文摘
各种CD44表达亚型在几个癌症干细胞在肿瘤进展和转移。特别是,CD44变体9 (CD44v9)是慢性inflammation-induced癌症中高度表达。我们调查的表达CD44v9和评估CD44v9是否人类胆管癌的选择性生物标志物(CCA)。CD44v9的表达谱是评估在人类肝吸虫Opisthorchis viverrini有关的CCA (OV-CCA)组织、人力CCA(独立于OV感染,non-OV-CCA)组织和正常肝组织。CD44v9超表达是通过免疫组织化学方法检测(包含IHC) CCA组织。有一个更高层次的CD44v9 OV-CCA组织的表达和包含IHC得分比non-OV-CCA组织,也没有CD44v9染色胆管细胞的正常肝组织。另外,我们观察到的表达明显高于炎症相关的标记,如S100P和cox - 2在OV-CCA组织相比,在non-OV和正常肝组织。因此,这些发现表明,CD44v9可能是小说候选人CCA干细胞标记,可能与炎症反应有关癌症发展。
1。介绍
感染和慢性炎症是致癌的重要因素,和胆管癌(CCA)是一种特定类型的癌症炎症反应。CCA的潜在风险因素是寄生虫感染(Opisthorchis viverrini和Clonorchis sinensis),胆管疾病(胆道囊肿和hepatolithiasis),毒素,并发症(糖尿病、肝硬化和肥胖)、饮酒和吸烟1]。CCA的发病率在全球范围内上升,最高速率发生在泰国,尤其是在东北地区如孔敬省。在孔敬省高发CCA的案件有关Opisthorchis viverrini(OV)感染(2]。OV感染增加炎症和扩大胆管和结缔组织,最终导致periductal纤维化和胆管癌的发展(3]。CCA的诊断是困难的,因为临床沉默和特异性的外观。发现特定的分子生物标志物可能援助CCA的早期和明确的诊断。
CD44是一种跨膜糖蛋白,是无所不在地合成,并表示等几种类型的哺乳动物细胞的白细胞,红细胞,大脑细胞,上皮细胞(4]。可变剪接的结果在几个亚型CD44与不同的功能。CD44的标准对碘氧基苯甲醚(CD44)通常是表达在大多数正常上皮细胞和变异亚型的表达CD44 (CD44v)在某些上皮细胞癌(5]。CD44v参与细胞增殖、分化、迁移、粘附在正常细胞和癌细胞转移。最近,CD44v提出了作为几种类型的癌症干细胞标记(6]。特别是,CD44变体9 (CD44v9)在膀胱癌中,胰腺癌和结肠癌7- - - - - -9]。过度的CD44v9胃癌引起的慢性炎症幽门螺杆菌感染是一种预后生物标志物在早期阶段,是复发的预测指标10,11]。这些发现表明,CD44v9是一个选择性的目标炎症相关的CCA。
在这项研究中,我们调查了表达式的CD44v9 OV-related CCA (OV-CCA)组织相比,在正常胆管细胞和组织CCA的独立OV感染(non-OV-CCA)免疫组织化学(包含IHC)。S100钙结合蛋白P (S100P)是一个重要的调停人的癌症相关的炎症(12- - - - - -14),导致肿瘤浸润和转移(15CCA, S100P被认定为生物标志物在non-OV-CCA [16]和OV-CCA [17]。超表达S100P可能有助于预测CCA患者的临床结果(18,19]。Cyclooxygenase-2 (cox - 2)也参与炎症,和我们分析cox - 2和S100P澄清OV-related CCA和炎症之间的关系。
2。材料和方法
2.1。组织样本和临床数据
33人类肝脏fluke-caused CCA组织(男性,26日7雌性)得到Srinagarind胆管癌研究所的医院,孔敬、泰国孔敬大学。CCA的集合组织是人类研究伦理委员会的批准(HE571283),泰国孔敬大学。知情同意是获得所有CCA的病人。记录患者的临床资料,包括年龄和性别。所有癌症组织分类使用与TMN阶段(第七版20.]。
人体组织微阵列幻灯片包括正常肝组织(21例:12男性,9雌性)和CCA组织(98例:56岁男性,42岁女性)都从我们这里购买以下Inc . (LVN801 LV1004, Derwood,马里兰州,美国)。CCA组织在各种类和肿瘤TNM分类阶段。
