文摘
视黄acid-inducible基因我(rig - I)是一种重要的监管机构占据抗病毒干扰素(ifn)和促炎细胞因子。它需要衔接分子相互作用,线粒体antiviral-signaling蛋白质(小牛),激活下游信号通路。阐明的机制(s) RIG-I-dependent IAV感染的识别在活的有机体内触发先天免疫反应,我们感染突变小鼠缺乏rig - i或小牛甲型流感病毒(IAV)和测量他们的先天免疫反应。与孤立的证明,已经删除病毒的识别受体TLR3, TLR7 NOD2, rig - i或小牛淘汰赛(KO)并没有导致更高的死亡率和没有减少老鼠IAV-induced细胞因子的反应。感染rig - i KO动物类似WT小鼠肺部炎症概要文件显示,蛋白质浓度、细胞总数,炎性细胞成分在支气管肺泡灌洗液。RNA-Seq结果表明,所有类型的小鼠表现出同等抗病毒和炎症基因反应IAV感染。在一起,结果表明,虽然在先天rig - i是重要的细胞因子的反应在体外单个删除rig - i基因编码或小牛并没有改变生存或天生的反应在活的有机体内IAV后感染的老鼠。
1。介绍
感染甲型流感病毒(IAV),否定意思以单链RNA病毒,是一种发病率和死亡率的主要原因。大约有500万临床病例和250000 - 500000年全球每年死亡造成IAV流行,尤其是在超过65岁的人占所有的90%与流感相关的死亡在美国(1,2]。
先天免疫的第一道防御病毒感染,诱发干扰素(IFN)和促炎细胞因子的表达。先天免疫系统的细胞检测病毒感染主要通过模式识别受体(PRRs)呈现在细胞表面或内部不同的细胞内的隔间。PRRs有能力区分自我和异物分子。先天免疫系统响应通过三类PRRs流感。首先,视黄acid-inducible基因我(rig - I)和黑色素瘤differentiation-associated 5 (MDA5),广泛表达于各种类型的细胞,如骨髓树突状细胞(DC)、巨噬细胞、上皮细胞、成纤维细胞,检测细胞内ssRNAs和转录IAV的中间体3,4]。识别的病毒后,rig - i或MDA5下游衔接分子结合,线粒体antiviral-signaling蛋白质(小牛),激活抗病毒和促炎的信号。第二,endosomal toll样受体(通常)也参与IAV的认可。TLR3,双链RNA传感器,使用一些上皮细胞和骨髓直流检测病毒复制的中间dsRNA [5]。血浆DC使用TLR7认识流感基因组RNA在年末发布核内体(6]。最后,nucleotide-binding域和富亮氨酸repeat-containing蛋白质(NLRP),包括NLRP3和nucleotide-binding寡聚化域2 (NOD2),可以作为细胞内介质IAV启动宿主细胞信号通过生化的形成复杂的称为inflammasome髓细胞和气道上皮细胞7- - - - - -9]。
PRR引发的先天免疫反应激活控制病毒感染至关重要。PRR受体促炎细胞因子和趋化因子生产的主要调节器,激活白细胞,招募他们的感染,在理想的情况下优化免疫反应和提高恢复(10]。然而,过度的炎症造成的不受控制的先天免疫反应是有害的主机和有助于IAV-infected患者的死亡率(11]。急性细胞因子的释放导致了强烈的渗透和激活炎症细胞,负责严重的炎症加剧慢性肺部疾病。高致病性IAV菌株,包括大流行性流感污渍和禽流感,通常与细胞因子过度反应(12,13]。
rig - i对干扰素诱导至关重要在non-pDC RNA病毒感染细胞,和老鼠缺乏RIG-I-like受体信号通路是极其容易受到其他RNA病毒(14- - - - - -16]。我们之前使用rig - i转基因小鼠显示rig - i超表达小鼠预防吸烟增强这些动物流感感染的易感性17]。尽管PRRs是重要的天生的细胞因子反应在体外,删除基因编码PRRs rig - i不恶化生存期间IAV感染在活的有机体内。事实上,老鼠缺乏TLR3流感感染期间意外生存优势或许是由于显著降低炎症介质诱导的动物(18]。删除NOD2并没有改变在致命的流感病毒感染小鼠的存活率(19]。
