文摘
免疫性血小板减少症(ITP)是一种常见的自身免疫性疾病,和促血小板生成素(TPO)是一种重要的细胞因子,调节巨核细胞和血小板的生产。我们已经确定了生物活性成分,icaritin,从中国草epimedii提取。Icaritin促进血小板生产和调节T细胞的极化,但其机制尚不清楚。在这项研究中,ITP的BALB / c小鼠模型建立了每隔一天注射抗血小板抗体的七倍。抗血小板血清来自几内亚猪的血小板免疫BALB / c小鼠。老鼠在ITP治疗与icaritin低,温和,或高剂量的4.73,9.45,和18.90毫克/公斤,分别连续14天。目前的研究表明,icaritin可显著提高外周血血小板计数和血小板压积,增加血清TPO水平,减弱脾肿大,减少异常脾脏和骨髓巨核细胞的增殖。Icaritin还可以下调表达的骨髓传真照片,骨髓白血病病毒致癌基因(MPL)和p-Stat3。我们的研究结果表明,icaritin可以显著提高小鼠的健康通过p-Stat3的差别可能对这些基因的表达与ITP JAK2 / Stat3磷酸化信号通路和调控骨髓传真照片/ MPL新陈代谢。
1。介绍
免疫性血小板减少症(ITP)也被称为自身免疫性血小板减少性紫癜或特发性血小板减少性紫癜,出血和这是一种常见的自身免疫性疾病。减少外围血小板计数和出血是其主要临床表现1]。Autoantibody-mediated体液immunity-induced血小板破坏是非常重要的在这种疾病的发病机制2]。国际旅游业伙伴关系占了大约1/3的出血失调。ITP的发生率大约是每100000名成年人(2到4例3]。60岁以上的老年人年是这种疾病的高发人群,导致广泛的皮肤和粘膜出血、鼻衄。严重的病例引起内脏和颅内出血,危及生命(4]。
促血小板生成素(TPO)是关键细胞因子,促进巨核细胞和血小板的生成,它主要是在肝脏合成(5]。TPO受体体内骨髓白血病病毒致癌基因(MPL),也称为CD110。MPL的表达起着重要的作用在调节巨核细胞生产。MPL过度产生巨核细胞过度增殖和血小板增加生产。巨核细胞增殖时减毒MPL表达不足或缺失,导致血小板减少症的发展(6]。血清TPO水平是用来区分血小板减少的病因和评估房产申诉专员署受体激动剂治疗的效果(7]。房产申诉专员署结合MPL激活一系列信号通路,如JAK / Stat PI3K / Akt, Ras / MAPK [8),将细胞外的信号传送给细胞核,促进复制,成熟,和巨核细胞祖细胞的分化,从而增加外周血中血小板的数量(9- - - - - -11]。
Icaritin是一个单体化合物,水解产生的淫羊藿,浓度的黄酮类成分提取淫羊藿林恩。图1显示icaritin的化学结构。Icaritin促进造血功能,抑制肿瘤细胞分化,提高免疫功能,调节内分泌系统,展品炎症活动(12- - - - - -16]。Nanooral准备创建icaritin改善其吸收速率,这些准备工作促进血小板生产和调节T细胞极化(15]。本研究调查的影响icaritin nanopreparations (Y003)小鼠ITP巨核细胞并阐明其机制,传真照片,MPL在脾脏和骨髓。
2。材料和方法
2.1。动物
雄性BALB / c小鼠(SCXK (Jing) 2016 - 0011年,北京,中国)(6 - 8周大,体重19到24 g)和男性哈特利豚鼠(SCXK (Jing) 2016 - 0001年,北京,中国)(6周大,体重300 - 400克)是购自北京重要河流实验动物技术有限公司老鼠维持在一个控制温度(24±2°c)和位于单独的笼子里(12 h光/暗周期)提供食物和水随意。北京大学动物伦理委员会批准所有的实验程序。北京大学动物保健和使用委员会批准的实验过程,涉及使用动物。
2.2。准备与ITP的老鼠
豚鼠anti-mouse血小板抗血清(GP-APS)据报道制备方法(17,18)做了一些调整。动物进行麻醉,血液收集包含EDTA-K塑胶管2(15毫克/毫升;美国AMRESCO)和离心机在1000 r /分钟10分钟,和上层清液(富含血小板血浆)离心机在3000 r /分钟10分钟。上层清液被丢弃,血小板被沉淀。沉淀与PBS洗了三次,浮在表面的被丢弃。10的血小板悬液9细胞/毫升准备使用生理盐水。血小板悬液混合同等体积的完全弗氏佐剂和完全弗氏佐剂(σ,美国)通过超声波。血液与EDTA-K2离心机在800 r /分钟10分钟,包含红细胞收集和沉淀。盐添加5%的红细胞悬液做准备。包含完全弗氏佐剂的血小板悬液注射皮下至少4分爪子和豚鼠背部和腹部的第一周。包含不完全弗氏佐剂的血小板悬液注射以同样的方式在随后的4周。每个注入体积1毫升/身体。豚鼠血清含抗血小板抗体在第六周收集。豚鼠血清在56°C加热30分钟灭活的补充。等量的BALB / c小鼠红细胞悬液添加5%,和混合是在37°c的环境中1小时。混合物在3000 r /分钟离心10分钟,沉淀是丢弃。这一步进行两次准备1:4 GP-APS。 The 1 : 4 GP-APS was stored at −20°C prior to use.
