文摘

甲型流感病毒的PB1-F2蛋白被认为是毒性因子,但其功能在诱导细胞凋亡可能是病毒复制的缺点。主机PB1-F2-induced调节细胞凋亡机制仍然未知。我们生成一个PB1-F2-deficient禽流感病毒(AIV) H9N2,发现突变病毒复制有效地减少人类肺上皮细胞。PB1-F2-deficient病毒产生更少的凋亡细胞,这表明PB1-F2 H9N2病毒促进细胞凋亡,发生感染的早期阶段,在肺上皮细胞。了解宿主细胞调节PB1-F2-induced细胞凋亡,探讨识别细胞蛋白相互作用PB1-F2,发现HCLS1-associated蛋白质x - 1 (HAX-1),主要位于线粒体凋亡抑制剂,与PB1-F2互动。增加procaspase-9激活,PB1-F2引起的,可以通过HAX-1抑制。在HAX-1击倒A549细胞的复制AIV H9N2并行抑制caspase-3激活的激活,这增加了感染的早期阶段。我们假设HAX-1促进AIV复制PB1-F2相互作用,导致细胞凋亡的抑制,延长细胞存活,增强病毒复制。我们的数据表明,HAX-1 AIV H9N2复制可能是一个促进因素通过脱敏PB1-F2人类肺上皮细胞的凋亡诱导。

1。介绍

H9N2病毒是一种低致病性禽流感病毒和一直关注不仅家禽业,而且人类健康。研究发现,人类支气管上皮容易H9N2 [1],它能够跨越物种屏障(2),自1999年以来已经感染人类。H9N2病毒提出了《创世纪》的内部基因供体的高致病性H5N1和最近新兴AIV AIV H7N9通过基因重组时H9N2病毒在家禽市场接触cocirculated候鸟携带其他亚型AIV [3,4]。

PB1-F2蛋白最初发现通过筛选得到CD8抗原肽的认同+T淋巴细胞(5),在PB1基因编码的另一个阅读框。大约96%的AIV毒株有长篇PB1-F2,而人类H1N1病毒具有截断57氨基酸或完全缺乏蛋白质(6]。然而,PB1-F2可有可无的在大流行性H1N1病毒(2009年)的一项研究中证明,如果PB1-F2恢复全身的形式通过反向遗传学、没有影响病毒的复制和小鼠发病机理7]。此外,PB1-F2季节性H1N1病毒感染的发病机制不重要的雪貂(8]。除了这些角色在流感monoinfection PB1-F2质数,促进更多的肺免疫病理重复感染导致继发性细菌性肺炎,特别是革兰氏阳性病菌引起的(9,10]。它表明PB1-F2可能在不同AIV亚型感染的功能不同。

线粒体靶向序列被确定在整个H1N1 (PR8) PB1-F2[糖基5),而H5N1 PB1-F2截然不同的c端没有目标或部分目标线粒体(11]。糖残基形成α螺旋被视为最低限度要求(Lys73 Arg75)线粒体靶向序列(12]。特征映射研究其他残留物位于糖基(Ser66 H5N1型病毒;Pro62、His75 Gln79, H3N2 Ser82;Ile68、Leu69 Val70密切相关的H1N1流感引起的促炎和致病性的影响PB1-F2 [13- - - - - -16]。这些研究表明线粒体定位及其功能之间的相关性。然而,PB1-F2角色的n端了解甚少,尽管两个短和虚弱α提出了螺旋(17]。

线粒体的位置和membrane-binding活动PB1-F2支持它作为凋亡和proinflammation诱导物以及继发性细菌重复感染的增强剂。这个凋亡敏感最初观察到主要在免疫细胞(5]。接下来,PB1-F2发现定位主要在A549细胞的线粒体,能够诱导细胞凋亡的相互作用内线粒体膜腺嘌呤核苷酸转运蛋白3 (ANT3)和线粒体外膜压敏电阻器阴离子通道1 (VDAC1),导致更高的线粒体膜透性和细胞色素c的释放18]。