为了确定rig - i信号是非常重要的生存和IAV-induced老鼠细胞因子的反应,我们感染突变小鼠缺乏rig - i或与IAV小牛,测量他们的先天免疫反应,包括干扰素和促炎细胞因子诱导,并确定他们的死亡率。的机制(s) RIG-I-dependent IAV感染的识别在活的有机体内触发先天免疫反应也被评估。
2。结果
2.1。rig - i不是必需的生存的致命IAV感染
rig - i−−/在C57BL / 6小鼠描述的背景是准备材料和方法,与所有其他使用鼠标菌株,是基因分型和无菌条件下饲养在动物设施俄克拉荷马大学健康科学中心。确认rig - i中断,我们从rig - i基因敲除孤立肺原子能委员会二世(KO)和野生型小鼠(WT)。孤立的细胞培养2天,感染IAV 24 h,并为rig - i染色。IAV-infected WT原子能委员会表达高水平的rig - i而感染rig - i KO原子能委员会不表达rig - i(图1(一))。我们也证实rig - i KO小鼠肺部免疫染色。老鼠感染IAV和牺牲后6天。肺被处理为免疫组织化学检测IAV核蛋白(NP)和rig - i。PBS模拟控制KO和WT老鼠肺部时最小的免疫荧光染色rig - i。正如所料,rig - i高度诱导的肺IAV-infected WT老鼠。病毒NP表达式中检测出肺WT和KO动物感染IAV(图1 (b))。结果表明,病毒复制IAV后小鼠肺部感染并发rig - i的感应。数据表明,rig - i蛋白表达缺乏rig - i KO原子能委员会二世和rig - i KO小鼠肺,即使IAV感染。
(一)
(b)
(c)
(d)
为了确定在活的有机体内rig - i在生存期间严重IAV感染,我们接种rig - i KO和同窝出生仔畜WT动物致命剂量的病毒空斑形成单位(1000)。出人意料地,我们发现rig - i KO小鼠无显著差异在生存IAV的挑战相比同样暴露WT老鼠kaplan meier生存分析( , 分别和15的人物1 (c))。减肥是重要的感染组和达到最低点在感染后7天虽然两组之间没有显著差异(图1 (d))。
2.2。肺部炎症反应期间诱导IAV感染甚至没有rig - i
探讨IAV rig - i在炎症反应中的作用,rig - i KO和WT C57BL / 6小鼠鼻内感染300微升IAV PR8。模拟组假被接种感染用单一剂量的同等体积的PBS。动物被牺牲在2、4、6天后感染,和支气管肺泡灌洗液体(BALF)收集评估细胞渗透在空域和中介内容。
拜尔是最常见的方式样上皮衬里的组件流体和确定的总蛋白量,指数从血管间渗透到肺部,并反映了肺损伤。我们发现BAL蛋白质含量没有显著差异在两个受感染的老鼠组各时间点(图2(一个))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
总炎症细胞,IAV接种不仅导致显著增加总可行的白细胞BALF中第二天也显著增加中性粒细胞的百分比BALF中感染组(所有数据2 (b)和2 (c))。然而,rig - i KO没有明显改变的成分在病毒感染炎症的细胞群。在感染后6天,rig - i KO小鼠出现更多的炎性细胞浸润到BALF比WT老鼠,但是差异没有统计学意义。因此,BALF的活细胞总数是相似的在两个鼠标组各时间点。整个肺的斑块化验显示,病毒滴度也同样在WT升高,KO小鼠感染后6天(图2 (d))。因此,对于死亡,病毒负担rig - i KO的肺没有改变。
肺组织病理学检查显示IAV-infected在两种类型的小鼠显示典型的病毒性肺炎间质水肿和炎症浸润,以及坏死性支气管炎、细支气管炎。IAV感染导致预期的中性肺泡浸润淋巴细胞。然而,我们发现在炎症的严重程度并没有大的差别在rig - i KO和WT老鼠(图2 (e))。
