH(正向引物:5 - - - - - -CCATGGAGAAGGCTGGGG-3和反向引物:5 - - - - - -AAGTTGTCATGGATGACC-3 )(25]。
分析glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH) mRNA作为内部控制。实时PCR进行了使用ABI 7500快速实时系统(应用生物系统公司,CA)。基因表达水平的检测是GAPDH规范化。每个基因的相对mRNA水平计算使用方法(2-ΔΔCT相比之下,控制细胞。
2.5。细胞活性氧测定
MDBK细胞24-well盘子是用溶剂DMSO溶液预处理或DPI (5μ米)1 h,然后感染BoHV-1 ( )或模拟感染细胞溶解产物从感染MDBK细胞抑制剂的存在DPI或DMSO控制1 h。洗后用PBS三次,包含DPI添加新鲜培养基。在感染后16小时,细胞被洗PBS和暴露于H2DCFDA ROS荧光指标(50μM)为30分钟37°C。反应混合物被替换为PBS,荧光显微镜下的图像被收购;细胞ROS的荧光强度量化与软件Image-pro + 6。
3所示。结果
3.1。呼吸复合物BoHV-1高效感染很重要
我们最初调查某些OXPHOS复合物的化学干扰是否会影响生产感染乙肝病毒抑制剂TTFA (II抑制剂对于复杂),南3(复杂IV抑制剂)和寡霉素(ATP合酶抑制剂,ATP酶)。细胞治疗与100年和200年μM TTFA导致大约1.0和1.7的日志减少病毒的产量相比,在mock-treated控制,分别(图1(一))。当感染病毒的细胞治疗1毫米的Na3N,病毒效价降低~ 1.4日志mock-treated相比控制(图1 (b))。寡霉素一块OXPHOS膜结合线粒体atp酶的抑制。当感染病毒的细胞治疗与寡霉素(200μ米),病毒效价降低相对于mock-treated ~ 1.2日志控制(图1 (c))。值得注意的是,所有的化学品都使用一个合适的浓度,以确保他们不影响细胞的生存能力(图1 (d))。这些结果表明,在RC积分过程复合体对于感染病毒生产至关重要。
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3.2。BoHV-1感染改变线粒体中的某些组件RC复合物的表达
接下来,我们检测到病毒感染是否改变了蛋白表达特定组件的线粒体RC复合物。因此,我们测量5 OXPHOS复合物的蛋白质标记使用特定的抗体对以下蛋白质:鸡尾酒NDUFB8 (NADH脱氢酶1β复形单元8)对于复杂的我,SDHB(琥珀酸脱氢酶)对于复杂的二世,细胞色素c氧化酶亚基(MTCO1)对于复杂的第四,UQCRC2 (ubiquinol-cytochrome c还原酶复杂2)对于复杂的三世,和ATP5A (ATP合酶α亚基)检测蛋白质之间的复杂诉,表达式SDHB和MTCO1被病毒感染显著增加(图2(一个))。相对于mock-infected控制,SDHB的蛋白质含量一直增加2 ~ 2倍,4、8和16小时后感染;MTCO1增加大约2 -,12 - 15 - 14倍,2,4,8和16小时后感染,分别(图2 (b)),而病毒感染没有影响NDUFB8的表达,UQCRC2和ATP5A(数字2(一个)和2 (b))。这些结果表明,病毒感染不同改变线粒体RC复合物中的某些蛋白的表达。
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3.3。BoHV-1感染不同影响某些抗氧化酶的表达包括SOD1 SOD2,猫,GPX4