我们有限的知识的影响H9N2 PB1-F2 induced-apoptosis在病毒复制,毒性和发病机理。研究表明,细胞凋亡在流感病毒感染可能是抑制在不同细胞类型(19- - - - - -22]。我们之前的数据表明细胞凋亡增加受损的流感病毒复制和病毒非结构蛋白NS1提升部分通过抑制病毒复制的Fas-FasL凋亡信号在感染H9N2 [22]。最近的一份报告显示,高致病性H5N1病毒在人类支气管和肺泡上皮细胞延迟凋亡病毒复制的持续时间延长,导致H5N1发病机理(20.]。问题依然存在,然而,PB1-F2-induced凋亡是否可以通过一些机制监管涉及PB1-F2本身在感染。在这项研究中,我们报告HCLS1-associated蛋白质x - 1 (HAX-1)是直接与PB1-F2 H9N2 AIV,和协会有助于抑制PB1-F2诱导细胞凋亡在人类肺上皮细胞。我们建议直接与PB1-F2 HAX-1蛋白质间交互作用可能在PB1-F2-induced关键细胞凋亡和病毒复制H9N2病毒感染人类的肺上皮细胞。

2。材料和方法

2.1。细胞和试剂

Mardin-Darby狗肾细胞(MDCK),人类胚胎肾HEK 293 t细胞,和人类肺癌A549细胞上皮癌在这项研究中与DMEM培养基培养(表达载体,卡尔斯巴德,CA), 10%胎牛血清(HyClone,洛根,UT), 1毫米丙酮酸钠(Amresco,梭伦,哦),和1% antibiotic-antimycotic解决方案(表达载体)37°C常数5%孵化器有限公司2。转染试剂TransIT-LT1购买从Mirus生物(麦迪逊,WI)。主要的抗体细胞色素c (sc - 7159), HA标签(sc - 805),β肌动蛋白(sc - 47778)和HAX-1 (sc - 166845)是来自圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯,CA)和Flag-tag M2单克隆抗体购自Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州)。Anti-cleaved caspase-9(9501号)抗体,Anti-cleaved caspase-3(编号为9664)的抗体,和辣根过氧化物酶(合)和碱性磷酸酶(美联社)——共轭anti-rabbit免疫球蛋白g细胞获得信号技术(丹弗斯,MA)。HRP-conjugated anti-mouse免疫球蛋白是购自阳光生物技术(中国南京)。

2.2。病毒和反向遗传学所产生的突变体

甲型流感病毒株/野鸡/ CA / 2373/1998 (H9N2)是一种低致病性AIV孤立从野鸡如前所述[23]。我们传播这个H9N2病毒接种10天大的无菌鸡鸡胚蛋。在37°C孵化后48小时(小时),尿囊液是收获和滴定MDCK细胞空斑实验。所有八个基因被克隆pDP2000向量(24]。

生成PB1-F2-deficient病毒,一个cytosine-to-adenine核苷酸替换被引入PB1-expressing质粒pDP2000将丝氨酸(TCA)编码的氨基酸位置12 PB1-F2停止密码子(TAA)。这种核苷酸替换在+ 1开放阅读框没有改变相应的帧的缬氨酸PB1和PB1-N40,因此,这两个蛋白没有改变(图1(一))。反向遗传学的方法被用来生成与八pDP2000-based突变H9N2病毒质粒(22,24)指定为H9N2(ΔPB1-F2)。野生型H9N2病毒粒子(wt)是由cotransfection八原始质粒。H9N2 (wt)和H9N2(ΔPB1-F2)病毒进一步传播鸡鸡胚蛋,和合成尿囊液之前收获病毒滴定和整除储存在−80°C。病毒感染实验之前,RNA提取股票和所有病毒基因组测序再次确认,只有介绍了单核苷酸突变(数据没有显示)。

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图1
PB1-F2是流感病毒复制的关键和敏感的人类肺上皮细胞凋亡。(一)代PB1-F2-deficient H9N2病毒突变,H9N2(ΔPB1-F2)。过早终止密码子(TAA)引入取代丝氨酸(TCA)野生型病毒,H9N2 (wt),在不改变的缬氨酸PB1和N40编码序列。(b)减少病毒的大小没有PB1-F2斑块。MDCK细胞注射H9N2 (wt)或H9N2病毒(ΔPB1-F2)(右边),和一个标准的空斑实验。(c) H9N2病毒滴度降低(ΔPB1-F2)复制人类肺上皮细胞A549。病毒滴度的滴定是重复,意味着±SD值显示(学生的t -测试中, )。(d)早期PB1-F2诱导细胞凋亡。A549细胞感染H9N2 (wt)或H9N2(ΔPB1-F2)和使胰蛋白酶化在6、12、24小时后感染获得单细胞停赛,而随后沾FITC-annexin V和propidium碘(PI)与流式细胞术分析。
2.3。空斑实验