2.3。rig - i缺陷不会改变抗病毒干扰素和炎性细胞因子反应流感感染
为了确定小鼠生存IAV感染在缺乏主要抗病毒传感器,我们评估期间PRR和细胞因子表达菌株感染的老鼠。小鼠接种鼻内与一个单一的、不致命的剂量的IAV PR8株(300微升)。肺组织和BALF收集2,4,6天后,感染,和PRR和细胞因子表达是由存在决定或多路免疫测定,分别。所有测试PRR信使rna病毒诱导的肺从WT老鼠在2天后PR8感染(图3(一个))。具体来说,肺rig - i的表达显著调节在WT流感感染的老鼠。正如所料,没有rig - i表达rig - i KO小鼠PR8感染。值得注意的是,我们发现NOD2 mRNA表达更在rig - i KO小鼠肺与WT老鼠相比,特别是在感染后6天。PR8诱导NOD2 mRNA rig - i KO小鼠(15倍)显著大于WT老鼠(2倍,图3(一个))。这表明补偿NOD2过度缺乏rig - i。确认这个在体外,我们孤立成纤维细胞从rig - i KO和WT老鼠的耳朵。NOD2 IAV信使rna诱导的细胞KO小鼠比在WT老鼠的细胞(图3 (b))。
(一)
(b)
我们还测量了干扰素和细胞因子mRNA感应IAV在这些动物。干扰素-β和λ2/3应对流感感染类似rig - i KO和WT老鼠。与炎性细胞在BALF一致,mRNA的表达促炎细胞因子il - 6、TNFα,IP-10高度和同样诱导基因型在IAV感染(图4)。所需的数据表明,rig - i不是天生的抗病毒、促炎细胞因子反应IAV的老鼠。最后,为了证实细胞因子诱导反映层面的翻译,我们测量BALF中细胞因子的蛋白质,从小鼠暴露于血液中细胞因子含量IAV使用多路复用免疫测定(图在这两种基因型5)。蛋白质水平的il - 6、MCP-1 TNFα、IP-10和干扰素-γ血清中显示出类似的模式BALF中所见。
(一)
(b)
2.4。小牛是可有可无的生存IAV感染在活的有机体内
为了进一步检查rig - i的作用途径激活响应IAV感染,我们下一个调查是否消耗的小牛,rig - i适配器,影响生存率在IAV感染。我们接种小牛KO,同窝出生仔畜WT动物致命剂量的病毒空斑形成单位(1000)。为我们发现rig - i KO,小牛KO没有显著影响生存IAV的挑战后,大约18%和23%的生存在小牛KO和WT老鼠(16天 分别和19个数字6(一))。减肥是重要的感染组和达到最低点在感染后7天(图6 (b))。体重数据同意的生存数据之间没有显著差异在减肥IAV-infected小牛KO小鼠和WT(大约31%和28%的损失为小牛KO和他们同窝出生仔畜WT在第七天)。
(一)
(b)
(c)
我们也比较PRR和细胞因子表达在IAV菌株感染的老鼠。小鼠接种鼻内与一个单一的、不致命的剂量的IAV PR8株(300微升)。肺组织收集在感染后6天,PRR和细胞因子表达是由存在决定的。同样,所有测试PRR信使rna病毒诱导的肺从WT PR8后小鼠感染(图6 (c))。肺表达rig - i和MDA5适度调节后在小牛KO小鼠流感感染与WT老鼠相比,表明有试图补偿小牛KO rig - i和MDA5的过度。也有显著增加补偿TLR3表达小牛KO小鼠。令人惊讶的是,我们发现TLR7 mRNA表达显著低于小牛KO小鼠与WT老鼠。评估下游PRR信号的影响,我们测量干扰素-β和细胞因子il - 6信使rna诱导IAV在这些动物。il - 6应对流感感染类似rig - i KO和WT老鼠,但干扰素-β信使rna表达显著降低在小牛KO小鼠相比,在WT老鼠。数据显示,干扰素-β表达式是影响肺的第六天,而促炎细胞因子的反应都是一样的在两种类型的老鼠IAV感染。
2.5。干扰素和炎症反应基因诱导期间IAV感染甚至没有rig - i和小牛
