文摘
1型糖尿病(近年来)是一种代谢性疾病与全身性慢性炎症和巨噬细胞重新编程。有证据表明,这取决于增加的系统性炎症水平的白三烯B4 (LT)在近年来发现老鼠,而巨噬细胞对促炎(M1)的表型变化。尽管近年来可以纠正胰岛素管理,随着时间的推移,近年来患者可以出现胰岛素抵抗,阻碍血糖控制。在这里,我们试图探讨白细胞三烯的作用(LTs)代谢活跃的组织,如肌肉,专注于胰岛素信号通路和muscle-associated巨噬细胞。1型糖尿病在129 / SvE鼠标应变诱导链脲霉素(STZ)在小鼠体内缺乏LT合成的酶(5瞧- / -)和LT-sufficient野生型(WT)。对胰岛素的反应是评估胰岛素耐量试验(ITT),通过ELISA胰岛素浓度,一种蛋白激酶磷酸化蛋白免疫印迹。胰岛素受体的基因表达水平和巨噬细胞标记Stat1 MCP-1, Ym1, __arg1、和il - 6被qPCR评估,通过ELISA和il - 10。后我们发现政府单一剂量的胰岛素糖尿病老鼠,减少血糖在5 lo更加明显- / -比在WT老鼠。当肌肉匀浆进行了分析,糖尿病5瞧- / -老鼠表现出更高的胰岛素受体基因的表达和更高的一种蛋白激酶磷酸化。此外,在肌肉匀浆从糖尿病5瞧- / -小鼠抗炎巨噬细胞标记物的表达Ym1,__arg1il - 10增加,相对促炎细胞因子的表达il - 6降低糖尿病大鼠与WT相比。这些结果表明,LTs影响胰岛素受体信号通路,调节炎症的muscle-resident内转至小鼠巨噬细胞。
1。介绍
代谢紊乱的发生率显著增加,现在被广泛认为是严重威胁公众健康。疾病,如糖尿病、肥胖、动脉粥样硬化、痛风,代谢失衡与低级全身炎症,进而是这些疾病的病理生理学的一个决定性因素。这种情况由于某些代谢产物的积累,如葡萄糖、脂肪酸、尿酸、胆固醇,激活受体的先天免疫白细胞和诱发慢性生产促炎细胞因子和脂质介质(1- - - - - -3]。
以慢性高血糖与碳水化合物的新陈代谢,改变脂质,蛋白质(4),糖尿病是经典分为两种形式。在2型糖尿病(T2D),高血糖症是由于胰岛素抵抗成立于肝脏,肌肉,脂肪组织,这个条件是肥胖的主要危险因素5]。在近年来,高血糖的结果缺乏胰岛素生产由于胰腺的破坏β细胞通过自身免疫过程。这个条件是纠正胰岛素政府,但在治疗,近年来患者也开始出现胰岛素抵抗,和血糖控制变得越来越困难,这损害了病人的生活质量(6]。相信在近年来和T2D,胰岛素抵抗慢性炎症是由于系统性风险;然而,机制可能不同,仍然需要阐明。
在肌肉、脂肪的积累及其过氧化反应促进内质网应激,muscle-associated巨噬细胞进行重组促炎的概要文件,生产il - 6、il - 1β肿瘤坏死因子-α和脂质介质7- - - - - -10]。高水平的肿瘤坏死因子-α由这些巨噬细胞趋化因子CCL2刺激生产,导致招聘激活单核细胞( )组织(11]。通过绑定到膜肌肉细胞受体、细胞因子il - 6、il - 1β和肿瘤坏死因子-α可以诱导胰岛素抵抗[10,12]。
的脂质介质白三烯B4 (LTB4)在系统中起着核心作用的轻度炎症(13- - - - - -15)和糖尿病胰岛素抵抗动物模型的建立[10,16,17]。白细胞三烯(LTs)从花生四烯酸(AA)代谢生成5-lipoxygenase (5 lo)。花生四烯酸酯化在细胞膜磷脂从激活磷脂酶PLA2发布的。一起5 lo的其他酶代谢途径,巨噬细胞等炎性细胞能够产生大量的LTs几分钟的刺激。连同附属蛋白皮瓣(5-lipoxygenase-activating蛋白质),5 lo氧化AA,生成不稳定的中间LTA4,迅速水解生成LTB4 [16]。LTB4 G protein-coupled受体结合;BLT1高亲和性受体,并耦合到胃肠道蛋白质,从而导致细胞内的环腺苷酸水平下降。
BLT1受体的激活巨噬细胞强化吞噬,杀菌剂的活动,促炎细胞因子的生产(2]。这促炎概要内转至小鼠的巨噬细胞与血液中LTB4水平上升有关,系统性炎症和胰岛素抵抗。阻塞的LTs变化巨噬细胞抗炎概要和减少系统性炎症和胰岛素抵抗。脓毒症诱导在这些动物的时候,系统性炎症反应更强烈,动物死亡率增加。这是由LT拮抗剂逆转17]。