MDCK细胞被播种在6-well盘子和培养在一夜之间37°C到80%汇合的单层成立。从病毒接种鸡胚尿囊液蛋或培养基从感染的细胞在DMEM培养基连续稀释10倍的井。病毒附件1小时后,病毒细胞接种物被丢弃,冲洗前两次与PBS plaque-grade 2毫升1%琼脂糖在Opti-MEM (Gibco,宏伟的岛,纽约)包含2μg tolylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl酮(TPCK)胰蛋白酶(Sigma-Aldrich)补充道。孵化后48 - 72小时,绝对数字在每个稀释形成斑块的统计计算传染性病毒滴度(空斑形成单位,空斑形成单位/毫升)。琼脂糖覆盖从盘子,很仔细,细胞与结晶紫染色。

2.4。筛选PB1-F2相互作用的蛋白质

媒人黄金酵母2台混合动力系统(Clontech实验室、山景、CA)应用于屏幕宿主蛋白质与PB1-F2交互H9N2 AIV的蛋白质。全身PB1-F2互补DNA克隆到pGBKT7下游(互补)Gal4基因融合作为诱饵,pGAD-based人类淋巴cDNA图书馆(Clontech)是用于筛选AH109酵母细胞根据制造商的协议。初步筛选后,十几个积极的候选人被确定。交互是进一步证实了在随后的并发转化与单独提纯cDNA克隆和酵母,PB1-F2 cDNA克隆导致积极的进行进一步的分析,包括DNA测序。接下来,n端或c端PB1-F2克隆到pGBKT7同样是用于识别PB1-F2和HAX-1交互。

2.5。免疫印迹分析和Coimmunoprecipitation (Co-IP)

转染和感染细胞细胞溶解在裂解缓冲(50毫米三,150毫米氯化钠)NP-40 1%, 2毫米PMSF, 1毫米Na3签证官4氟化钠,2毫米,1μg / ml抑肽酶(Sigma-Aldrich)。溶菌产物离心机在400年 5分钟,胞质分数的细胞溶解产物转移,热变性,蛋白质sds - page和随后被玷污Immuno-Blot PVDF膜(微孔、Billerica MA)进行免疫印迹分析。膜被封锁的5% blotting-grade牛奶和孵化的主要抗体(兔子anti-cleaved caspase-9或anti-cleaved caspase-3)一夜之间在4°C。后四个洗TBS含有0.05%渐变20 (TBST),膜与美联社孵化——或者HRP-conjugated二级抗体90分钟前在室温下进一步洗涤。与AP-conjugated二级抗体检测,电视台/ BCIP衬底(英杰公司)是用于信号开发膜;与HRP-conjugated二级抗体检测,ECL-Plus免疫印迹检测试剂(Beyotime、杭州、中国)使用和膜暴露在G:盒子化学系统(Syngene博士)。

过度表现PB1-F2 HAX-1在哺乳动物细胞,全身PB1-F2从pDP2000-PB1放大一个氨基端国旗标签和subcloned pRK5骨干。HAX-1放大于A549互补脱氧核糖核酸的氨基端HA标签和插入pRK5向量。对于Co-IP分析,HEK293T细胞cotransfected具有相同数量的pRK5-Flag-PB1-F2 pRK5-HA-HAX-1。16小时后,细胞被完全溶解如上所述。200年μl量化的溶解产物与1孵化μ克老鼠anti-Flag M2 (Sigma-Aldrich F1804)或anti-HA标签(C29F4)抗体(细胞信号技术,数字3956)在4°C隔夜孵化。20.μl的蛋白质/ G-agarose珠子加入溶菌产物和孵化2小时在4°C沉淀抗原抗体复合物。珠子与裂解缓冲洗3次在4°C,然后SDS-loading缓冲区添加和免疫沉淀反应变性进行免疫印迹分析。