为了更好地理解rig - i的调制信号对全球的影响基因表达,我们使用高通量RNA序列(RNA-Seq)技术,一个强大的方式概要文件转录组的效率和更高的精度。RNA-Seq进行mRNA来源于WT, rig - i KO,小牛在6天postinfection KO小鼠的肺。使用43304带注释的基因在小鼠基因组数据库中,基因表达是量化和模拟和病毒感染组之间比较,差异表达基因(度)被确定使用错误发现率0.1(罗斯福)。
所有三种类型的小鼠在感染(图共享度总数的32.6%7(一))。度独特的改变在每一株只占17.7% (WT), 10.2% (rig - i KO), 8.9%(小牛KO)。检查生物角色,一个基因本体论(去)富集分析应用于度(图S1)。值得注意的是,度是主要富集在先天免疫反应的规定,如防御反应,抗病毒反应和炎症反应。12的生物过程之间互相重叠WT rig - i和小牛在IAV KO小鼠感染。
(一)
(b)
(c)
两个关键的先天免疫反应发生在IAV感染和影响生存是干扰素反应和炎症反应。因此,我们关注在这些类别的罗斯福0.1度,调节了IAV KO小鼠暴露在WT组。日志2相应的基因集的平均计数每百万为每组和集群热图使用欧氏距离和病房集群指标。黄色/蓝色梯度显示高/低基因表达,分别。在第一组(图7 (b))是基因干扰素反应相关基因,包括Irf1 Ifi44, Irf7, Oas1g。第二个基因(图7 (c))包括基因与炎症反应有关,如Ccl5、白细胞介素6、Il1b和肿瘤坏死因子。基因表达数据显示,干扰素引起的反应和炎症基因IAV没有rig - i和小牛。作为显示在图6,RNA-Seq还显示,IAV感染诱导IFNb1三倍在小牛KO小鼠模拟。IAV的感应是远远低于在WT老鼠。相比之下,小牛KO并不影响诱导下游IFN-stimulated基因(isg、Ifi44 Ifi204, Ifi47, Ifit2, Ifi205,等等)IAV。作为下游基因同样激活在KO小鼠尽管微分干扰素-β感应很可能其他干扰素或细胞因子可能弥补干扰素-β在小鼠肺20.]。
3所示。讨论
RIG-I-MAVS-dependent通路的重要作用认识IAV感染和控制发病机制已经建立,意味着一个重要的角色在IAV免疫力[rig - i3,4,21]。进一步调查rig - i的影响在活的有机体内,这将是理想的检查IAV肺炎RIG-I-deficient老鼠。两组先前报道,RIG-I-deficient C57BL / 6小鼠在胚胎发生发育缺陷和有高死亡率(3]或出生后3周内由于广泛的肝细胞凋亡(22]。一个成功的方法来生成可行的rig - i−−/老鼠已经生成的复杂背景涉及129 sv和ICR小鼠C57BL / 6,并多次回交小鼠C57BL / 6。我们得到初代的创始人这些老鼠(一种礼物从迈克尔·盖尔博士,华盛顿大学),backcrossed成C57BL / 6背景F4代。包含MDA5相似的老鼠−−/除了rig - i−−/在此背景下由他的团队以这种方式(23]。rig - i−−/鼠标线在我们实验室开发的描述有一个大约94% C57BL / 6遗传背景,由微卫星DNA分析(见材料与方法)。
在这里,我们的工作表明,rig - i−−/小鼠体重下降程度相似的生存和WT老鼠相比IAV后感染。感染rig - i−−/动物表现出类似的模式WT小鼠肺部炎症。RNA-Seq结果表明rig - i KO,小牛KO和WT的老鼠表现出类似的抗病毒和炎症基因的诱导后鼻内与IAV的挑战。数据显示,rig - i在IAV的识别和抑制的作用可以被其它的替代PRRs的老鼠。调查其他团体展示类似的炎症反应在没有其他PRRs IAV提供额外的证据存在的补偿或补充在活的有机体内PRR感应机制。例如,TLR7缺不改变生存和病毒清除后IAV感染但体重下降程度加剧24]。