最近,它已经表明,高脂肪饮食的老鼠,LTB4产生脂肪组织,肌肉和肝脏。脂肪组织巨噬细胞具有促炎的概要文件和胰岛素抵抗。同样,在肥胖老鼠的肝脏和肌肉,LTB4促进炎症和胰岛素抵抗[10,16- - - - - -20.]。因此,考虑研究LTs参与炎症和他们如何可能参与代谢综合征的发展,在目前的研究中我们调查LTs参与胰岛素受体通路,一个重要的检查站通路与胰岛素抵抗有关,和巨噬细胞,一个重要的细胞在炎症过程。
2。材料和方法
2.1。动物
我们使用8-week-old,男,无菌129 / SvE野生型(WT)和5 lo淘汰赛(5瞧- / -老鼠)。动物被维护在一个受控环境22°C下12小时光暗周期与自由水和限制进入食品只有在近年来感应协议之前,如下所述。本研究进行了严格按照巴西全国委员会通过的原则和指导方针的控制动物实验(CONCEA)和动物伦理委员会批准使用(CEUA)的生物医学科学研究所(ICB)大学的圣保罗(USP) (CEUA没有。08/2014)。所有外科手术进行盐酸氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉下,和护理是减少动物痛苦。
2.2。诱导的糖尿病
近年来感应的,动物是5个小时禁食,紧随其后的是一个腹腔内(i.p)注射STZ (ChemCruz®u - 9889,很多F1816)(30毫克/公斤WT KO和25毫克/公斤,在0.1 M柠檬酸缓冲,pH值4.5);之后,动物是维持免费获取食物。这个协议持续了一段时间的连续5天。动物血糖大于300 mg / dL (OneTouch®选择简单™)10天后最后剂量被认为是糖尿病。老鼠在非糖尿病的对照组仅接受注射柠檬酸缓冲。评估体重的变化,之前的动物体重和10和17天后STZ管理。STZ-induced破坏胰腺β细胞内转的普遍接受为一个模型,描述了其他组(21,22),和之前也被标准化的实验室17,23]。
2.3。胰岛素耐量试验(ITT)
长达6个多快,老鼠收到ip注射胰岛素(Novolin®,很多CS6G140, 1.0 IU /公斤),血糖水平是决定(OneTouch®选择简单™)使用从尾静脉血样采集每30分钟。
2.4。Insulin-Induced一种蛋白激酶磷酸化
动物与氯胺酮麻醉/甲苯噻嗪(90毫克/公斤,10毫克/公斤,分别)和ip胰岛素注射后5分钟,组织样本收集和浸渍(Polytron PT 1600 e)里帕缓冲区(50毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH值8.0,150毫米氯化钠,Triton x - 100, 1%和0.1% SDS)含有蛋白酶抑制剂(Sigma-Aldrich),原钒酸盐、氟化物和随后离心机( 5分钟)。
2.5。测量血清胰岛素水平
从近年来收集后全血和控制老鼠,样本离心20分钟 (血清分离)。血清胰岛素浓度确定使用胰岛素工具包(胰岛素鼠标酶联免疫试剂盒,很多534070518,热费希尔科学)。测试是基于胰岛素样本的容量与acetylcholinesterase-conjugated胰岛素竞争为特定抗体绑定。阅读是在414 nm标(时代微型板块分光光度计,BioTek仪器),和ng / mL表达的结果。
2.6。西方墨点法
测定样品中的蛋白质浓度(BCA化验设备,热费希尔科学)。等量的蛋白质分离的电泳(sds - page)和转移到硝化纤维素膜。非特异性结合后阻塞(脱脂干脱脂奶粉),一夜之间,细胞膜被孵化在4°C下恒定搅拌主要抗体特定pAkt Ser 473(1: 2000年,细胞信号技术,很多0019)β肌动蛋白(1:1000,细胞信号技术,很多0017)。Anti-rabbit免疫球蛋白g(1: 3000,细胞信号技术,很多0025)被用作二次抗体。西方表达可视化使用SuperSignal®Pico化学发光底物(很多PD202858,热费希尔科学)。
2.7。RNA净化和实时PCR分析