2.6。Colocalization PB1-F2和HAX-1线粒体

可视化的亚细胞定位PB1-F2 HAX-1,我们构造pcDNA3.1-Zeo (−) -HA-HAX1 pcDNA3.1-Zeo -Flag-PB1-F2(+)和pcDNA3.1-Zeo -HA-PB1-F2 (+)。A549细胞生长在盖玻片12-well盘子转染有1μg pcDNA3.1-HA-HAX-1和pcDNA3.1-Flag-PB1-F2的质粒。24小时后,Mitotracker(热费希尔科学、M7512)添加到细胞最终浓度为0.2μm .四十分钟孵化后37°C,细胞被固定为4% PFA然后permeabilized Triton x - 100年的0.25%。主要的抗体购自细胞信号技术(HA-tag (C29F4)兔mAb)和Sigma-Aldrich(单克隆anti-Flag M2鼠标F1804)。第二抗体是anti-Mouse-Alexa萤石488(- 11001)和anti-Rabbit-Alexa萤石546(- 11010)热费舍尔科学。免疫荧光染色后,细胞被安排共焦扫描(徕卡相机AG)。

2.7。的shRNA击倒HAX-1

慢病毒载体表达成分,专门针对HAX1基因,用于获取HAX-1稳定的可拆卸的细胞系。我们选择两种成分针对不同网站mRNA的人类HAX-1基因和甘油股GIPZ慢病毒成分的结构被命令库通过热费希尔科学(罗克福德,IL)。是V2LHS_65286 V3LHS_343976 HAX-1 shRNA序列信息。获得传染性慢病毒,我们cotransfected TLA293生产细胞(热费希尔科学)pGIPZ质粒含有成分序列和包装质粒混合使用在转染试剂(热费希尔科学)后,制造商的程序。文化中包含慢病毒转染后48小时后,收获并用来感染A549细胞6-well盘子。中取代了48小时后;然后1μ克/毫升的嘌呤霉素为shRNA-expressing细胞的选择增加了一周。A549细胞尼康荧光显微镜下的日常监控,直到所有的细胞变成绿色,这依赖于coexpressed TurboGFP信号在同一盒。击倒puromycin-selected稳定A549细胞的效率是衡量使用HAX-1-specific定量实时PCR引物,如部分所示2.10。克隆可拆卸的效率最高的传播和维护在0.8μ克/毫升的嘌呤霉素为后续功能实验。

2.8。Caspase-9活动分析

与pRK5-HA-HAX-1 A549细胞转染,pRK5-Flag-PB1-F2,或两者兼而有之。16小时后转染细胞,细胞溶解和总蛋白质是由BCA量化分析的标准化测量酶活动之前输入(25),由试剂供应商建议的方法(个人沟通)。Caspase-9活动是衡量使用Caspase-9活动分析工具包(Desenbio,北京)。短暂,caspase-9的催化活性细胞溶解产物是由孵化caspase-9肽底物的溶解产物Leu-Glu-His-Asp-p-nitroanilide (LEHD-pNA) 37°C 2小时。比色的发展之后,在波长405纳米的吸收值读。数据显示为褶皱变化相比mock-transfected或未感染组。每个小组进行了一式三份独立实验。

2.9。流仪分析细胞凋亡

A549细胞感染H9N2 (wt)或H9N2(ΔPB1-F2),分别在同一感染复数(MOI)为0.1。在不同的时间点,培养基是丢弃和细胞与冷PBS胰蛋白酶化之前洗两次。一百万个细胞在100年resuspendedμl绑定缓冲;然后10μl (FITC-conjugated膜联蛋白V和10μl (propidium碘(PI)(表达载体)补充道,和染色反应是在黑暗中在冰面上15分钟。PBS的细胞被洗了三次,紧随其后的是流仪分析细胞分选仪(BD FACSAria,富兰克林湖,新泽西)。

2.10。定量实时聚合酶链反应

总RNA从HAX-1wt和HAX-1kdA549细胞提取RNA简单工具(Tiangen,北京)。1μ克总RNA用于使用Primescript RT反转录试剂盒(豆类、志贺、日本)。实时PCR与1执行μl的cDNA总量的10μl与SYBR预混料交货Taq II(豆类)后,制造商的协议(HAX-1引物:5 -agtaacccgacacgaagcag-3 和反义5 -ggaaccaacgtcccaggaat-3 )。相对基因表达水平是由一个内部标准化glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)控制,和褶皱HAX-1基因表达水平的变化计算公式后2(ΔCt HAX-1−ΔCt GAPDH)如前所述(22,26]。