同时,肺mRNA表达干扰素和趋化因子的老鼠感染IAV不是受孤立的MyD88基因敲除或小牛途径。这表明MyD88或小牛首次IAV抗病毒反应信号通路是充分的在活的有机体内(25]。我们组也报道,rig - i和TLR3 siRNA独自完全阻止干扰素诱导人类肺上皮细胞。只有双击倒的rig - i和TLR3完全抑制干扰素诱导的流感。这表明信号补偿TLR3 rig - i,反之亦然,保留干扰素诱导的IAV发生在人类肺癌(26]。我们的结果结合其他报告强烈表明,先天免疫反应IAV不受单个受体或胞内信号通路。事实上,反应似乎是一个有序的过程,涉及多个互补PRRs和信号通路不同身体的细胞和组织。
值得注意的是,我们发现NOD2或TLR3 mRNA表达大大增加在IAV-infected rig - i或小牛KO小鼠,分别。因此,激活后NOD2 IAV感染的老鼠可以弥补缺乏功能性rig - i。Morosky等人表明,rig - i和NOD2不仅与细胞褶边,和连接,还直接交互(27]。此外,rig - i负调节ligand-induced NF -κB信号由NOD2, NOD2负调节I型干扰素诱导rig - I。在细胞水平上,似乎rig - i表达消极调节NOD2信号和表达,和反之亦然。在缺乏抑制NOD2信号rig - i rig - i−−/老鼠,放纵的NOD2可能优化先天免疫反应的病毒感染和改善生存。最近,RNAi筛查牵连其他RIG-I-like受体,MDA5,作为一个重要的贡献者细胞防御IAV [28]。
我们当前的模型是,rig - i作为主要PRR IAV-mediated细胞因子诱导主IAV感染网站,肺上皮细胞和巨噬细胞,TLR3, NOD2, MDA5, TLR7上皮细胞和其他免疫细胞作为重要的备用PRRs IAV先天反应生成一个。我们的研究结果表明,宿主PRR IAV的认可在活的有机体内和先天免疫起始更复杂的比目前欣赏的两个或三个途径弥补在移植抗病毒反应。可能有广泛的合作和/或竞争相互作用不同PRRs支持和规范抗病毒传感以及感应的先天免疫反应。我们之前的出版物表明rig - i超表达在香烟smoke-exposed老鼠的肺改善生存IAV感染(17]。这表明,尽管单独PRR不足可能是可有可无的IAV先天反应,过度的一个主要PRR足以恢复先天反应IAV感染免疫抑制组。
在一起,我们的结果表明,rig - i是可有可无的IAV的天生的细胞因子反应。这些结果与我们之前的报告显示,过度肺rig - i的改善生存在smoke-exposed病毒感染小鼠,提供新的见解的机制如何在流感感染宿主的免疫系统保持体内平衡。需要更多的研究来阐明控制病毒感染的潜在机制和virus-mediated过度炎症的先天免疫反应。
4所示。材料和方法
4.1。道德声明
制度动物保健和使用委员会(IACUC)的俄克拉荷马大学健康科学中心批准所有的动物实验的协议(协议数量:17 - 106 -嗨)。这项研究的设施进行由AAALAC认证。设备操作根据指南的护理和使用实验动物和动物福利法案和法规的要求和公共卫生服务政策人道关怀和使用实验动物。所有程序都是由技术根据IACUC指南的培训人员。所有的入侵进行而动物麻醉的临床过程。
4.2。制备流感病毒股票和斑块化验
甲型H1N1流感病毒,/公关/ 34/8 (PR8),通过在Madin-Darby犬肾(MDCK,写明ATCC # CCL-34™,马纳萨斯,弗吉尼亚州)细胞。病毒是生长在MDCK细胞在DMEM / F12的+ (BD生物科学,富兰克林湖,新泽西)胰蛋白酶,在72小时postinfection收获,空斑实验效价的MDCK细胞。没有可检测内毒素在最后病毒制剂用于实验由鲎变形细胞溶解产物测定(Cambrex Walkersville, MD)。降低检测极限的测定是0.1欧盟/毫升或大约20 pg / ml有限合伙人。感染的病毒滴度测定小鼠,整个收集鼠肺和均质1毫升的冰冷的PBS。固体垃圾被离心分离颗粒状,和病毒效价决定使用一个标准的空斑实验对MDCK细胞。
