文摘
肠上皮屏障损伤破坏免疫内稳态和导致许多肠道疾病。这种乳酸菌株益生菌功能的调制在肠道微生物群和免疫系统。在这项研究中,所带来的影响这种l .LR1,新型隔离断奶仔猪的粪便在肠道上皮屏障损伤IPEC-1与产肠毒素的细胞造成的挑战大肠杆菌(ETEC) K88检查。结果发现,这种l .LR1,在很大程度上抵消了ETEC K88-induced IPEC-1细胞单层膜的渗透性增加和减少IPEC-1的大肠杆菌细胞的粘附和入侵。此外,这种l .LR1转录丰度和蛋白质含量的增加紧密连接(TJ)蛋白质zonula occluden-1 (ZO-1)和occludin ETEC K88-infected IPEC-1细胞,而没有对claudin-1和f -肌动蛋白表达的影响。用胶体金immunoelectron显微镜,这些影响这种l .LR1 ZO-1和occludin内容IPEC-1细胞被证实。通过使用ML-7,肌球蛋白轻链的选择性抑制剂激酶(MLCK)的有益作用这种l .LR1 ZO-1内容和occludin证明是依赖于MLCK通路。总之,这种l .LR1有有利影响上皮屏障功能符合增加ZO-1和occludin表达通过MLCK-dependent方式IPEC-1细胞在挑战ETEC K88。
1。介绍
肠道上皮屏障中扮演着重要的角色在宿主防御病原体感染(1]。受损上皮屏障破坏免疫内稳态和加剧炎症在许多疾病,如腹泻断奶应激、肠道病原体感染,炎症性肠病(IBD),肠易激综合征、肥胖、代谢综合征和肝脏疾病(2- - - - - -6]。相邻的上皮细胞之间的紧密连接(TJ)创建一个透屏障,防止细菌和其他有害物质穿过上皮(7]。中断TJ蛋白上皮屏障的通透性增加,导致肠道炎症8),导致许多肠道疾病。尽管抗生素已经被广泛用于治疗肠道疾病在过去的几十年,最近的研究表明,抗生素暴露扰乱了正常的肠道菌群组成和TJ蛋白的表达从而损害肠上皮屏障功能(9- - - - - -11]。这强调了需要确定治疗肠道疾病的安全有效的代理与上皮屏障损伤有关。
这种乳酸菌(这种l .)菌株是重要的共生微生物群的成员,在人类和其他动物的肠道和已经证明调节肠道免疫系统的发展(12- - - - - -14]。这种l .可以产生reuterin,展品广谱抗菌活性对肠道病原体(15- - - - - -17]。此外,人类这种l .减少肠道炎症通过抑制toll样受体4 - (TLR4)核因子κB (NF-κB)信号通路(18,19]。它还改善肠上皮屏障功能通过促进细胞迁移(20.]。先前的研究已经表明,一些益生菌增加肠道紧密连接蛋白的表达通过p38 MAPK /或肌球蛋白轻链激酶(MLCK)信号通路21]。后者调节肌球蛋白轻链磷酸化(多层陶瓷),然后调节细胞间渗透率和肠道上皮细胞的凋亡22,23]。压力这种l .LR1隔绝健康断奶仔猪的粪便在我们之前的研究中,和它的16 s rRNA序列被存入数据库基因库(加入KT205306) (24]这种l .LR1显示有益对肠上皮屏障功能的影响(24]。的影响和潜在机制这种l .LR1在肠上皮屏障功能与产肠毒素的挑战大肠杆菌(ETEC),然而,不完整的。
本研究的目的是调查的影响和潜在的机制这种l .在ETEC LR1 K88-induced上皮屏障功能的损害在体外使用肠道猪上皮细胞模型。
2。材料和方法
2.1。细菌培养
这种l .LR1分离粪便的健康断奶仔猪(杜洛克猪×长白猪×大白色),所述[24]。这种l .LR1生长在37°C 18 h在汤夫人。ETEC K88得到中国兽药研究所的控制和生长在溶原性肉汤在37°C 16 h。细菌细胞的ETEC K88和这种l .LR1暂停在杜尔贝科所需浓度的改性鹰的介质(DMEM,表达载体,卡尔斯巴德,CA)。
2.2。细胞培养
肠道猪上皮细胞(IPEC-1)博士的礼物Guoyao吴(德州农工大学)。细胞在DMEM培养补充10%灭活胎牛血清(Gibco)和抗生素(青霉素100 U /毫升和100年μg / ml硫酸链霉素)在37°C下5%的股份有限公司2在湿润孵化器。
