TLR9/KLF4在脂肪酸诱导脂肪细胞炎症中的作用及机制

抽象的

客观的．目前研究报道，肥胖是一种慢性炎症状态，与游离脂肪酸的过度积累密切相关，而高水平的游离脂肪酸引起炎症的具体机制尚不清楚。因此，我们的研究旨在观察FFA对TLR9/KLF4表达及下游炎症因子的影响，探讨TLR9/KLF4抑制炎症反应的机制。方法．采用qRT-PCR和Western blot检测TLR9、KLF4及关键炎症相关因子的mRNA和蛋白表达水平。采用ELISA法检测炎症因子释放水平。采用甘油三酯(TG)和葡萄糖(GLU)检测盒检测培养基中TG和GLU水平。结果．在肥胖个体(OB)大网膜组织中，我们发现TLR9、KLF4、mRNA和蛋白表达水平均低于正常体重对照组(NC)。同样，在高脂饮食(HFD)大鼠的大网膜组织中，我们发现TLR9和KLF4的mRNA表达水平低于正常饮食对照组。在成熟脂肪细胞中，我们发现KLF4具有重要的抗炎作用;PA通过抑制KLF4的表达促进炎症的发生;TLR9对KLF4表达有正调控作用，但与PA无关。结论．TLR9 / KLF4参与调节FFA诱导的脂肪细胞炎症。

1.介绍

肥胖是指脂肪的过度积累或分布异常，通常与体重增加有关，已成为世界性的健康问题，可导致心血管疾病、高血压、糖尿病等代谢性疾病[1，2］．目前研究报道，肥胖是一种慢性炎症状态，与脂肪细胞脂解导致游离脂肪酸(FFA)过量积累密切相关[1，3.］．FFA的过度积累会引起炎症信号通路的激活，最终导致细胞功能障碍[4］．到目前为止，高水平FFA引起炎症的具体机制尚不清楚。

Kruppel-like factors (KLFs)，作为一个转录因子家族，由17个锌指结构成员组成，广泛参与细胞增殖、分化和胚胎发育调控[5］．KLF4最初与胃肠道分离，是脂肪细胞分化的转录调控因子之一[6］．近年来，KLF4参与了多种慢性炎症反应的调控作用。在血管内皮细胞中，KLF4与核转录因子活性亚基P65结合κB（NF-κB)，抑制P65与血管细胞粘附分子1 (VCAM1)的结合发挥抗炎作用[7］．最近有报道称KLF4过表达增加了M2巨噬细胞(抗炎)标志物蛋白表达，而降低了M1巨噬细胞(炎症)标志物蛋白表达。此外，klf4缺失的巨噬细胞表现出较低的脂肪酸氧化能力[8］．在J774a细胞中，KLF4过表达降低MCP-1的表达[8］．在脂肪细胞中，KLF4是否在FFA诱导的炎症反应中发挥重要作用尚未见报道。

toll样受体(Toll-like receptor, TLRs)在先天性免疫应答的炎症信号通路中发挥重要作用。最新文献报道TLR9.具有高脂饮食的基因敲除小鼠具有更多的内脏脂肪积累并释放炎症因素，如IL-6，MCP-1和TNF-α(9］．在人肺上皮细胞中，TLR9通过MyD88 / SRC途径升高了KLF4表达，以促进抗炎因子IL-10的释放[10］．在脂肪细胞中，TLR9/KLF4是否在脂肪酸诱导的炎症反应中发挥抗炎作用尚未见报道。

因此，本研究拟在构建高脂饮食诱导肥胖大鼠模型，研究人类大网膜脂肪组织，体外培养脂肪细胞的基础上，探索TLR9/KLF4抑制脂肪酸诱导脂肪细胞炎症反应的分子机制。这有助于阐明肥胖引发炎症的分子机制。

2.材料和方法

2．1．组织样本来源

从2014年1月到12月，95名个人参与者在新疆Uygur自治区人民医院招募了20至90岁，以进行血脂血症的体检和评估。它们分为两组：正常对照组（NC， ，18.0公斤/米²≤BMI≤23.9 kg/m²)和肥胖组(OB， ，BMI≥28 kg/m²)．采用新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心提供的雄性Wistar大鼠32只，在石河子大学实验动物中心饲养。大鼠被分为两组:高脂饮食(HFD)组( ）及正常饮食对照组( )．本研究已获医学伦理委员会批准。2014LL22)，所有参与者均签署知情同意书。