4.3。动物
特定的无菌小牛KO小鼠C57BL / 6和129 svev混合遗传背景从杰克逊实验室购买(巴尔港,我)。rig - i−−/老鼠所产生的混合美国彰博士的小组拥有129 sv××C57BL / 6基因背景。rig - i−−/老鼠backcrossed成C57BL / 6背景通过F4代和没有发育缺陷。F4 C57BL / 6小鼠90 - 94%背景由JAX利用基因组扫描(表1)。
所有老鼠基因分型和无菌条件下饲养在动物设施俄克拉荷马大学健康科学中心。老鼠被安置在20°C在无菌12小时光/暗周期microisolator笼子和美联储随意用无菌食物和水。
4.4。流感病毒感染
IAV感染异氟烷麻醉下进行。IAV PR8股票在PBS稀释致命和亚致死剂量的病毒。这些病毒剂量(50μL的解决方案)是由鼻内滴注法的动物在垂直位置时镇静。控制动物收到PBS。老鼠每天监测为16天临床症状(振动、疲劳、立毛),并每天记录自己的体重。
4.5。支气管肺泡灌洗(BAL)
老鼠牺牲使用异氟烷。落下帷幕了使用一个封闭的胸腔技术暴露出气管,轻伤的喉,插入一个方头22码近端气管插管。的近端端气管和,和0.6毫升无菌PBS温柔地引入到肺部和恢复。这个重复了3次1.8毫升的总量。返回体积不同样本之间的< 10%。BALF细胞离心去除。细胞获得被放置在幻灯片测定细胞群使用Cytopro Cytocentrifuge (Wescor,洛根,UT)和沾Diff-Quik(戴德·贝林·纽瓦克·德·)。微分项是用≥400个细胞/鼠标/样本2幻灯片。BALF汇集和冷冻。
4.6。多路复用免疫测定
BALF中细胞因子的蛋白质含量和血清测定多元免疫测定(Affymetrix,圣克拉拉,CA)。化验是运行在一个Bio-Plex 200多路复用系统(Bio-Rad大力神,CA)。
4.7。测量mRNA表达的定量实时PCR(存在)
从肺总RNA提取使用修改后的试剂盒(表达载体,卡尔斯巴德,CA)协议和spectrophometrically量化。RNA的完整性被甲醛琼脂糖凝胶电泳验证。等量(1μg)的RNA从每个样本被reverse-transcripted进cDNA益生元(dT)上标2合成第一链系统rt - pcr(表达载体,卡尔斯巴德,CA)。鼠标PRRs Gene-specific引物,细胞因子,β肌动蛋白看家基因。引物的序列一样在我们早些时候发表(17]。执行中存在使用100 ng样本RNA和SYBR绿色(量子生物科学,马里兰州)Bio-Rad CFX96™触摸实时PCR检测系统。结果计算和画∆CT的目标基因和标准化者,β肌动蛋白。
4.8。隔离主要从小鼠耳成纤维细胞
使用异氟烷小鼠安乐死。左和右耳廓被移除和切碎的使用无菌剪刀在媒体增长(DMEM, 10%的边后卫,1 x不必要的氨基酸(Gibco,猫。# 11140 - 050],1 x从Gibco Pen-Strep)提供胶原酶(4毫克/毫升;沃辛顿,莱克伍德,NJ)和蛋白酶(Dispase II, 4毫克/毫升;罗氏公司)来增强细胞提取。由此产生的悬浮培养过夜在37°C孵化器。单细胞悬浮的制备是通过细胞通过过滤器去除剩余的碎片的两倍。细胞颗粒状在1020×g离心5分钟。细胞池耳廓和resuspended 5毫升的增长媒体和带25毫升的媒体。细胞被镀上一轮150毫米板和允许坚持在37°C孵化器。 Following the overnight incubation, media were replaced and cells were grown to confluence prior to infection with IAV.
