Remifentanil防止Lipopolysaccharide-Induced通过PARP-1 / NF -炎症κB信号通路

文摘

脓毒症是严重感染患者死亡的主要原因。Remifentanil是一个超,强有力的阿片类药物镇痛。在这项研究中,我们旨在调查的作用和基本机制remifentanil在脂多糖(LPS)诱导炎症在人类主动脉内皮细胞(HAECs)。HAECs使用磷酸盐(PBS)或remifentanil (2.5μ米)30分钟,然后由有限合伙人(10刺激μ另一个24小时的g / ml)。保利(ADP-ribose)聚合酶1 (PARP-1)抑制了小干扰RNA (siRNA)。超氧化物阴离子生产和DNA损伤分析dihydroethidium(她)染色和彗星试验。诱导一氧化氮合酶(间接宾语),细胞间粘附分子1 (ICAM-1) PARP-1,保利(ADP-ribose) (PAR)和核factor-kappa B p65 (NF -κB p65)表达式分析了rt - pcr和免疫印迹分析。NF -κB p65核易位被免疫荧光评估。与对照组相比,预处理与remifentanil显著降低超氧化物阴离子生产和DNA损伤,进气阀打开,差别与对这些ICAM-1, PARP-1表达式以及标准表达式。此外,预处理与PARP-1 siRNA或remifentanil抑制LPS-induced NF -κB p65表达式和核易位。Remifentanil减少LPS-induced通过PARP-1 / NF -炎症反应κB信号通路。Remifentanil可能发生在败血症患者镇痛的最佳选择。

1。介绍

脓毒症导致危及生命的组织损伤和器官功能障碍发生当一个特异表达宿主对感染(1]。这是一个严重的情况下15 - 20%的死亡率和发病率(短期和长期2,3]。脓毒症的特点是不仅增加了炎症反应,而且免疫抑制(4]。不适当的反应的影响感染导致细胞功能障碍和器官衰竭。脂多糖(LPS),外革兰氏阴性细菌的细胞壁的主要成分,是诱发各种炎性细胞因子的生产,这是公认的主成分在脓毒症的原因5]。尽管许多研究旨在调查机制和脓毒症或脓毒性休克的治疗方法,其病因尚不清楚和预后仍然是穷人。

聚ADP-ribose polymerase-1 (PARP-1)是核酶,这种酶是由DNA损伤激活(6]。它是参与关键转录因子的调控,如核factor-kappa (NF - BκB),调节基因的表达,包括细胞间粘附分子1 (ICAM-1)和诱导一氧化氮合酶(间接宾语),并产生深远的炎症反应(7,8]。大量的研究以及解决PARP-1激活参与炎症性疾病,如心肌再灌注损伤、中风、休克、和腹主动脉瘤9- - - - - -11]。

Remifentanil,一个强有力的μ阿片受体激动剂,合成超阿片类药物。它可以由特异性的血浆和组织酯酶代谢,从而影响肾或肝功能12]。已经证明remifentanil降低il - 6生产和伊诺脓毒性小鼠(13]。remifentanil影响治疗嗜中性粒细胞通过单层内皮细胞迁移,以及粘附分子表达(14]。此外,remifentanil证明发挥保护作用的多种疾病,如急性肺损伤、缺血/再灌注损伤,excitotoxic脑损伤(5,15,16]。然而,remifentanil在脓毒症的潜在作用和机制尚未被充分调查。

在目前的研究中,我们旨在调查的作用和基本机制remifentanil LPS-induced炎症反应在人类主动脉内皮细胞(HAECs)。

2。材料和方法

所有实验在这个研究是山东大学的伦理委员会批准。

2.1。细胞培养

美国HAECs(写明ATCC)培养在24-well 10板的密度⁵在内皮细胞中(美国ScienCell ECM, CA)补充5%胎牛血清的边后卫,100 U /毫升青霉素,100μg / ml链霉素在37°C。HAECs被随机分为三组:对照组,有限合伙人+ PBS组,有限合伙人+ remifentanil组。在有限合伙人+ PBS或有限合伙人+ remifentanil组,细胞用PBS预处理或remifentanil (2.5μ米,Renfu,中国)1730分钟),然后由有限合伙人(10刺激μg / ml, Sigma-Aldrich,密苏里州,美国)另一个24小时(18]。有限合伙人在无菌水溶解,细胞培养基中添加。细胞被渴望刺激前24小时。

2.2。核转染

抑制PARP-1表达式,HAECs与PARP-1转染核(sc - 29437,圣克鲁斯生物技术、钙、美国)或消极控制Opti-MEM介质(表达载体、钙、美国)利用Lipofectamine 3000(表达载体)。实验进行转染后24小时。

2.3。实时聚合酶链反应(rt - pcr)

RNA被使用从HAECs提取试剂盒(表达载体、钙、美国)。然后,互补脱氧核糖核酸rt - pcr分析的智商™SYBR绿色Supermix (Bio-Rad实验室、CA、美国)。的引物如表所示1。扩增、检测和数据分析所涉及的使用iCycler实时PCR系统(Bio-Rad实验室)。实时程序包括最初的变性阶段1.5分钟在95°C, 40周期为15秒95°C,对30年代和60°C。个别样本运行一式三份,每个实验重复了三遍。的方法用于分析相关基因表达的变化。