2.2。细胞系和质粒

3T3-L1细胞系从中国医学科学院基础医学研究所的细胞中心购买。Pires2，Pires2-KLF4，TLR9慢病毒载体和TLR9和KLF4的siRNA是从Gemma Pharmaceutical技术购买的。

2．3.实时聚合酶链反应

采用SYBR Premix Ex Taq (Takara)在7500 Real-time PCR系统(Applied Biosystems, Foster City, CA)上进行实时PCR。引物序列列于表中S1， 使用GAPDH或β肌动蛋白作为内部控制。

２.４.细胞培养与分化

3T3-L1细胞在添加10%胎牛血清和抗生素的DMEM中培养。培养前脂肪细胞3T3-L1分化为成熟脂肪细胞，经油红O鉴定。

2.5。转染分析

3T3-L1细胞株均进行瞬时转染和腺病毒过表达。用携带小鼠TLR9基因的空对照病毒或慢病毒和pIRES2-ZsGreen1或pIRES2-KLF4-ZsGreen1感染3T3-L1细胞进行过表达。用lipo2000转染试剂(Invitrogen，美国)进行瞬时转染试验。用小干扰RNA感染3T3-L1细胞，下调表达。

2．6．免疫印迹

总蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。膜被阻断，在4°C用抗体孵育过夜。然后，二抗室温孵育2 h。使用增强化学发光(ECL)检测系统(美国FluorChem HD2)对蛋白质进行可视化。

2.7。参与者同意和道德声明

所有参与者在参加研究之前都提供了知情和自愿的同意。该同意包括对临床信息和生物样本将用于研究的理解。同意书及伦理审批由石河子大学医学院第一附属医院医学伦理委员会提供(参考号2014LL22)。

2.8。统计分析

SPSS（版本13.0，SPSS Inc.，SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）用于数据分析。学生们 -测试和秩和测试用于比较组。使用Pearson方法进行相关分析，以及值< 0.05为具有统计学意义。

3.结果

3.1。个体大网膜脂肪组织中TLR9/KLF4及炎症相关因子的mRNA和蛋白表达水平

表格中显示了NC和OB组中的个体参与者的临床特征S2和S3．OB组TLR9、KLF4 mRNA和蛋白表达水平明显低于NC组( )，APN低于NC组。NF- p65亚基的mRNA和蛋白表达水平κB,肿瘤坏死因子-α， OB组IL-6明显高于NC组( ）(数据1(一)- - - - - -1 (c))．OB组中，TLR9 mRNA表达水平与HDL、KLF4呈显著正相关( )；KLF4的mRNA表达水平显着且与BMI，TG和TNF呈负相关α（ ）(图1 (d))．

3．2．大鼠网膜脂肪组织炎症相关因子mRNA表达水平及FFA、TLR9/KLF4与炎症相关基因的相关性

肥胖动物模型构建如图所示S1和表S4．在肥胖模型的基础上，我们研究了TLR9/KLF4及其下游炎症相关因子的mRNA表达水平。HFD组TLR9、KLF4 mRNA表达水平低于NC组，TNF- mRNA表达水平低于HFD组αHFD组IL-6水平高于NC组(图)2(一个))．

FFA水平与TLR9 mRNA表达水平呈显著负相关( ）与TNF-呈显著正相关α（ )；KLF4显着且与TLR9呈正相关（P< 0.05)，且与NF-的P65亚基呈负相关κB(图2 (b))．

3．3.3T3-L1脂肪细胞的培养与分化

3T3-L1细胞呈梭形，不存在脂滴。分化第8天成熟脂肪细胞90%以上，聚集更多脂滴。油红O染色结果显示脂滴被染红。苏木精染色结果显示细胞核呈紫色(图)3(一个))．

3．4．下调KLF4对下游炎症因子的影响

KLF4干扰24、48 h后，KLF4 mRNA表达水平显著低于si-control组和si-NC组( )．KLF4干扰24 h后，KLF4蛋白表达水平也低于si对照组和si-NC组(图)3 (b))．接下来，我们检测KLF4干扰24 h后炎症相关因子的mRNA表达水平和释放水平。结果显示，p-P65蛋白表达水平显著低于Ad-NC组(图2)3 (c))， IL-6和MCP-1 mRNA表达水平较si对照组显著升高( )，虽然与SI对照组相比，抗炎因子APN的mRNA表达水平显着降低（ ）(图3 (d))．KLF4干扰后MCP-1的释放水平也显著升高( ）(图3 (e))．