从组织匀浆总RNA提取如前所述[24]。使用RevertAid互补脱氧核糖核酸合成第一链cDNA合成装备(00376305,热费希尔科学)和执行qPCR使用引物Irs1,Insr,il - 6,__arg1,Stat1,Ym1,Mcp1(所有从Exxtend®)应用生物系统公司StepOnePlus™实时PCR系统(热费希尔科学)。相对表达式是使用比较阈值计算周期(Ct),表示相对于控制(ΔΔCt方法)。
2.8。肌匀浆
组织样本分别收集到的老鼠和均质与组织均质器里帕缓冲区(Polytron PT 1600 e)。的上层清液被离心分离细胞碎片 10分钟,收集和储存在−80°C。匀浆中的蛋白质浓度测定使用商业套装(皮尔斯™BCA蛋白质化验设备,很多PE203766,热费希尔科学)。分析是根据制造商的手册执行。吸光度值使用微型板块在562 nm获得读者(SpectraMax 190标)。
2.9。细胞因子量化
il - 10在组织匀浆上清液的浓度测定采用BD OptEIA™ELISA组(BD生物科学)后,制造商的协议。
2.10。数据分析
数据处理和分析,方差分析(方差分析)和Bonferroni后续测试或未配对t测试使用GraphPad Prism 6.0软件(La Jolla、钙、美国)。双尾值和95%置信区间。数据的表示 平均误差(SEM)。的值 被认为是重要的。
3所示。结果
3.1。内转至模型的描述
图1说明了实验协议使用。在WT和5瞧- / -老鼠,STZ(60毫克/公斤)是由腹腔注射剂量超过5天。每剂之前,老鼠为5个小时禁食,注射后30分钟,他们维持免费获取食物和水(图1(一))。血糖水平测量最后剂量STZ三天后,只有小鼠血糖大于300 mg / dL被用于实验(图1 (b))。身体减肥是近年来的症状之一,在我们的研究中WT和5瞧- / -糖尿病小鼠有明显的身体减肥与健康小鼠相比(图1 (c))。
(一)
(b)
(c)
3.2。胰岛素信号通路在近年来
糖尿病小鼠报胰岛素耐量试验。后腹腔注射胰岛素(1.0 IU /公斤),血糖水平是决定每30分钟。这是观察到糖尿病小鼠WT提出很难控制血糖水平随着时间的推移,而5瞧- / -糖尿病小鼠能够控制他们的血糖,表明胰岛素通路中的作用LTs(图2(一个))。当血清胰岛素的生产评估,这是观察到糖尿病小鼠的两组(5- / -和WT)呈现显著降低胰岛素含量与非糖尿病患者相比控制(图2 (b))。
(一)
(b)
胰岛素受体的基因表达在股四头肌和腓肠肌肌匀浆WT罗和5之间没有明显不同- / -老鼠。然而,在糖尿病5瞧- / -老鼠,胰岛素受体的表达明显高于糖尿病小鼠WT(数字3(一个)和3 (b))。在数据3 (c)和3 (d),我们可以看到,在胰岛素管理糖尿病患者和健康小鼠,肌肉从糖尿病5瞧- / -有更高水平的pAkt比WT糖尿病小鼠。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.3。Muscle-Associated巨噬细胞内转概要文件
评估炎症内转至小鼠的肌肉,我们分析了巨噬细胞的一些标记的表达在股四头肌和腓肠肌肌肉。这些组织匀浆的获得,巨噬细胞标记的mRNA表达测量的沉淀,上层清液中细胞因子。我们将展示在图4获得的结果在肌股四头肌。类似的模式中观察到腓肠肌(数据没有显示)。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
促炎巨噬细胞标记物的表达Stat1和Mcp-1(CCL2)没有不同组。然而,促炎细胞因子的表达il - 6在糖尿病大鼠明显增加的肌肉但只有在那些能够产生LTs(数据吗4(一)- - - - - -4 (c))。抗炎巨噬细胞标记物的表达Ym1和__arg1和抗炎的il - 10(数字4 (d)- - - - - -4 (f))在糖尿病高5瞧- / -老鼠相比,糖尿病WT。
4所示。讨论
胰岛素抵抗的机制已经T2D中描述,但在近年来这些机制还不太清楚。在目前的研究中,我们调查了LTs参与肌肉中胰岛素抵抗的发展,代谢活跃的组织。这是发现,在糖尿病小鼠,LTs下调小鼠的胰岛素信号通路在肌肉使用胰岛素。此外,LTs转移muscle-associated巨噬细胞炎性表型。