IPEC-1细胞培养在Transwell菜(康宁生命科学、康宁、纽约)21 d之前(24]。层的IPEC-1细胞在DMEM培养6小时无血清或抗生素,在ETEC K88 (1×107CFU),这种l .LR1 (1×108CFU),或两者兼而有之,在参议院。IPEC-1细胞单层膜的渗透性是衡量FITC-dextran (4400 Da, Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州)(24]。IPEC-1细胞收集的枚举ETEC K88、实时PCR (qPCR)和免疫印迹分析。每治疗使用6井,结果是代表三个独立的实验。
2.3。抑制剂治疗ML-7
IPEC-1细胞被播种在6-well板块(5×105每)和细胞培养24小时。这些细胞被使用50μM ML-7 (MLCK的选择性抑制剂)或车辆(0.1% DMSO) 6 h,然后处理这种l .LR1 (1×108CFU 6 h)之前接触ETEC K88 (1×107CFU 1 h),然后收集IPEC-1细胞进行免疫印迹分析。6井/治疗。
2.4。胶体金Immunoelectron显微镜
孵化后6 h和媒介,ETEC K88、或ETEC K88优先这种l .LR1,如上所述,在参议院的Transwell盘子,IPEC-1细胞单层膜与2.5%戊二醛固定30分钟然后在一系列分级脱水乙醇(30%、50%和70%)。这些细胞被转移到环氧树脂Epon812过夜,然后加热72 h (35°C,每一步45°C,和60°C 24 h)。标本切片与LKB-V超微切片机(LKB Bromma)并把镍屏幕上。的部分是0.5 mol / l NH对待4Cl 15分钟,然后孵化3%过氧化氢在黑暗中为3分钟。使用5% BSA阻塞了30分钟后,部分被孵化的主要抗体(1:20稀释)对zonula occluden-1 (ZO-1)或occludin(细胞信号技术,丹弗斯,MA)过夜。部分被孵化的胶体gold-labeled二级抗体(1:50稀释)1 h。被染色的部分与醋酸双氧铀及柠檬酸碱性领先15分钟,用透射电子显微镜(模型h - 7650、日立、日本)。
2.5。实时聚合酶链反应
总RNA提取使用TRIpure试剂(Aidlab,北京)。RNA数量和质量是决定使用NanoDrop 1000分光光度计(热费希尔科学、沃尔瑟姆,MA)。使用1生成的互补μg RNA PrimeScript RT试剂盒(豆类,大连,中国)。实时PCR进行了一式三份使用它连接检测系统(Bio-Rad大力神,CA)。表列出了用于实时PCR引物1。每个反应包括10μl iTaq普遍SYBR绿色Supermix (Bio-Rad), 0.8μl每个正向和反向引物(10μM), 2μl 10倍稀释cDNA, 6.4μl ddH2o . thermocycler协议由10分钟在95°C的30年代和40个周期95°C, 30 s 60°C, 20年代在72°C。GAPDH和β肌动蛋白是用作看家基因。使用2相对转录丰度进行了计算-ΔΔCt方法,ΔCt的平均值(GAPDH)和ΔCt (β肌动蛋白)是用于这项研究。治疗方法进一步规范化中获得的值控制治疗。
2.6。西方墨点法
从IPEC-1细胞总蛋白提取使用裂解缓冲(南京凯基生物,中国),离心澄清。蛋白质在上层清液分离10% sds - page Bio-Rad系统和转移到聚偏二氟乙烯膜(Bio-Rad)。与5% BSA阻塞后30分钟,一夜之间,膜被孵化在4°C适当的主要抗体β肌动蛋白(圣克鲁斯,CA)、MLCK磷酸化MLCK, ZO-1, occludin,和f -肌动蛋白(细胞信号技术),其次是孵化与辣根过氧化物酶(合)共轭二次抗体1 h。乐队被发现使用清晰西方ECL衬底(Bio-Rad)。带强度量化使用ImageJ软件。
2.7。统计分析
治疗效果是由单向方差分析评估使用SPSS 16.0软件(SPSS Inc .,芝加哥,IL)。差异被认为是重要的 。
3所示。结果