3．5．KLF4上调后对下游炎症因子的影响

将pIRES2-KLF4质粒转染至成熟脂肪细胞后24、48 h, KLF4 mRNA表达水平均显著升高( )，转染48 h后，KLF4 mRNA表达量显著高于转染24 h组( )．此外，转染48 h组KLF4蛋白表达水平也显著升高(图)3 (f))．因此，我们研究了转染KLF4质粒48 h后炎症相关因子的表达和释放水平。结果显示，p-P65蛋白表达水平显著低于Ad-NC组(图2)3 (g))，炎症相关因子如P65、TNF-的mRNA表达水平α, il - 1β，显著低于Ad-NC组( )，抗炎因子APN的mRNA表达水平显著高于Ad-NC组( ）(图3 (h))．上调KLF4后，MCP-1的释放水平显著降低( ）(图3(我))．

3.6。上调TLR9对KLF4表达的影响

首先，分别将0.3,3和10分别感染成熟脂肪细胞72小时，96小时和120小时。结果表明，当MO1为3并感染96小时时，TLR9的mRNA表达水平最高（图4(一))．因此，我们研究了在此条件下TLR9对KLF4的调控。结果显示，过表达TLR9后，脂肪细胞数量与模拟组和阴性对照组相比无显著差异。过表达TLR9后，TLR9 mRNA和蛋白表达水平均显著高于模拟对照组和阴性对照组( )．上调TLR9后，KLF4的mRNA和蛋白水平显著高于模拟对照组和阴性对照组( ）(数据4 (c)和4 (d))．与模拟对照组和阴性对照组相比，上调TLR9可显著降低P65和MCP-1 mRNA表达水平( )，显著提高APN表达水平( ）(图4 (e))．

3.7。下调TLR9对KLF4表达的影响

将红色荧光负干扰片段转染至成熟脂肪细胞，浓度梯度分别为10、50、100 nmol/L。然后分别在24 h和48 h观察转染效率。结果表明，随着浓度的增加，转染效率也随之提高，转染48 h组的荧光强度明显高于24 h组。当干扰片段浓度为50 nmol/L，干扰时间为48 h时，荧光强度达到80-90%4 (f))．接下来，我们从3个TLR9-siRNA干扰片段中筛选出最佳干扰片段，结果显示TLR9-siRNA- b01的干扰效率最高(图)4 (g))．转染TLR9-siRNA-B01片段后，与模拟对照组和阴性对照组相比，脂肪细胞数量无显著差异(图)4 (h))．转染TLR9- sirna - b01片段后，TLR9 mRNA和蛋白表达水平显著低于模拟组和阴性对照组( )．TLR9下调后，KLF4的mRNA和蛋白表达水平明显低于模拟组和阴性对照组(图)4(我)和4 (j))．下调TLR9可显著增加NF- P65亚基的mRNA表达量κB、IL-6和MCP-1 ( )，虽然APN显着降低（ )．过表达KLF4同时敲除TLR9, IL-6和MCP-1的mRNA表达水平显著降低( )，虽然APN的mRNA表达水平显着增加（ ）(图4 (k))．

3.8。在不同浓度的PA刺激下，检测TLR9/KLF4及炎性细胞因子的表达水平

选择不同浓度的饱和脂肪酸PA(0、0.2、2、20、100、200)μM)刺激脂肪细胞48 h，检测TLR9/KLF4 mRNA和蛋白表达水平。我们发现，随着PA浓度的增加，TLR9的蛋白表达水平无统计学意义，而KLF4的表达水平则呈现先升高后降低的趋势。当PA浓度为20时μM时，KLF4表达水平最高，与NC组比较差异有统计学意义( )．在100之下 μ米和200μM PA刺激后，KLF4的mRNA和蛋白表达水平较20组显著降低μM PA刺激( ）(图5(一个))．在20μM PA刺激组，IL-6、MCP-1、APN mRNA表达水平及IL-6释放水平均显著高于0μM PA刺激组。在200年的μM PA刺激组，P65，IL-6，MCP-1和IL-1的mRNA表达水平βIL-6和MCP-1的释放水平显著高于对照组μM PA刺激组。在200年的μmpa刺激组小鼠IL-6 mRNA表达水平、IL-6和MCP-1释放水平均显著高于对照组μmpa刺激组，APN mRNA表达水平显著低于20μM PA刺激组，上述差异均有统计学意义( ）(图5 (b))．