2.3。动物分组和治疗
六十BALB / c小鼠根据体重随机分为6组,每组10老鼠。1:4 GP-APS在室温下是腹腔内注入BALB / c小鼠(100μL /老鼠)每隔一天在所有组除了空白控制老鼠七倍。GP-APS后给出了一个小时后,我们管理Y003 intragastrically每天连续14天低,温和,和高剂量的4.73,9.45,和18.90毫克/公斤。rhTPO组皮下接种在每天30000 U /公斤。与生理盐水对照组和模型组管理。
2.4。血液细胞计数
从轨道静脉血液收集的老鼠的实验与抗凝剂和混合稀释。血液细胞计数测量使用mek - 6318 k的血细胞分析仪(日本Kohden、日本)在2小时内,每组的外周血和参数进行了分析。
2.5。测定血清中传真照片使用酶联免疫吸附试验
血清TPO浓度测定的酶联免疫吸附试验(ELISA、研发系统、美国)根据制造商的指示。血清TPO水平组之间的差异进行了分析。
2.6。脾脏指数
小鼠体重,在实验的最后牺牲。脾脏是立即收集并称重。脾脏外观和形态学检查堵塞。脾脏指数计算使用以下公式:脾脏指数=脾湿重/体重。组之间的差异进行了分析。
2.7。组织病理学检查脾脏和股骨
脾脏和左股骨孤立的实验并存储在4%多聚甲醛溶液48小时。样品受到常规脱水和切成5μ石蜡切片。Hematoxylin-eosin染色(Servicebio,武汉,中国),脾脏的形态结构,光学显微镜下观察股骨,巨核细胞据报道方法(17,18)做了一些调整。六个随机领域每片200倍显微镜下观察巨核细胞计数。巨核细胞的数量在股骨和脾脏进行了分析。
2.8。使用免疫组织化学检测传真照片表达的股骨19]
石蜡的股骨常规脱蜡,水化,放置在EDTA抗原检索缓冲区(pH值8.0;Servicebio,武汉,中国)。部分是冷却、冲洗和PBS和孵化3%过氧化氢溶液在室温下(Servicebio、武汉、中国)在黑暗中25分钟阻断内源性过氧化物酶活性。部分与PBS冲洗和阻止3% BSA (Servicebio、武汉、中国)在室温下30分钟。部分是孵化主要anti-TPO兔多克隆抗体(Abcam 1: 200年,英国)一夜之间在4°C。主要抗体孵育后,部分与PBS冲洗,孵化与peroxidase-conjugated山羊anti-rabbit二级抗体(KPL 1: 200年,美国)50分钟在室温下,用diaminobenzidine可视化,与苏木精复染色。三个随机领域每片200倍显微镜下观察和传真照片表达进行了分析。
2.9。检测MPL表达式使用免疫组织化学的股骨
样本进行预处理以同样的方式描述的部分2。8。一个anti-MPL兔多克隆抗体(bios 1: 200年,中国)作为主要的抗体,和部分在一夜之间在4°C的环境中。部分与PBS冲洗,孵化peroxidase-conjugated山羊anti-rabbit二级抗体(KPL 1: 200年,美国)50分钟在室温下,用diaminobenzidine可视化,与苏木精复染色。三个随机领域每片200倍显微镜下观察,和MPL-positive巨核细胞分析与一些修改(根据之前报道的方法20.]。
2.10。表达p-Stat3使用免疫组织化学的股骨
预处理部分中描述2。8。一夜之间,部分被孵化与主抗体p-Stat3兔多克隆抗体(Abcam 1: 200年,英国)在4°C。主要抗体孵育后,部分与PBS冲洗,孵化与peroxidase-conjugated山羊anti-rabbit二级抗体(KPL 1: 200年,美国)50分钟在室温下,用diaminobenzidine可视化,与苏木精复染色。三个随机领域每片200倍显微镜下观察和p-Stat3-positive巨核细胞是根据之前统计分析方法与一些修改(18]。
2.11。统计分析
外周血细胞计数表示为平均数±标准差,表示为均值±SEM和其他结果。的意义使用单向方差分析组之间的差异进行了分析。
3所示。结果
3.1。血液细胞计数结果