2.4。免疫印迹分析

等量的蛋白质提取HAECs 10% sds - page分离,在硝化纤维膜electro-transferred(美国新泽西州Amersham生物科学)。被屏蔽后5%脱脂牛奶在室温下2小时,屁股都洗TBS-T 3 * 10分钟和孵化主要抗体在一夜之间在4°C。主要的抗体如下:反β肌动蛋白(1:1000,细胞信号技术,妈,美国),anti-PARP-1(1: 500年,Sigma-Aldrich) anti-PAR (Abcam 1: 1000年,妈,美国),anti-iNOS (Abcam 1: 200年,妈,美国),anti-ICAM-1 (1: 500;圣克鲁斯生物技术、钙、美国),anti-NF -κB p65(1: 1000年,细胞信号技术)。在TBS-T洗后,膜与二次孵化抗体在室温下2小时。增强化学发光信号进行检测(美国微孔,MA)和分析利用Image-Pro + 6.0。

2.5。生产

dihydroethidium(她;Beyotime,北京)是用来测量生产HAECs描述(11]。简单地说,在5细胞被孵化μ米她30分钟37°C在轻防护环境中,然后与ECM的边后卫没有洗3次。荧光被使用荧光显微镜收购在535海里。

2.6。彗星试验

DNA损伤被使用彗星试验评估工具包(Trevigen,医学博士,美国)如前所述[19]。彗星的尾巴长度测量荧光显微法,然后分析了使用CaspLab彗星试验软件v1.5(弗吉尼亚州Summerduck Tritek公司)。每组十细胞进行了分析。

2.7。免疫荧光

HAECs用PBS预处理或remifentanil 30分钟,然后由LPS刺激另一个2 h。然后,细胞被固定在4%多聚甲醛(Beyotime,北京)和permeabilized PBS中含0.1% Triton x - 100。与BSA 30分钟被屏蔽后,样本与初级抗体兔子anti-NF -孵化κB p65(1: 100年,细胞信号技术)在一夜之间在4°C。Alexa 488 -共轭山羊anti-rabbit免疫球蛋白g(1: 500年,杰克逊ImmunoResearch Inc . PA,美国)被用作二次抗体。一滴延长黄金不变色试剂与4 ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI;向量实验室、CA、美国)被用来密封的盖玻片。图像是通过激光扫描共焦显微镜(LSM 710、蔡司、德国)。数据分析使用Image-Pro + 6.0。

2.8。统计分析

数据表示为 。Windows v16.0 SPSS(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)是用于统计分析。组间比较涉及2-tailed学生测试或单向方差分析。一个 被认为是显示统计学意义。

3所示。结果

3.1。Remifentanil超氧化物阴离子减少生产和DNA损伤

首先,我们调查了remifentanil对氧化应激的影响。超氧化物阴离子生产和DNA损伤被她染色和彗星试验分析。她染色显示,与对照组相比,有限合伙人增加超氧化物阴离子生产,并与remifentanil显著降低(数据预处理1(一)和1 (b))。如图所示的彗星试验数据1 (c)和1 (d),很少有DNA的尾巴在对照组,而remifentanil减少LPS-increased尾部DNA含量。这些结果表明remifentanil LPS-induced减少氧化应激和DNA损伤。

3.2。Remifentanil减少伊诺和ICAM-1表达式

考虑在脓毒症炎症反应的重要作用,我们测量的影响remifentanil HAECs伊诺和ICAM-1表情。RT PCR结果表明LPS刺激明显增加伊诺和ICAM-1 mRNA表达与控制细胞。预处理与remifentanil显著降低伊诺和ICAM-1 mRNA表达(数字2(一个)和2 (b))。免疫印迹分析也显示出类似的结果(数据2 (c)来2 (e))。这些结果表明,remifentanil可以减少LPS-induced炎症反应。

3.3。Remifentanil PARP-1表达式和活动减少

然后,我们调查了remifentanil抗炎效应的可能机制。作为核蛋白质,PARP-1与各种炎性细胞因子的表达密切相关。因此,我们首先研究了PARP-1 remifentanil的效果。如图3,LPS刺激尤其是PARP-1 mRNA和蛋白表达以及活动增加表达式(PAR)与对照组相比,尽管remifentanil可以减少PARP-1和PAR表达式。