2.2。免疫组织化学染色(包含IHC)和得分
嵌入组织部分deparaffinized二甲苯和患者使用乙醇分级系列解决方案。抗原检索是由加热组织部分5%尿素在微波炉500瓦5分钟。内源性过氧化物酶活动就熄了1%的H2O2(关东大化工、东京、日本)其次是阻挡1%的脱脂牛奶(BD生物科学,圣何塞,加利福尼亚,美国)。部分是处理主要抗体(鼠anti-CD44v9单克隆抗体从都市性生物,东京,日本;山羊anti-COX-2从圣克鲁斯生物技术,达拉斯,德克萨斯,美国;和兔子anti-S100P Abcam生物技术、英国剑桥稀释1:300)在一个潮湿的室。部分被孵化与生物素化的二次抗体(美国加州向量实验室,伯林盖姆)包括兔子anti-rat免疫球蛋白,兔抗体免疫球蛋白,和山羊anti-rabbit免疫球蛋白。所有的部分都孵化avidin-biotin-peroxidase共轭。免疫反应被激活过氧化物酶染色民建联工具包(Nacalai Tesque,京都,日本),与苏木精复染色,安装Entellan新(默克密理博,达姆施塔特,德国)。染色组织在显微镜下是可视化(奥林巴斯BX53F、东京、日本)。由一个包含IHC染色的强度分级评分0和4之间由两个调查如下:没有染色(0),弱染色(1 +),适度染色(2 +),强大的染色(3 +),和很强的染色(4 +)cholangiocytes和CCA癌细胞。每个分数的代表图片如图所示S1A。
石蜡包埋组织OV-CCA从18岁患者使用双荧光染色法染色。主要抗体(anti-CD44v9 S100P, cox - 2抗体)使用的稀释1:200年,和二级抗体(donkey-anti-rat免疫球蛋白Alexa萤石488年和594年,donkey-anti-rabbit免疫球蛋白Alexa萤石488和donkey-anti-goat免疫球蛋白Alexa萤石594)(Abcam生物技术,剑桥,英国)使用的稀释1:400。核是用DAPI染色(南方生物技术,伯明翰,阿拉巴马州,美国)。通过荧光显微镜检查染色组织(奥林巴斯BX53F、东京、日本)。
2.3。统计分析
使用SPSS统计分析软件版本23.0(美国IBM公司)。三组之间比较病人临床资料,卡方检验是用于年龄分布、性别比例、TNM阶段。非参数执行克鲁斯卡尔-沃利斯检验来确定显著差异包含IHC得分在三组之间,其次是多重比较的调整值Bonferroni方法(成对测试小于0.05 / 3 = 0.017在0.05显著水平和0.01 / 3 = 0.0033 0.01级)。统计分析被认为是显著的 。
3所示。结果
3.1。CCA患者的临床特征
样本数据的汇总如表所示1。研究对象的年龄分布年轻正常肝组织阵列比non-OV和OV-CCA患者样本。的年龄分布没有显著区别non-OV和OV-CCA组。之间的性别比例没有明显不同的三组。患者OV-CCA比non-OV-CCA病人和更严重的癌症恶化明显更高程度的肿瘤年级(T;T1-2与T3-4),淋巴结转移年级(N;N0和N1),和远处转移品位(M;M0、M1)。有一个更高的阶段(3 + 4)数量的增加在OV-CCA情况下比non-OV-CCA病例。
3.2。超表达人类CCA CD44v9的组织
Cholangiocytes在正常肝组织中没有CD44v9由包含IHC染色(图1(a))。在CCA组织,CD44v9表达式在癌症细胞的细胞膜和细胞质(数字1(b)和1(c))。在这些组织没有污渍(图主要抗体被删除了印地)。在正常肝脏样本( ),没有积极CD44v9染色(0%)。CD44v9染色在non-OV-CCA的55.1% ( )和OV-CCA病例的87.9% ( )。IHC得分CD44v9 CCA组织中明显高于正常组织(图2(一个))。此外,CD44v9染色OV-CCA组的得分显著高于non-OV-CCA组。
(一)
(b)
(c)
3.3。表达CCA组织的炎症相关的标记