近年来使用STZ诱导化学抗生素,杀死胰腺分泌胰岛素的β细胞,从而导致胰岛素分泌不足,胰岛素抵抗和胰岛细胞的慢性炎症。因为这些症状与近年来的人类,用STZ已经成为受欢迎的作为一个模型近年来的老鼠和老鼠21]。2015年,吴和梁22)表明,单剂量STZ虽然不足以诱导胰岛素抵抗,是能够保持高血糖。我们改编的原始模型给五个剂量超过1周,最后剂量后,所有老鼠体重都明显减轻,表现出多尿症,有很高的血糖水平。另外,我们观察到一种蛋白激酶的磷酸化的肌肉,这是表明胰岛素抵抗。
胰岛素抵抗是许多代谢疾病的病理特征。确认LTs产生在近年来促进胰岛素抵抗、糖尿病WT的反应和5- / -小鼠胰岛素最初评估。我们观察到,在单一剂量的胰岛素,糖尿病5瞧- / -小鼠血糖降低大于WT糖尿病老鼠。李等人。(10),尽管et al。18T2D]表明,LTB4受体的激活BLT1胰岛素受体的差别导致了对这些级联,阻断胰岛素受体底物的作用,导致胰岛素抵抗。在我们的研究中也观察到同样的模式。我们观察到,即使是低水平的血清胰岛素,糖尿病5瞧- / -老鼠表现出更高的胰岛素受体基因表达在肌肉测试。与一个剂量的胰岛素治疗后,只有糖尿病5瞧- / -老鼠能恢复一种蛋白激酶的磷酸化,胰岛素信号通路的重要分子。这些数据表明,类似于发生在T2D, LTs也在近年来影响胰岛素信号级联。
它被描述在骨骼横纹肌组织,包括股四头肌和腓肠肌,T2D诱发的表达减少促炎细胞因子il - 6和il - 10水平(25]。我们的结果表明,这也发生在近年来;此外,我们表明,近年来老鼠无法产生LTs(5瞧- / -)产生了更高的抗炎细胞因子il - 10,这表明糖尿病老鼠,在缺乏LTs muscle-associated巨噬细胞获得抗炎概要文件。金等。26]表明,il - 6减少骨骼肌胰岛素作用和信号,这印证了我们的研究结果表明,更高的il - 6表达与较低的胰岛素受体的表达和一种蛋白激酶磷酸化在糖尿病WT老鼠的肌肉。香港et al。25)显示,在食源性胰岛素抵抗模型,与il - 10治疗预防胰岛素抵抗,增加了一种蛋白激酶磷酸化。这些发现类似糖尿病的肌肉中发现5瞧- / -在目前的研究中,老鼠增加pAKT和il - 10水平观察。此外,在一项研究结果表明,T2D小鼠系统性LTB4水平高于健康小鼠(20.]。在一起,这些结果表明,在糖尿病小鼠,增加LT水平下调胰岛素信号通路,从而导致肌肉的胰岛素抵抗。他们还帮助我们理解机制负责胰岛素抵抗的发展近年来参与的。
它最近已被证明在腹膜巨噬细胞内转至5- / -小鼠抗炎巨噬细胞标记物的表达(__arg1和Ym1)增强,而WT巨噬细胞表达高水平的促炎的标记。同时,系统性炎症是内转至5瞧没那么强烈- / -老鼠比WT。这表明一个重要的角色的LTs系统性炎症在糖尿病的发展和重组的组织巨噬细胞对促炎的表型(26]。在这里,我们表明,巨噬细胞的居民LTs内转至小鼠肌肉也同样重新编程。
数据可用性
背后的价值观意味着,标准差和其他措施报告的数据支持本研究的发现可以从相应的作者在获得合理的请求(Joilson de Oliveira马丁斯,博士(电子邮件保护))。
信息披露
投资者没有参与讨论的主题或学习材料的选择在这个手稿。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突,偏见的公正科学的工作。
确认
作者真诚地感谢Marlise伯内蒂Agostinho蒙特斯技术专家的帮助。作者支持赠款2013/15719-0并从圣保罗2017/11540-7研究基金会(FAPESP)必须占州政府和赠款302903/2016-0 301617/2016-3国家科学和技术发展委员会(CNPq) Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de含量比(披肩)和Pro-Reitoria德尽管如此,圣保罗(PRP / USP),巴西。