线粒体功能障碍往往是同时与过早泄露的电子等(26),这可能最终导致ROS增加生产。然而,有细胞内防御系统包括精细抵消ROS生产的抗氧化酶(27]。这里,我们最初某些抗氧化酶的mRNA表达特征包括SOD1 SOD2,猫,GPX4 BoHV-1感染过程中使用中存在。当MDBK细胞被感染8和16小时,SOD1的mRNA水平,猫,GPX4一致下降而SOD2 mRNA水平显著增加(数据3(一个),3 (c),3 (e),3 (g))。在感染后8和16 h,相对于未受感染的控制,SOD1 mRNA水平下降到大约39.2% ( )和52.3% ( ),分别(图3(一个));猫mRNA水平下降到~ 15.3% ( )和19.7% ( ),分别(图3 (e));GPX4 mRNA水平下降到~ 34.3% ( )和33.4% (p分别为< 0.05)(图3 (g));和SOD2 mRNA水平增加到大约199.5% ( )和245% ( ),分别(图3 (c))。
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然而,病毒感染改变了稳态蛋白质含量的这些抗氧化酶与多样化的礼仪不同的mRNA水平。相对于控制,SOD1蛋白质水平降低到66.18% ( ),8 h后感染,但在16 h后感染,这是扭转水平接近控制(图3 (b));SOD2蛋白质含量增加到186.9% ( )在感染后8 h,然后下降到65.5% ( )(图16小时后感染3 (d));猫蛋白质水平降低到66.8% ( )(图16小时后感染3 (f));和GPX4蛋白质含量一直增加到144.1% ( )和183.5% ( )分别为8和16 h后感染,(图3 (h))。
综上所述,检测抗氧化酶的变化在两个信使rna和蛋白质表明病毒感染不同监管这些抗氧化酶的表达复杂的机制。SOD2的蛋白质含量下降和猫由于病毒感染表示对抗活性氧的生产能力下降,这是在协议与发现病毒感染刺激ROS生产过剩(图4(一))。
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3.4。BoHV-1感染刺激TFAM信号独立的规范活化剂NRF1 NRF2
TFAM信号刺激转录因子NRF1或NRF2是一个关键的转录因子调控核基因的表达需要保持线粒体呼吸功能和线粒体DNA的复制和转录(28]。然后我们调查了病毒感染的影响这些转录因子的表达。相对于控制、NRF1和NRF2增加大约114.4% ( )和136.3% ( )在2 h postinfection,然后逐渐减少,达到16 h后感染,这是减少~ 19.9% ( )和19.3% ( ),分别(图5(一个),5 (b),5 (d))。病毒感染不断增加的表达TFAM从2 h后感染,达到16 h后感染,水平增加到大约164.4% ( )相对于控制(数字5 (c)和5 (d))。这些结果表明,病毒感染刺激线粒体biogenesis-related信号TFAM独立对其规范化上游NRF1或NRF2活化剂。
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3.5。NADPH氧化酶类抑制剂DPI的表达影响NRF1和NRF2但不是TFAM
NADPH氧化酶类(nox)负责运输电子穿过生物膜生成活性氧(29日,30.]。BoHV-1侵染诱导活性氧的过量产生明显减少了氮氧化物抑制剂DPI (9,23,31日]。我们最初发现ROS生成是否刺激的病毒感染的莫伊1为16小时。正如所料,细胞内ROS水平增加到~ 2.6倍( )相对于控制,可以显著抑制DPI (5μ(图)治疗4(一))。此外,DPI治疗显著地抑制病毒复制,病毒效价下降~ 1.8日志相对于控制(图4 (b))。ROS的事实影响核转录因子kappa-light-chain-enhancer等各种转录因子激活B细胞(NF -κB)和激活蛋白1 (AP-1) [32),我们确定DPI治疗是否影响NRF1/2 / TFAM信号16 h后感染。