2.11。统计分析

双尾学生的t以及用于分析的数据统计。不同的信心95%或更高( )被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。PB1-F2是病毒复制的关键和影响H9N2-Induced人类肺上皮细胞凋亡

评估的作用在AIV感染病毒PB1-F2上皮细胞,我们生成一个PB1-F2-deficient H9N2病毒反向遗传学方法。介绍了一个终止密码子142年取代位置的核苷酸胞嘧啶与腺嘌呤在PB1-F2阅读框(图1(一))。氨基酸的改变导致了早期的平移终止,截断PB1-F2不阻碍PB1及其在坐标系截断N40的表达。突变被指定为H9N2病毒(ΔPB1-F2)。H9N2病毒(ΔPB1-F2)形成较小的斑块的大小比H9N2 (wt)层的MDCK细胞(图1 (b))。它表明PB1-F2 MDCK细胞中病毒复制可能是至关重要的。传染性病毒空斑实验表明H9N2 (wt)的浓度高于H9N2 (ΔPB1-F2),一个显著差异在36小时pi工作。(图近10倍1 (c))。

检查如果PB1-F2诱导上皮细胞凋亡,A549细胞感染H9N2(ΔPB1-F2)或H9N2病毒(wt)并受膜联蛋白V / PI染色在表示时间点进行流式细胞术分析。与感染H9N2 (wt)相比,有更少的死细胞(膜联蛋白V+π+)发现H9N2-infected组(ΔPB1-F2) 6和12小时皮。然而,没有差别在两组之间的凋亡细胞后期(24小时p。)(图1 (d))。结果表明,PB1-F2促进了病毒复制。另一方面,PB1-F2似乎也使细胞凋亡,发生感染的早期阶段,可能起到负面作用对病毒复制通过缩短宿主细胞的生存。PB1-F2促进H9N2病毒复制不可能通过其凋亡敏感。可能有一个未知的机制,在感染可能调节PB1-F2诱导细胞凋亡。

3.2。PB1-F2与HAX-1

我们假定PB1-F2可能受细胞组件,从而影响其诱导细胞凋亡。因此,我们决定屏幕人类cDNA图书馆与PB1-F2蛋白质相互作用的酵母二者混合方法。12个蛋白被鉴定为列在表中1,包括SIVA1凋亡诱导因素,视黄段2,无所不在地表达了prefoldin-like伴侣。HCLS1-associated蛋白质x - 1 (HAX-1)确认(表1)。

表1
PB1-F2蛋白质识别由酵母2台混合动力系统进行交互。

确认HAX-1之间的交互和PB1-F2细胞,HEK293T细胞cotransfected pRK5-Flag-PB1-F2和pRK5-HA-HAX-1,其次是coimmunoprecipitation (co-IP)和免疫印迹分析。两个HA-tagged HAX-1和Flag-tagged PB1-F2转染细胞中表达;尤其是PB1-F2可以检测两种可溶性和不可溶性(P)细胞溶解产物(数字的分数2(一个))。在细胞溶解产物,HA-HAX-1 Flag-PB1-F2 coimmunoprecipitated,发现在这两种抗体,表明HAX-1与PB1-F2 cotransfected细胞(图所示2 (b))。

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与HAX-1 PB1-F2互动。HEK293T细胞转染pRK5-Flag-PB1-F2或pRK5-HA-HAX-1。NP-40可溶性分数(S)和不溶性颗粒(P)的细胞溶解产物受到免疫印迹分析anti-Flag或anti-HA抗体检测PB1-F2或HAX-1的表情。(一)只有HAX-1表达的可溶性部分进行了测试。(b) Coimmunoprecipitation PB1-F2 HAX-1。HEK293T细胞模拟转染或转染pRK5-Flag-PB1-F2和pRK5-HA-HAX-1。细胞溶解产物是准备和孵化与anti-Flag(左)或anti-HA(右)抗体和免疫沉淀反应,从而受到免疫印迹分析anti-HA(左)或anti-Flag抗体(右)。
3.3。降低病毒复制在HAX-1击倒A549细胞