3.4。Remifentanil抑制LPS-Induced NF -κB p65核易位和表达式

PARP-1 siRNA用于以下实验。首先,PARP-1表达式被RT-PCT评估和免疫印迹分析验证效率。如数据所示4(一)- - - - - -4 (c),PARP-1 siRNA可以显著降低PARP-1的mRNA和蛋白表达。NF -考虑到重要的作用κB在伊诺和ICAM-1表达,我们怀疑remifentanil与缺陷有关的抗炎效果NF -κB激活。图4 (d)表明NF -κB p65 LPS刺激之前主要是细胞质,但其本地化LPS刺激后迅速改变原子核。如果使用remifentanil HAECs, p65主要仍LPS刺激后细胞质。此外,PARP-1 remifentanil抑制显示类似的效果。然后,我们测量p65蛋白表达。有限合伙人可以显著提高p65表达与控制相比,而小干扰rna或者remifentanil减少PARP-1(数字4 (e)和4 (f))。这些结果表明,通过PARP-1 / NF - remifentanil发挥抗炎作用κB通路。

4所示。讨论

我们的研究表明,remifentanil变弱LPS-induced氧化应激和炎症反应主要是通过抑制PARP-1 / NF -κB信号通路,这可能直接的临床意义。Remifentanil可能是一个更好的镇痛在脓毒症或脓毒性休克。

败血症是诱导活性氧的形成和脂质过氧化反应产品在不同靶器官(20.,21]。氧自由基超氧化物阴离子( )来自多个源的形成,包括线粒体功能失调、黄嘌呤氧化酶,NADPH氧化酶,儿茶酚胺自动氧化(22]。Remifentanil是一个超phenylpiperidine阿片类药物镇痛迅速代谢的非特异性酯酶血液和组织。在临床实践中,remifentanil常用,因为它很容易被给予高剂量和滴定,使术后快速恢复。Remifentanil预处理可以减弱心肌缺血再灌注损伤(23,24]。也证明了remifentanil预处理降低缺血后心肌梗死和改善左心室功能17]。在我们的实验中,我们发现,有限合伙人模拟增加超氧化物阴离子生产和诱导的DNA损伤,而预处理remifentanil可能减少的影响。

脓毒症的炎症反应是一个初始的特征。注意力集中在脓毒症的免疫反应的促炎方面,主要是因为典型的早期促炎细胞因子TNF和il - 1是第一个显示诱导动物器官衰竭(1]。ICAM-1数量和伊诺也在升高患者的炎症状态,如脓毒症(25]。一些实验数据表明,伊诺的抑制可能是一个重要的治疗目标治疗脓毒性休克患者,粘附分子(如ICAM-1)与脓毒症的严重性相关综合症(26,27]。我们还发现,LPS刺激的mRNA和蛋白表达显著增加伊诺和ICAM-1。然而,remifentanil可以减少LPS-induced表达式伊诺和ICAM-1 remifentanil建议抗炎作用。

PARP-1 DNA repair-associated核酶,这种酶被激活以应对DNA损伤(28]。PARP-1消耗烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)催化的PAR (ADP-ribose聚合物),他们的目标蛋白质,可以修改它们的功能、交互、或亚细胞定位29日]。过度激活PARP-1导致胞内NAD和ATP的损耗,从而导致细胞的能源危机,细胞毒性,甚至细胞死亡(30.]。我们的研究发现,有限合伙人可以增加PARP-1表达和激活诱导的DNA损伤,而预处理remifentanil减少DNA损伤,PARP-1和差别,对这些标准。

转录因子NF -κB中起关键作用关键炎症基因的调控和监管机构的细胞生存和增殖31日]。活跃的绑定形式的NF -κB组成的各种组合的成员NF -κB / Rel家庭。NF -κB复杂仍不活跃在细胞质中通过交互抑制蛋白质抑制剂κ(我κ激活NF - B)。κ我需要磷酸化κBα由我κBα激酶和随后的退化(32]。在巨噬细胞来源于PARP-1基因敲除小鼠,NF -κB p65仍主要是胞质治疗过程中有限合伙人(33]。在我们的实验中,我们还发现,LPS刺激诱导NF -κB p65易位从细胞质到细胞核。然而,NF -κB p65仍主要是胞质,如果HAECs使用remifentanil有限合伙人。与此同时,由核也抑制NF - PARP-1抑制κB p65核易位。我们之前一起发现remifentanil可以减少LPS-increased PARP-1表达式和活动,我们的实验表明通过PARP-1 / NF - remifentanil抑制炎症反应κB通路。

在实验中有一些限制。我们只是执行在体外实验,在活的有机体内以及临床试验将在以下进行实验。

综上所述,据我们所知,这是第一次,我们已经表明,remifentanil LPS-induced减少氧化应激和DNA损伤,以减少通过PARP-1 / NF -伊诺和ICAM-1表情κB信号通路。Remifentanil是更好的选择的使用镇痛在脓毒症。

5。结论

我们的研究发现,remifentanil减少LPS-induced伊诺,通过PARP-1 / NF - ICAM-1表达式κ在HAECs B信号通路。Remifentanil可能发生在败血症患者镇痛的更好的选择。然而,额外的证据应当提供在动物模型和临床试验。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益竞争。

作者的贡献

Jian-ning张、杨马和魏喜宴了同样的工作。

确认

这项工作是支持的一个项目由中国博士后科学基金会资助(2018 m630788)和山东省自然科学基金(Nos ZR201807061161和ZR2019PH007)。

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版权

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