尽管DPI (5μM)治疗显著增加NRF2的表达但没有NRF1 mock-infected细胞,它扭转了损耗NRF1和NRF2在感染病毒的细胞,获救的水平几乎一样,在未受感染的控制数据4 (c),4 (d),4 (f))。看来,DPI治疗影响的表达NRF1和NRF2不同机制。从力学上看,ROS可能消极控制NRF2但不是NRF1的表达。蛋白质含量的增加TFAM DPI (5μ米)治疗mock-infected细胞表明活性氧可能抑制TFAM表达式(数据4 (e)和4 (f)),而DPI (5μ米)治疗并不影响表达的增加TFAM在感染病毒的细胞(数字4 (e)和4 (f)),这表明ROS没有参与病毒侵染诱导TFAM表达式。
4所示。讨论
在与宿主共同进化,病毒已经开发出复杂的机制来劫持一些细胞功能有效的感染。线粒体产生的ATP主要是至关重要的不仅对维持正常的细胞功能,也为病毒来完成他们的生命周期。鉴于高度由病毒感染细胞释放ATP的被认为是一个“危险信号”和细胞外ATP抑制多种病毒的复制,包括1型单纯疱疹病毒(33],它意义为什么BoHV-1和1型单纯疱疹病毒感染下降通过ATP生产中断的线粒体功能障碍在感染的后期23,34]。1型单纯疱疹病毒感染导致线粒体功能障碍通过不同的机制,例如,在HSV-infected维洛细胞,细胞质中的线粒体迁移至细胞核周围的地区,形成一个环状结构,这是与病毒内膜蛋白UL41和UL46密切相关34];卖价1型单纯疱疹病毒蛋白可以抑制线粒体RC复合体II和III之间针对一个网站(22];与腺嘌呤核苷酸和1型单纯疱疹病毒蛋白UL7 associates转运蛋白2 (ANT2)位于内线粒体膜对交换至关重要的胞质ADP线粒体ATP (35,36]。BoHV-1感染降低线粒体膜电位(MMP)和细胞内ATP水平由过度繁殖ROS (23]。在这项研究中,第一次,我们提供了证据表明线粒体RC复合物对BoHV-1感染很重要,因为复杂的广泛使用抑制剂TTFA二世,南3对于复杂的第四,寡霉素对atp酶可以显著抑制病毒感染效率(图1)。此外,我们发现BoHV-1感染显著增加的蛋白质表达水平子单元SDHB和MTCO1线粒体RC的重要标记蛋白质复合体II和四世(图2)。组件的异常表达在线粒体RC复合物可以部分阻断线粒体的功能,支持报告BoHV-1感染减少ATP生产(23]。这一发现提供了一个证据,BoHV-1感染破坏线粒体功能的影响线粒体RC中的某些分子复合物的表达。
OXPHOS期间,电子转移等产生ATP。在压力条件下,大量的电子将退出等生成过氧化物如O2−⋅,它可以转化为过氧化氢(H2O2)在线粒体基质SOD2或SOD1的线粒体膜间隙。H2O2进一步解毒,抗氧化酶,例如GPX4猫在线粒体的酶或酶在胞质11,26]。所以,等的干扰或阻断抗氧化酶的表达会促进活性氧的生产。在这里,我们发现病毒感染显著降低SOD2的蛋白质含量和猫感染的后期阶段(16 h感染后)(数据3 (d)和3 (f)),这可能会影响他们的能力转换O2−⋅在H2O2在线粒体基质以及排毒H2O2在胞质。这些结果与我们的相关发现病毒感染增加活性氧的生产(图4(一))。
众所周知,GPX4保护细胞免受氧化应激通过催化过氧化氢的还原,有机氢过氧化物和脂质过氧化物水或相应的醇的谷胱甘肽(GSH) (37]。谷胱甘肽构成主要细胞抗氧化系统和提供了消除氧化物种的减少等价物(38]。BoHV-1感染导致谷胱甘肽在细胞培养的一个重要损耗39]。所以,这将不利于保持GPX4功能正常,但病毒感染明显增加(图GPX4表达式3 (h)),这是符合事实,病毒感染诱导活性氧的形成(图4(一))。Ferroptosis是nonapoptotic细胞死亡的模式涉及的生产iron-dependent ROS (40]。GPX4 ferroptosis已被确定为中央监管机构,以及GPX4的失活导致脂质过氧化物的积累,从而导致ferroptotic细胞死亡(38,41]。我们认为增加GPX4表达由于BoHV-1感染将有利于防止ferroptotic细胞死亡促进病毒生产感染,需要今后进一步研究。