检查HAX-1在流感病毒感染的作用,生成HAX-1击倒A549细胞株(HAX-1kd)。如图3(一个),HAX-1 HAX-1显著降低kd细胞系A549细胞株的感染比较慢病毒载体表达争夺成分(HAX-1wt)和正常的A549细胞。具体来说,信使rna HAX-1 HAX-1下降了75%kd细胞比HAX-1wt细胞。两国HAX-1kd细胞系,我们拿起一个用shRNA2击倒效率较高的后续实验。

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图3
HAX-1提升H9N2流感病毒复制的肺上皮细胞。()一代的人类肺上皮细胞系A549细胞与降低HAX-1表达式通过shRNA击倒。这些细胞被感染了慢病毒和shRNA-expressing细胞选择压力嘌呤霉素,和HAX-1击倒细胞系(shRNA1和shRNA2)被证实,相比争夺的细胞成分(争夺)或细胞转导(−),与实时rt - pcr HAX-1 mRNA转录水平。可拆卸的细胞中表达HAX-1也是免疫印迹分析所示。(罪犯)流感病毒复制减少HAX-1击倒的细胞。HAX-1击倒和控制A549细胞感染H9N2病毒莫伊的0.01,0.1,1.0,和文化媒介中滴定MDCK细胞空斑实验。滴定与重复执行,平均滴度展出。

接下来,我们检查了H9N2病毒复制在不同莫伊从0.01到1.0,HAX-1wt和HAX-1kd细胞。文化传媒在不同时间点的收获12日,24日,36,48小时pi和空斑实验。如数据所示3 (b)- - - - - -3 (d)在HAX-1,降低感染性病毒滴度检测kd细胞,明显的细胞感染剂量,特别是当莫伊的感染0.01。这个结果表明HAX-1至关重要,可能扮演重要的角色在促进AIV H9N2病毒复制人类肺上皮细胞。

3.4。n端PB1-F2与HAX-1的线粒体

为了确定残留生化反应与HAX-1 PB1-F2交互,我们生成的截断PB1-F2的碎片。这些片段包括60只包含一个n端氨基酸,PB1-F2ΔC30,和另一个删除第一个29 n端氨基酸,PB1-F2ΔN29。与截断cotransformed酵母PB1-F2碎片和HAX-1 PB1-F2ΔC30能够与HAX-1交互,但PB1-F2ΔN29失败(图4(一)),这表明氨基29氨基酸与HAX-1 PB1-F2参与其交互。自PB1-F2线粒体靶向序列(MTS)是一种两亲的α螺旋的羧基末端(27),交互PB1-F2的n端HAX-1不会干扰其走私和易位在病毒感染线粒体。

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图4
分子的n端PB1-F2与HAX-1互动是至关重要的。(一)交互PB1-F2和HAX-1酵母细胞。酵母细胞与pGBKT7-PB1-F2 cotransformed表达一个完整的长度为1 - 90残留物和一段氨基1-60残留或30 - 90 c端残留,连同pGADT7-HAX-1(完整)。一周后,越来越多的克隆在每个SD /辍学板块在X -传播和验证α加/ SD /辍学盘子。克隆生成蓝色显示的良性互动,而白色表明负作用。(b) Colocalization PB1-F2和HAX-1 A549细胞的线粒体。A549细胞转染空载体(图中未显示)或转染质粒表达HAX-1或/和PB1-F2 24小时,与相应抗体进行免疫荧光染色。细胞与MitoTracker costained(中间和底部面板)。

评估与HAX-1 PB1-F2 H9N2病毒是否与身体的细胞,我们cotransfected pcDNA3.1-Flag-PB1-F2和pcDNA3.1-HA-HAX-1 A549细胞。在转染后24小时,HAX-1和PB1-F2都分布在细胞质中,似乎有相似和重叠分布,表明HAX-1和PB1-F2与(图4 (b))。此外,我们的数据表明,HAX-1和PB1-F2都与线粒体的如图所示的Mitotracker cotransfected细胞,这表明HAX-1和PB1-F2最有可能本地化在线粒体(图4 (b))。