表1显示外周血细胞计数的结果。PLT和外周血PCT显著降低模型组与对照组(相比值< 0.001)。PLT和PCT显著增加rhTPO-treated组相比,模型组( , )。PLT PCT在低、中,高剂量的icaritin组也显著增加(3值< 0.001)。淫羊藿显著增加浓度这些结果表明小鼠外周血血小板计数的ITP和改善血小板减少症的症状。连续注射GP-APS导致更大的外周血中血小板的破坏,增加了MPV ( ),低剂量的减少icaritin MPV ( )。MCV和中期显著增加( , )、MCHC显著降低( )与对照组相比,模型组。MCV、中期或MCHC ITP小鼠icaritin管理没有变化。
3.2。用ELISA检测血清TPO水平
图2结果显示血清TPO水平。TPO水平与对照组相比,模型组减少( )。TPO水平rhTPO-treated组与模型组相比增加( )。TPO水平显著增加( , icaritin-treated的),中、高剂量组与模型组相比。这些结果表明,icaritin提升血清TPO表达ITP老鼠。
3.3。脾脏指数
图3显示脾脏指数的结果。模型组脾脏指数明显肥大,和脾脏指数显著增加相比,对照组( )。脾脏指数rhTPO-treated组明显低于模型组( )。低,中,高剂量的icaritin-treated组显示脾脏指数明显降低(3值< 0.001)。这些结果说明icaritin显著改善小鼠ITP脾脏肥大的症状。
3.4。脾组织病理学
图4(一)显示了他染色结果的脾脏。巨核细胞的数量在脾脏明显增加模型组与对照组( )。巨核细胞的数量在脾脏rhTPO-treated组明显低于模型组( )。在脾脏巨核细胞的数量也显著降低(3值< 0.001)在三个icaritin-treated组相比,模型组(图4 (b))。组织病理学显示icaritin显著降低小鼠脾脏巨核细胞的数量与ITP和改善脾巨核细胞的扩散。
(一)
(b)
3.5。股骨组织病理学
图5(一个)显示股骨他染色结果。在骨髓中巨核细胞的数量显著增加的模型组与对照组( )。骨髓巨核细胞的数量在rhTPO-treated组明显低于模型组( )。低,中,高剂量的icaritin-treated组显著减少(3值< 0.001)骨髓巨核细胞的数量相比,模型组(图5 (b))。图5 (c)显示了股房产申诉专员署免疫组织化学。房产申诉专员署表达式在骨髓显著增加模型组与对照组( )。传真照片表达在骨髓中等剂量的icaritin-treated组低于模型组( )(图5 (d))。图5 (e)显示股骨MPL免疫组织化学结果。的数量MPL-positive骨髓中巨核细胞显著增加的模型组与对照组( )。的数量MPL-positive巨核细胞明显减少的骨髓rhTPO-treated组相比,模型组( )。MPL-positive的数量在骨髓巨核细胞显著降低icaritin-treated的中间剂量组比模型组( )(图5 (f))。图5 (g)显示的结果p-Stat3骨髓免疫组织化学。的数量p-Stat3-positive骨髓中巨核细胞显著增加的模型组与对照组( )。的数量p-Stat3-positive的骨髓巨核细胞明显增加rhTPO-treated组相比,模型组( )。的数量p-Stat3-positive骨髓巨核细胞是icaritin高剂量组低于模型组( )(图5 (h))。这些结果说明icaritin显著减少骨髓巨核细胞的数量,提高骨髓巨核细胞增生,会使房产申诉专员署和MPL蛋白的表达,抑制的表达p-Stat3 JAK2 / Stat3信号通路在ITP的老鼠。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
4所示。讨论
血小板从巨核细胞分化。一个巨核细胞能产生成千上万的血小板(21]。大多数ITP患者表现出骨髓巨核细胞增生伴有异常的巨核细胞分化和成熟。脾脏是人体最大的免疫器官,产生抗血小板自身抗体和破坏血小板和商店。数量、形态和成熟的骨髓和脾脏巨核细胞是重要的指标确定疾病疗效[22]。
注射抗血小板血清被动免疫(APS)是一种常见的建模方法。连续的外源性抗血小板血清刺激免疫系统摧毁外周血血小板减少血小板计数。这种建模方法模拟人类ITP的发病机制和临床表现自身免疫,而且它是一个简单的模型,表现出良好的重复性和低成本;这个模型被广泛用于评估ITP的功效[23]。本研究使用持续慢性ITP模型小鼠使用豚鼠血清anti-mouse血小板。外周血血小板参数的诊断和治疗ITP的重要指标(22]。本研究使用一个连续注入GP-APS,导致更大的外周血中血小板的破坏。PLT和小鼠外周血PCT对对照组明显减少。这种差异具有统计学意义,但没有显著差异的血红细胞,白细胞,或血红蛋白之间的群体,这是符合人类ITP的病态外表血液,表明该模型成功地准备(22]。血小板的数量icaritin-treated组和rhTPO-treated组显著增加,这表明icaritin ITP的改善。