体内平衡所需的线粒体生物起源是维持线粒体的正常功能,这主要是受TFAM信号。转录辅激活过氧物酶体proliferator-activated受体γ1α(PGC-1共激活剂α)被认为是主监管机构通过相互作用线粒体生物转化过程的两个关键核转录因子NRF1和NRF228,42]。一旦激活,PGC-1α随后激活NRF1 NRF2和下游活化剂TFAM,结合核基因的启动子区域编码线粒体RC复合物的某些子单元,从而调节目标基因的表达(43]。在这项研究中,我们发现BoHV-1感染的后期抑制NRF1和NRF2(数字的表达5(一个)- - - - - -5 (c))。虽然TFAM的表达水平,规范PGC-1的遗嘱执行人α途径,都从2增加到16 h后感染(数字5 (c)和5 (d)),这表明病毒感染与未知的机制,促进TFAM表达式NRF1或者NRF2无关。然而,TFAM表达的增加与我们的研究结果证实,病毒感染增强SDHB和MTCO1(图的表达1在线粒体RC复合物),组件。
BoHV-1相比,1型单纯疱疹病毒感染诱发TFAM损耗,从而触发mtDNA压力,进而刺激抗病毒信号和I型干扰素反应(44]。的损耗TFAM应对病毒感染可能是与启动抗病毒先天免疫反应有关。机械化,积累TFAM由于BoHV-1感染可能会降低抗病毒先天免疫反应,这是一个有趣的问题,在未来需要广泛的研究。
据报道,等氧化剂叔丁基氢过氧化物(t-BOOH), ROS模仿,增加细胞NRF1和TFAM基因表达在大鼠肝细胞和肝癌细胞(45,46]。因此我们调查ROS是否参与NRF1/2的规定使用氮抑制剂DPI和TFAM表情,已证实阻止活性氧产量([31日)和图4(一))。增强表达NRF2但不是NRF1 mock-infected DPI治疗的细胞(数字4 (c),4 (d),4 (f))表明,活性氧可能部分调节NRF2但不是NRF1的表达。有趣的是,DPI治疗可以逆转损耗NRF1和NRF2由于病毒感染(数字4 (c),4 (d),4 (f)),但是它没有影响TFAM(数据的表达4 (e)和4 (f)),这进一步证实了病毒感染刺激TFAM NRF1或NRF2信号独立。此外,DPI治疗了轻微影响的表达TFAM在病毒感染的背景下,尽管DPI治疗导致mock-infected TFAM蛋白质水平的增加细胞。因此,我们认为,某些病毒成分,如病毒蛋白和/或DNA复制周期中产生的,而不是ROS占TFAM的提升表现,在未来需要一项独立调查。
总之,我们的数据表明,BoHV-1感染导致微分表达式的某些组件在线粒体RC复合物如SDHB MTCO1,线粒体biogenesis-associated信号NFR1/2 / TFAM通路,和酶,如SOD1 SOD2,猫,和GPX4生产过量的活性氧和线粒体功能障碍有关。此外,第一次,我们发现BoHV-1感染刺激TFAM信号独立NRF1以及NRF2信号或过多的活性氧。这些发现增加我们的知识了解病毒侵染诱导活性氧的生产和线粒体损伤的机制。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
这项研究受到了中国国家重点研究和发展计划(批准号2016 yfd0500704),中国国家自然科学基金(批准号31772743),动物免疫学重点实验室,农业部和河南省级重点实验室的动物免疫学(KLAI20170602)和部分优先支持的学术程序开发江苏高等教育机构(PAPD)。