3.5。HAX-1 PB1-F2引起的减毒Caspase-9活动

调查的生物意义HAX-1 PB1-F2交互,我们用质粒转染A549细胞表达HAX-1, PB1-F2,或两者兼而有之,caspase-9酶活动测量在转染细胞的溶解产物准备16小时后转染。表达式仅PB1-F2 caspase-9活动增强,而HAX-1似乎有什么影响活动时表示。与,然而,当这些细胞被cotransfected caspase-9活动增加了PB1-F2减少,表明HAX-1减毒proapoptotic PB1-F2活动在肺上皮细胞(图5(一个))。

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图5
衰减的PB1-F2-induced caspase-9 HAX-1激活。(一)Caspase-9活动被HAX-1在转染抑制肺上皮细胞。A549细胞转染质粒表达要么PB1-F2, HAX-1,或者两者兼有,而酶活动的caspase-9细胞溶解产物测定孵化与底物的溶解产物LEHD-pNA在37°C为比色发展2小时。半胱天冬酶活动计算和表示为相对的褶皱变化对控制空白质粒转染。表达水平HAX-1和PB1-F2免疫印迹分析所示。(b)抑制激活caspase-9 HAX-1击倒细胞感染H9N2病毒。HAX-1击倒或争夺控制细胞感染H9N2病毒(wt)。caspase-9酶活动的细胞溶解产物测定孵化与底物的溶解产物LEHD-pNA比色发展。进行了一式三份,平均数±标准差的值被显示(学生的t以及, 和 ;ns:没有意义)。

接下来,我们检查了HAX-1 caspase-9活动wt细胞或HAX-1kd当感染H9N2病毒细胞。在HAX-1 caspase-9活动显著增加kd细胞在8小时pi但更高caspase-9 HAX-1观察活动wt细胞24小时淠。(图5 (b))。这些数据表明细胞凋亡是更积极地激活没有HAX-1, PB1-F2引起的可能,在感染的早期阶段。因此,减少病毒产生,导致细胞凋亡的减少后期的感染(24小时皮)。

3.6。在感染HAX-1 HAX-1缺乏对细胞凋亡的影响kd细胞

如图5 (b)在HAX-1 caspase-9的活动kd细胞在HAX-1高于wt细胞在8小时pi H9N2引起的感染,这表明一个更强的激活感染细胞的凋亡。评估的激活细胞凋亡没有HAX-1,我们HAX-1感染kd和HAX-1wt细胞与病毒H9N2 (wt)的莫伊1和分析caspase-9的乳沟地位和caspase-3过程中感染。如数据所示6(一)和6 (b),更裂解/激活caspase-9 (p37亚基裂解Asp330)在HAX-1产生kd细胞在HAX-1相比wt细胞在8小时pi和裂解caspase-3似乎出席16小时在HAX-1 pikd细胞。然而,还似乎是相反的激活在感染的后期阶段:24小时皮。,a lower amount of cleaved caspase-9 (p35 subunit cleaved at Asp315) and cleaved caspase-3 was observed in HAX-1kd细胞比HAX-1wt细胞。此外,细胞色素c的释放到胞质HAX-1增加kd细胞在HAX-1相比wt,表明增加caspase-9激活可能与更高水平的细胞色素c细胞溶质在缺乏HAX-1(图6 (c))。

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图6
早期卵裂和激活的caspase-9 HAX-1击倒肺上皮细胞感染H9N2病毒。增加半胱天冬酶裂解和激活在感染的早期阶段HAX-1击倒的细胞。HAX-1击倒(HAX-1kd)和控制(争夺)(HAX-1wt)细胞被感染H9N2病毒,总细胞溶解产物进行了分析通过免疫印迹分析anti-cleaved caspase-9 (a)和caspase-3 (b)抗体。的胞质部分溶解产物也进行免疫印迹分析anti-cytochrome c抗体(c)。