3.1。这种l .LR1减毒ETEC K88-Induced IPEC-1细胞上皮屏障的损害
IPEC-1细胞单层膜的渗透性使用FITC-dextran决心。细胞内运输FITC-dextran挑战与ETEC K88相比显著增加了控制(图1(一))。预处理与这种l .LR1有效降低运输ETEC的FITC-dextran K88-infected IPEC-1细胞单层但没有单独使用时的效果。此外,这种l .LR1下降的粘附和入侵ETEC K88细菌在上皮细胞(图1 (b))。这些结果表明,这种l .LR1减毒的ETEC K88-induced IPEC-1细胞单层膜的渗透性的增加。
(一)
(b)
3.2。这种l .LR1 TJ蛋白基因表达增加ETEC K88-Infected IPEC-1细胞
挑战ETEC K88显著降低相对丰富的ZO-1和occludin IPEC-1细胞(数据记录2(一个)和2 (b))。预处理与这种l .LR1又有效地抵消这种应对ETEC K88导致大幅减少减少ZO-1和occludin的表达式。无论是ETEC K88也不这种l .LR1 claudin成绩单IPEC-1细胞(图的影响2 (c)),而ETEC K88,但不是这种l .LR1,减少f -肌动蛋白的表达在IPEC-1细胞(图2 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
西方墨点法用于验证的影响这种l .期间LR1 ETEC K88挑战导致蛋白质含量的变化(图3(一个))。与qPCR结果一致,这种l .LR1没有影响ETEC K88-induced减少f -肌动蛋白的蛋白质,但它明显增加ZO-1 occludin蛋白质含量在ETEC K88-infected IPEC-1细胞(图3 (b))。这些影响的这种l .LR1 ZO-1和occludin蛋白质ETEC-infected IPEC-1细胞进一步证实了immunoultrastructural成像(图3 (c))。考虑在一起,预处理这种l .LR1抵消基因表达和改进的状态TJ蛋白ZO-1和occludin IPEC-1细胞,否则受到ETEC K88。
(一)
(b)
(c)
3.3。LR1改善MLCK-Dependent TJ蛋白的表达方式
的影响这种l .LR1影响TJ蛋白质编码的基因的表达和蛋白质水平的检查MLCK和磷酸化MLCK ETEC K88-infected IPEC-1细胞。挑战ETEC K88减少细胞MLCK和蛋白质磷酸化MLCK(图的内容4(一))。虽然这种l .LR1单独治疗没有效果的磷酸化MLCK在ETEC K88-infected IPEC-1细胞,它减少的程度减少MLCK蛋白质由ETEC K88。MLCK的内容在IPEC-1细胞蛋白质被选择性抑制剂ML-7镇压。然后证明了增加引起ZO-1和occludin的内容这种l .在ETEC LR1 K88-infected IPEC-1 ML-7细胞被抑制。这些数据表明,这种l .LR1可能增加了通过MLCK-dependent TJ蛋白的表达途径。
(一)
(b)
(c)
4所示。讨论
通常感染产肠毒素的ETEC K88受损肠上皮屏障的完整性(25,26]。尽管有益的益生菌在肠道上皮屏障的调控机制尚不清楚,它建立了一些益生菌改善屏障功能,从而维持肠道内稳态(27- - - - - -30.]。这种l .LR1,新菌株分离出健康的断奶仔猪的粪便,展品益生菌和功能性质在猪肠道上皮细胞(24]。因此假设这种l .LR1可能在IPEC-1防止上皮屏障功能受损细胞,通常造成挑战ETEC K88。
目前的研究清楚地表明这种l .LR1大大减少ETEC K88-induced IPEC-1细胞单层膜的渗透性增加和减少由大肠杆菌粘附和/或殖民。此外,这种l .LR1抵消的程度降低的转录和蛋白质TJ的组件ZO-1 occludin ETEC K88挑战IPEC-1细胞。从力学上看,很明显的保护作用这种l .LR1 ZO-1和occludin是依赖于MLCK信号通路。