3.9。检测下游炎症因子在20μM PA刺激和下调的KLF4

在20μM PA刺激下KLF4下调，KLF4的mRNA和蛋白表达水平均显著降低( ）(图S2)．接下来，我们研究了下游炎症因子的表达。我们发现在20岁以下μM PA刺激下，KLF4下调，MCP-1和IL-1 mRNA表达水平升高β及IL-6的释放水平( )，抑制APN mRNA表达水平( ）(数据5 (c)和5 (d))．

3.10。检测下游炎症因子在200μM PA刺激和KLF4上调

在200岁以下 μM PA刺激下KLF4上调，KLF4的mRNA和蛋白表达水平均显著升高( ）(图S3)．接下来，我们检测下游炎症因子的表达。我们发现在200以下μM PA刺激下，KLF4上调可显著抑制NF- P65亚基的表达水平κB,肿瘤坏死因子-α, il - 1β，增加APN mRNA表达量( ）(数据5 (e)和5 (f))．

3.11。检测KLF4对糖脂代谢能力的影响

在培养基中，上调KLF4可显著抑制TG和GLU水平( )，而下调KLF4可显著提高TG水平( )．在20μM PA刺激下，KLF4下调可显著提高TG和GLU水平( ）(数据5 (g)和5 (h))．

4.讨论

肥胖是一种慢性炎症状态，与胰岛素抵抗、2型糖尿病等代谢性疾病密切相关[11］．FFA的积累在炎症反应中起重要作用。因此，研究脂肪酸诱导脂肪组织炎症反应的具体分子机制，将为肥胖症和代谢紊乱的治疗提供理论依据。因此，本研究拟在构建高脂饮食诱导的肥胖大鼠模型、人大网膜脂肪组织、体外培养脂肪细胞的基础上，探索TLR9/KLF4抑制脂肪酸诱导的脂肪细胞炎症反应的分子机制。

4．1.TLR9可促进KLF4表达，发挥抗炎作用

现有文献报告称KLF4作为转录因子，在不同的细胞类型中起着抗炎作用，例如血管内皮细胞，肺上皮细胞和巨噬细胞[5- - - - - -8］．KLF4是否在脂肪细胞中具有抗炎作用尚未见报道。我们的结果表明，下调KLF4可促进炎症因子IL-6和MCP-1的表达。上调KLF4可抑制炎症细胞因子IL-1的表达β和MCP-1。上述结果表明KLF4在脂肪细胞中发挥了抗炎作用。现有文献表明，TLR9可以抑制脂肪组织，结肠炎组织，肠组织和人肺上皮细胞中的炎症反应[12］．我们的结果显示，下调TLR9显著降低了KLF4和抗炎因子APN的mRNA和蛋白表达水平，同时显著促进了炎症因子的表达。这些结果提示TLR9通过增加KLF4的表达发挥抗炎作用。

4.2。高浓度的PA抑制KLF4，而对TLR9没有影响

由于FFA在肥胖诱导炎症中发挥重要作用，我们随后研究了FFA对TLR9/KLF4的影响。在个体参与者中，我们发现OB组TG和LDL水平显著升高，而KLF4的mRNA和蛋白表达水平显著低于NC组，且KLF4与TG呈显著负相关。包括TG在内的中性脂肪可分解为FFA，是炎症的关键因素。以上结果提示高浓度的FFA可能抑制KLF4的表达水平。NC组TG水平较低，KLF4表达水平较高，提示低浓度FFA可能促进KLF4表达水平。最近的研究也提出KLF4敲除可抑制巨噬细胞的脂质摄入和脂肪酸氧化能力[8］．此外，长链脂肪酸家族成员6 (Elovl6)的伸长可以抑制KLF4的表达[13］．因此，我们研究了在不同浓度的PA刺激下，脂肪细胞中KLF4和炎症因子的表达水平。结果表明，在低浓度PA刺激下，KLF4高表达可提高糖脂代谢能力。而在高浓度PA刺激下，较低的KLF4表达水平可促进炎症因子IL-6、IL-1的表达β和MCP-1。上述结果表明，高PA浓度通过抑制KLF4促进炎症因子的表达。