新生儿血小板主要是存储在脾脏和调节外周血中血小板的数量。抗血清注射导致脾脏增生在目前的研究中,和治疗显著降低血小板脾肥大的程度和保护。他staining-detected变化巨核细胞在脾脏和并行巨核细胞数和股骨24,25]。结果表明,脾和骨髓巨核细胞的模型组与对照组相比显著增加,并减少生产平板型巨核细胞的观察,这表明ITP的老鼠表现出巨核细胞增殖和成熟障碍,这是符合人类ITP的病理特征(26]。这些观察结果可能是由于外周血血小板含量减少,导致体内巨核细胞的代偿增生。然而,抗血小板抗体的存在影响巨核细胞的成熟和分化。Icaritin治疗显著降低巨核细胞相比,模型组。巨核细胞与对照组增加,这表明icaritin监管生产巨核细胞,改善骨髓和脾脏巨核细胞的增生,促进造血系统的复苏。
传真照片是一个非常重要的调节因子巨核细胞增殖、分化、成熟和血小板生产。房产申诉专员署受体激动剂,rhTPO被认为是一个积极的药物在这项研究中,为了评估rhTPO是否和icaritin在ITP的治疗中也有类似的影响。房产申诉专员署和其独特的特定功能的受体的结合MPL促进了巨核细胞的增殖和分化并维持造血干细胞和造血体内平衡。本研究的结果表明,模型组的血清TPO水平降低和传真照片内容icaritin-treated组显著增加。传真照片/ MPL的交互影响巨核细胞增殖、分化和血清TPO的表达式27]。房产申诉专员署和MPL形成一个复杂的巨核细胞内化的,和血小板的蛋白酶体降解。因此,血小板水平下降与ITP小鼠的血清TPO水平下降。本研究的建模方法破坏了外周血血小板计数,血小板计数减少、骨髓的造血功能,增加和补偿模型组巨核细胞的增生。这些结果符合文献[28- - - - - -30.]。外周血血小板数量增加的数量在所有icaritin-treated组骨髓传真照片表达减少,骨髓巨核细胞生产下降。急性髓系白血病(AML)患者高MPL表达展览缓解率低,预后不良,容易其他血液疾病,这表明MPL和传真照片与恶性造血细胞生长有关31日]。本研究的结果表明,MPL表达增加骨髓中模型组与对照组和MPL药品管理局后下降。然而,没有显著差异在脾脏MPL表达式(结果未显示),这表明icaritin调节骨髓TPO生成,促进骨髓MPL表达,抑制恶性造血细胞的生长,也没有显著影响脾脏传真照片/ MPL-related通路。
房产申诉专员署受体刺激JAK2的绑定(Janus激酶2)磷酸化,磷酸化的酪氨酸残基末端的受体,激活细胞内信号通路。Stat3(转录信号传感器和催化剂)磷酸化,形成二聚体,把原子核,调节基因转录,并调节巨核细胞和血小板的生成和细胞凋亡9]。骨髓免疫组织化学结果显示,p-Stat3蛋白的表达增加骨髓巨核细胞在建模和p-Stat3蛋白质的表达减少政府后,这表明血小板减少建模后,JAK2 / Stat3通路被激活,巨核细胞增多了。JAK2 / Stat3通路激活后减少icaritin管理。
5。结论
总之,我们的研究证实,icaritin增加PLT、PCT、和血清TPO水平,减少在骨髓中巨核细胞的异常增殖和脾脏,促进血小板巨核细胞的形成,和改进在ITP巨核细胞成熟。我们的研究证实,icaritin显著改善血小板减少,促进了巨核细胞增殖,促进血小板的恢复和巨核细胞的造血系统。传真照片,MPL和骨髓p-Stat3水平测量第一次在ITP小鼠模型。这项研究表明,icaritin ITP小鼠外周血血小板计数增加,表现出优势,如缓解的作用,低剂量、低成本、方便管理、使icaritin一种有前景的候选药物。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
这项工作是支持的科技重大项目:重大新药(没有创造。2017 zx09101003 - 009 - 006),(没有国家特种设备发展项目。2013 yq030651-06),中国国家自然科学基金(没有。U1603128)。