4.9。组织学和免疫组织化学分析小鼠肺组织和肺泡上皮细胞(AEC) II
天6 IAV感染后,老鼠是牺牲和肺是固定在4%多聚甲醛在室温下PBS 30分钟,然后被嵌入在石蜡。固定组织苏木精和伊红())染色评估炎症和纤维化。部分(3 - 5μ米)被安装在玻片和immunoprobed兔子anti-mouse多克隆抗体为rig - i (Abcam)或一个anti-NP多克隆抗体(29日]。原子能委员会二世被纯化和镀collagen-coated玻片和培养30.]。1天之后,这些细胞被感染IAV PR8的莫伊1和孵化为一个额外的刺激rig - i的24小时生产。探讨了细胞与一只兔子anti-mouse多克隆抗体为rig - i(圣克鲁斯生物技术)。核与DAPI染色(蓝色)。洗后,部分探索了一头驴anti-rabbit二级抗体共轭Alexa萤石546 (BD /分子探针)。透射光和荧光显微镜图像获得使用一个奥林巴斯显微镜BX51运行cellSens成像软件(奥林巴斯,中心山谷,PA)。
4.10。RNA-Seq分析
小鼠肺总RNA收集如前所述。图书馆准备并使用3进行了测序临床基因组学中心inTAG下一代测序的俄克拉荷马州医学研究基金会的核心设施(俄克拉荷马城,好吧)。天6 post-IAV感染基因差异表达决心相对于模拟接种小鼠。
测序读都是品质管理使用FastQC v0.11.2。Illumina公司适配器使用Cutadapt修剪v1.9.dev2;复制合并,符合他们的参考基因组(UCSC的老鼠基因组构建mm10)使用Subread-align v1.4.6-p4。BAM文件从对齐加工使用均featureCounts v1.4.6-p4获取计数每个基因在所有样本。Mus_musculus.GRCm38.83。gtf基因定义文件使用。使用辊v3.18.1微分表达式进行了分析。基因在所有样本计数每百万小于2被排除在外。差异表达基因定义使用值< 0.01和FDR-corrected值< 0.1。所有的生物信息学分析进行了R / v3.4.0 Bioconductor计算环境。
4.11。统计分析
适用,对于数据有关RNA-Seq除此之外,数据被表示为 平均误差(SEM)。统计学意义是由单向方差分析与Student-Newman-Keuls事后修正多重比较。意义被视为 。rt - pcr结果的从不同的实验值从ΔΔCt值计算组。
数据可用性
所有RNA-Seq文件可从地理数据库(加入GSE114232),https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE114232。
信息披露
这个刊物的内容是完全的责任作者,不一定代表官方的观点NCRR或国家卫生研究院。
的利益冲突
作者没有利益冲突。
确认
这项工作部分中描述的研究支持临床从空姐医学研究所创新者奖,绩效审查程序的退伍军人事务部的统计,美国国立卫生研究院(1 I01 BX001937),和美国国立卫生研究院(U19AI62629和GM103648 J.P.M. R21AI121591, R01HL116876,和GM103648 l)。OUHSC啮齿动物屏障设施支持部分(批准号C06RR017598)由国家研究资源中心(NCRR)的一个组成部分,美国国立卫生研究院(NIH)。我们要感谢博士Shizuo彰生成初始rig - i−−/老鼠。我们还要感谢迈克尔•盖尔博士Jr .)为我们提供早期复杂背景rig - i−−/C57BL / 6 backcrossed创始人。我们承认俄克拉荷马州医学研究基金会的援助成像分析和临床基因组学中心核心设施。
补充材料
图S1:基因本体论(去)浓缩RNA-Seq分析。只有12浓缩的条款从顶部列出了“生物过程”的类别。基因集富集分析差异表达基因进行排名值使用clusterProfiler v.3.4.4。106进行了排列,估计permutation-based浓缩价值。(补充材料)