OB组个体参与者脂肪组织中TLR9 mRNA和蛋白表达水平均显著低于NC组，且TLR9 mRNA表达水平与HDL、KLF4呈显著正相关。同时，HFD组大鼠脂肪组织中TLR9 mRNA表达水平低于NC组，与FFA呈显著负相关，与KLF4呈正相关。以上结果提示血脂异常与脂肪组织中TLR9和KLF4的表达显著相关。在脂肪细胞培养中，我们发现TLR9正促进KLF4的表达，而在不同浓度的PA下，TLR9的表达水平没有显著差异。以上结果表明，高浓度PA抑制KLF4表达并不是通过TLR9。那么，PA是如何抑制KLF4的呢?DNA甲基化是真核生物基因表达调控的重要手段，是连接环境变化和细胞反应的桥梁。现有文献报道高脂肪饮食可导致许多代谢相关基因甲基化状态[14，15］．PA是否由于基因甲基化状态的改变而抑制KLF4的表达还有待进一步研究。

在体内，我们发现TLR9与FFA呈显著负相关，而PA在体外并不调节TLR9，这是不一致的。我们怀疑的原因是不同种类的FFA。FFA有37种，TLR9的表达可能与其他脂肪酸相关，而与PA无关，如油酸、花生四烯酸等。具体机理有待进一步研究。

4.3。KLF4上调APN表达水平

APN是脂肪细胞特异分泌的一种抗炎分子，可抑制免疫反应和动脉粥样硬化，与肥胖引起的多种代谢性疾病呈负相关[16］．我们的结果显示，与NC组相比，OB组APN表达水平较低。在脂肪细胞中，高浓度的PA抑制APN的表达。上调KLF4可显著提高APN水平，下调KLF4可显著降低APN水平。而且，在高浓度PA刺激下，KLF4过表达可显著增加APN的表达。在低浓度PA刺激下，KLF4下调可显著降低APN表达。以上结果表明，高水平的FFA通过下调KLF4抑制APN的表达水平，最终导致炎症反应。KLF4作为转录调控因子，以及KLF4是否直接调控比例导引基因表达需要进一步研究。

综上所述，我们的研究探索了TLR9/KLF4抑制脂肪酸诱导的脂肪细胞炎症反应的分子机制，有助于阐明肥胖引发炎症的分子机制，提供新的实验依据。虽然我们的研究发现FFA通过抑制脂肪细胞的TLR9/KLF4促进炎症，但我们并没有排除关键因素在炎症过程中的作用。因此，在未来，我们还需要进一步探索其具体的分子机制。

数据可用性

用于支持本研究结果的qRT-PCR、Western blot和ELISA数据可根据要求从通讯作者处获得。

的利益冲突

作者声明他们没有竞争利益。

作者的贡献

王翠哲、张美秀对本文贡献均等。

致谢

我们感谢汉族博士，从新疆石河子大学药学学院，为提供传统的Uygur医学，土耳其疾病，完成我们的研究。这项工作得到了中国自然科学基金（第81360142号和81660137），新疆军团（2015AG016），石河子大学项目（ZZZC201701A）和学生研究培训计划（SRP2018074）的应用基础研究。

补充材料

表S1:引物片段序列。表S2: NC组和OB组受试者指标和生化参数的比较。表S3: NC组与OB组个体生化指标及炎症因子水平比较。表S4:肥胖模型大鼠血糖、血脂、脂肪细胞因子、炎症因子水平比较。图S1:肥胖动物模型构建。在喂食正常饮食和高脂肪饮食的同时，对大鼠进行了10周的监测。(A)体重( 老鼠每组)。(B)老鼠的出现。比例尺:1厘米。(C)内脏脂肪团和肝脏外观。比例尺:1厘米。 -测试时，给出的值为平均值±SD。 ， 与NC组比较。图S2: 20后KLF4的表达水平μM PA刺激和si-KLF4。(A) KLF4 mRNA表达水平。(B) KLF4蛋白表达水平。 -测试， ， ；差异具有统计学意义。图S3: 200后KLF4的表达水平μM PA刺激和KLF4转染。(A) KLF4 mRNA表达水平。(B) KLF4蛋白表达水平。 -测试， ， ；差异具有统计学意义。（补充材料）

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