S100P染色中没有检测到胆管细胞的正常肝组织(图1(d))。相比之下,S100P染色发生在细胞核和细胞质的癌细胞(CCA组织数据1(e)和1(f))。没有主要的抗体,在这些组织(图染色观察印地)。正常肝组织标本都是负染色。S100P表达式在OV-CCA病例non-OV-CCA病例的58.2%和97.0%。CCA组织包含IHC分数有显著大于正常肝组织和得分都显著高于OV-CCA组织比non-OV-CCA组织(图2 (b))。
同样,cox - 2表达cholangiocytes中没有观察到正常肝组织(图1(g))。cox - 2在细胞质和细胞核中胆管癌细胞(数字1(h)和1(我))。染色组织未检测到不包括初级抗体(图印地)。cox - 2 non-OV组织的染色是积极的在56.1%和100%的OV-CCA组织。cox - 2包含IHC分数明显高于non-OV和OV-CCA组织相比,在正常肝组织和得分OV-CCA组织明显高于non-OV组织(图2 (c))。
这些分子的表达中non-OV-CCA OV-CCA样本,CD44v9的染色强度之间存在显著的相关性和S100P或cox - 2的斯皮尔曼等级相关系数()。CD44v9和S100P(之间的相关性是温和的 , )和CD44v9和cox - 2 ( , )。
3.4。双荧光染色法对人类OV-CCA组织
CD44v9 OV-CCA组织,主要是表达的细胞膜和细胞质中的适度CCA细胞(数字3(b)和3(f))和S100P大多出现在细胞质和细胞核的癌细胞(图3(c))。Double-positive细胞CD44v9 S100P OV-CCA组织(图中观察到3(d))。cox - 2表达于肿瘤细胞的细胞核和细胞质(图3(g))。CD44v9和cox - 2表达的一些癌细胞OV-CCA组织(图3(h))。
4所示。讨论
我们首先评估CD44v9包含IHC OV-related CCA的候选生物标志物。CD44v9表达水平明显高于在癌细胞CCA的病人,尤其是OV-CCA,比正常肝组织。我们也调查了炎症标记物的表达,S100P和cox - 2在CCA组织,主要在OV-CCA。
人类CD44基因的选择性剪接产生不同的亚型CD44变体,大量表达于多种癌症,而标准同种型主要表达在正常上皮细胞(21]。在多个变异亚型的复合物,可变区域的外显子的组合提供了一个异质性的CD44分子。外显子的组合,CD44的亚型包括属性的组织表达不同的表达在不同组织与正常或患病的状态22]。这些组合主要表现在专业组织,例如,CD44v3-10是一种角化细胞和CD44v8-10是一种上皮23- - - - - -25]。此外,CD44的各种亚型可能提供一个广泛的生理功能,并有可能进一步定义函数(26,27)根据一系列外显子组合通过其CD44拼接变体的转译后的修改,这对分子相互作用和致瘤性的影响(28]。非霍奇金淋巴瘤(NHL)显示不同的表达模式之间个人v6和v6-containing亚型。单个CD44v6外显子成分在低级NHL表示,虽然v6外显子的组合与其他变体外显子在高档NHL (29日]。不同组织表达CD44变异与各种外显子的组合,和细胞功能可能与外显子的变量组合。在各种外显子组合,CD44v9参与几个外显子的组合,如v1-10 v6-10 v7-10, v8-10。在胃腺癌,CD44v9包含在v6-10 v7-10, v8-10组合(30.]。CD44v8-10 CCA癌症干细胞的发展有一个作用通过氧化还原调控(31日]。信使rna剪接缺陷是癌症的一个重要原因,也是最常见的剪接缺陷基因点突变(剪切位点32]。目前的研究显示,CCA CD44v9的存在,和我们之前的研究33,34]表明炎症相关的DNA损伤。进一步的研究需要阐明CCA发展由剪接的分子机制的缺陷。