TJ蛋白是最重要的组件的肠上皮屏障,维持肠道内稳态中起着关键作用通过限制入侵微生物和毒素1,22,31日]。最重要的TJ蛋白在肠道粘膜ZO-1, occludin, claudins [7),和所有的表达3肠中减少了感染ETEC K88 [24,30.]。目前的研究表明,ZO-1和occludin IPEC-1单层膜,减少从ETEC K88感染部分阻止了这种l .LR1。这个发现是一致的这种l .I5007 ZO-1 occludin的增加表达类似的肠道猪上皮细胞(IPEC-J2) [14]。另一种益生菌,l .杆菌,改善中断ZO-1 occludin IPEC-J2细胞造成ETEC K88挑战[30.]。此外,l .嗜酸的和乳酸链球菌减毒减少ZO-1表达enteroinvasive引起的肠上皮细胞大肠杆菌(32]。同样的,这种l .I5007 claudin-1表达增加LPS-induced IPEC-J2细胞(14]。相比之下,在目前的研究中,这种l .LR1没有影响claudin-1表达ETEC K88-infected IPEC-1细胞;claudin-1的差异可能是由于不同的菌株这种l .使用。尽管如此,目前的研究表明这种l .LR1 TJ蛋白表达改善IPEC-1单层感染ETEC K88、一致这种l .LR1改善肠上皮屏障的完整性。
TJ蛋白的调节机制是复杂的。肌球蛋白轻链磷酸化(多层陶瓷)会导致细胞间渗透率增加,和MLCK在多层陶瓷磷酸化的规定中扮演关键的角色。先前的研究表明,MLCK可以抑制肠道上皮细胞的凋亡22,33]。在目前的研究中,ETEC K88 IPEC-1细胞感染MLCK和磷酸化MLCK的蛋白质含量下降。暴露在这种l .LR1 MLCK的水平增加,但不是那些磷酸化MLCK在ETEC-infected IPEC-1细胞。已知MLCK规范TJ屏障功能(34]。的萘磺酰胺ML-7 MLCK的有力选择性抑制剂。先前的研究表明血管内皮ML-7可以调节TJ蛋白ZO-1和occludin的表达通过多层陶瓷磷酸化和MLCK [35]。在目前的研究中,ML-7阻塞的有益作用这种l .LR1在IPEC-1抑制TJ蛋白细胞造成ETEC K88、暗示这种l .LR1通过MLCK信号通路可能采取行动。
中断TJ蛋白在肠道常见障碍,如断奶腹泻、反流性食管炎,肠易激综合症,炎症性肠病(36]。例如,TJ蛋白ZO-1和occludin减少肠易激综合症(37,38]。最近的研究显示,TJ蛋白的变化可能是潜在的生物标志物和治疗的目标,这些肠道条件(14,19,39]。抗生素,另一方面,没有什么有益的影响中断TJ蛋白在肠道疾病。给定的有效性这种l .LR1 TJ蛋白证明,它可能提供一个安全、有效的治疗策略对于许多肠道疾病的损害引起的上皮屏障。
总之,这种l .LR1 MLCK-dependent方式,抵消了TJ蛋白含量下降ZO-1和occludin IPEC-1细胞,否则造成的有害影响ETEC K88感染、暗示这种l .LR1可能提供承诺治疗肠道疾病与上皮屏障功能受损。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
信息披露
这个手稿的抽象,提出了作为2017年ASAS-CSAS年会的会议论文和贸易展在巴尔的摩,马里兰州(https://www.asas.org/docs/default-source/annual/2017/abstractsannual2017_web.pdf?sfvrsn=d81a46d1_2)。
的利益冲突
作者声明没有竞争的经济利益。
确认
这项研究是由中国国家自然科学基金(格兰特no.38201815)、广州(201607020035)科技计划项目,专项资金的公共利益(没有研究热点之一。201403047),中国农业研究系统(CARS-35)的特殊基础广东农业科学院主席(201710),和广东省科技计划项目(2016 a020210041和2018 a030310191)。