炎症是一个根本性的促进因素。OV感染导致的生产活性氧(ROS),如一氧化氮、超氧化物,导致DNA损伤的形成,包括8-nitroguanine和8-oxo-7 8-dihydro-2脱氧鸟苷(8-oxodG) [33,34),表示OV感染引起炎症反应的致癌作用。以前,我们发现高水平的表达干细胞标记,CD133和Oct3/4,和高水平的8-oxodG OV-CCA组织,这表明干细胞突变参与炎症微环境在开发(CCA35]。CD44变异亚型包括CD44v9减轻活性氧(31日,36),这或许可以解释的高水平的表达CD44v9除了S100P和cox - 2主要在OV-CCA的组织,一个癌症由炎症。CD44v9-positive non-OV和OV-CCA组织细胞被发现。一些CD44v9 non-OV-CCA组织表达,这也可能被解释成一个报告实体肿瘤包括CCA炎症条件下包括缺氧(37]。此外,S100P和受体的表达之间的相关性晚期糖化终产物(愤怒)据报道[38),可能参与炎症反应包括cox - 2诱导。我们假定环境factor-related OV等炎症感染和tumor-producing炎症如缺氧和S100P-RAGE多个步骤的致癌作用[39]。OV-CCA都可能会影响到OV和tumor-producing炎症感染,和non-OV-CCA可能受到tumor-producing炎症。有趣的是,在这项研究中,显著正相关性之间的染色观察CD44v9 S100P或cox - 2,暗示CD44v9在炎症中的作用。这一发现提出了一个可能性,CD44v9表达式与CCA开发期间炎症状态有关。
以前,我们发现长时间氧化应激诱导干细胞特性,差别通过基因对这些结果与积极的临床结果(CCA创世纪40]。瞿等人观察CD44和S100P蛋白质的coexpression spheroid-forming胰腺导管上皮细胞长期受到镉,这表明S100P表达可能导致球状体的进取,具备干细胞性质(41]。在炎症微环境,cox - 2刺激乳腺癌干细胞的发展(42),而CD44的扩散+胃癌干细胞细胞由cox - 2 / PGE2-mediated协同刺激信号(43]。以前,我们发现cox - 2激活可能参与inflammation-mediated干细胞增殖和分化膀胱致癌作用[44]。尽管还不清楚炎症影响癌细胞具备干细胞,我们的结果表明CD44v9和炎症之间的正相关关系。
一些研究发现,CD44v9表达式与癌症致瘤性。登等人观察到的高表达CD44v9在胰腺癌细胞在有丝分裂期间的发展8]。此外,CD44v9-expressed细胞凋亡阻力,增强了入侵的属性(45,46]。王等人说明,一个小人口CCA cd44阳性细胞的癌症干细胞的特性包括自我更新(47]。Seishima等人报道,抗炎药物柳氮磺胺吡啶减少CD44v9-positive细胞的增殖并产生重大影响溃疡性colitis-associated肿瘤细胞分化[48]。同样,癌细胞的形成在人类胃inflammation-mediated腺癌与CD44v9表达式。此外,CD44v9-ablated或sulfasalazine-treated小鼠胃肿瘤细胞的减少了扩张和发展的癌变前的病变在胃里(49]。我们观察到超表达的CD44v9 CCA,尤其是OV-CCA。综上所述,这些数据显示的重要性CD44v9-positive癌症干细胞在癌症炎症性的进展。重新评估的抗炎药可能是一种有价值的方法开发新的化疗。CD44v9-targeted癌症干细胞的进一步研究是必要的,和CCA CD44v9可能指向的超表达新的抗癌干细胞治疗策略。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
这项工作在一定程度上支持jsp KAKENHI格兰特数字JP16H05255(毫米)和JP17H04654 (NM)。作者(NS)谢谢支持日本政府奖学金(下边了)。
补充材料
补充图S1:包含IHC得分和消极的控制。(A)代表CCA正面和负面的染色CD44v9的例子(A E), S100P (F J)和cox - 2 (K O)得分范围如下:0没有染色(F, K), 1 +弱染色(B, G, L), 2 +适度染色(C, H, M), 3 +强劲染色(D,我,N)和4 +很强的染色(E, J O)。(B)代表CCA的例子组织染色没有主要抗体。CCA组织只沾二级抗体(VECTASTAIN精英ABC合装备),包括兔子anti-rat免疫球蛋白为CD44v9 (pk - 6104),山羊anti-rabbit免疫球蛋白为S100P (pk - 6101),抗体和兔免疫球蛋白对cox - 2 (pk - 6105)。(补充材料)