4所示。讨论

目前尚不清楚是否PB1-F2毒性因素,如果是这样,是什么导致了流感病毒感染的机制。在这项研究中,我们研究了底层机制PB1-F2-induced凋亡调控在AIV H9N2病毒感染人类的肺上皮细胞。PB1-F2许多流感病毒株是一种非结构蛋白编码(6]。它被认为是一个线粒体蛋白促进细胞凋亡在感染免疫细胞(5]。HEK293T A549细胞,PB1-F2 colocalizes和抗病毒信号结合线粒体蛋白质(小牛)通过其糖基,从而抑制MAVS-mediated I型干扰素的合成,降低线粒体膜电位(28,29日]。此外,PB1-F2结合其他线粒体组件,包括通道Tom40 nucleotide-binding寡聚化域受体X1 (NLRX1)和P3 (NLRP3),和损害宿主先天免疫(30.- - - - - -33]。PB1-F2诱导细胞凋亡通过激活procaspase-9激活如图所示在这项研究中,最初是在免疫细胞识别。PB1-F2-activated凋亡可能抑制流感病毒复制自细胞死亡发生在感染的早期阶段会缩短宿主细胞生存,导致降低病毒复制。因此,我们假定PB1-F2-induced细胞凋亡可能是由一个未知的机制在流感病毒感染细胞。在这项研究中,我们发现PB1-F2与HAX-1互动,这可能会抑制其活化mitochondria-mediated procaspase-9激活。

使用PB1-F2-deficient H9N2病毒在这项研究中,我们发现,抑制病毒复制,证明PB1-F2是病毒复制的关键在肺上皮细胞,这可能是由于它对病毒RNA聚合酶活动的重要性(34]。研究也表明,PB1-F2抑制干扰素的早期感应有牵连,导致病毒毒力和发病机理在活的有机体内(35,36),虽然PB1-F2可以,相比之下,加剧干扰素诱导的相反NS1感染肺上皮细胞(37]。

HAX-1已知与造血谱系特异性蛋白1 (HCLS-1), Src家庭酪氨酸激酶的底物(铃木et al ., 1997)。HAX-1老鼠和人类的存在于许多组织(38),首次观察到与HCLS-1交互,和参与B细胞的发展39,40]。HAX-1参与antiapoptosis通过抑制procaspase-9过程(41]。HAX-1和PB1-F2可能的相互作用提供了一个新颖的机制为PB1-F2受细胞蛋白质H9N2 AIV-infected肺上皮细胞。自通过绑定procaspase-9 HAX-1是抑制细胞凋亡,HAX-1协会和PB1-F2感染可能削减从激活procaspase-9 PB1-F2,导致caspase-9激活降低。这个假说是由我们的观察caspase-9活动引起PB1-F2可以减毒的超表达HAX-1 cotransfected细胞(图所示5)。我们还显示,当HAX-1减少shRNA击倒肺上皮细胞,激活procaspase-9 8小时后感染,早些时候开始,然而,只有实现更晚(24小时)在正常细胞(图6)。这个结果表明HAX-1在调节细胞凋亡过程中发挥作用的早期感染PB1-F2的存在。我们的研究进一步证实,HAX-1 AIV至关重要H9N2复制人类肺上皮细胞。在HAX-1击倒肺上皮细胞,病毒复制在较低浓度比正常细胞(图3),这表明HAX-1促进流感病毒复制。可能,HAX-1可以维持细胞的存在与延迟凋亡过程可行,这可能是有利于病毒复制。HAX-1击倒细胞的减少时,更早地开始procaspase-9激活(在8小时p。)将促进细胞过早死亡和产生更少的子代病毒(数据3和6)。

我们的研究表明,HAX-1可能发挥有益作用在流感病毒复制的调节肺上皮细胞。HAX-1 bcl - 2有两个同族体域和最初认为函数通过其协会内线粒体膜菱形蛋白酶PARL proteolytically激活Omi / HtrA2凋亡丝氨酸蛋白酶,消除活跃proapoptotic伯灵顿从外膜42]。然而,这不是人类肺上皮细胞在这项研究中观察到。因此,我们建议HAX-1可能在病毒复制发挥有益的作用,延长细胞存活,抑制细胞凋亡。这个函数可能取决于细胞类型或特定的病毒亚型。最近的一份报告显示,HAX-1结合PA,流感病毒RNA聚合酶的亚基复杂,阻碍了其核易位和病毒复制(43]。尽管巴勒斯坦权力机构之间的序列是守恒的H1N1(/网络/ 1933)43)和使用的H9N2病毒在这项研究中,只有59%的序列在PB1-F2身份,和PB1-F2不同亚型流感病毒可能不同样与HAX-1交互。HAX-1协会与PA或PB1-F2或两个可能是病毒株或subtype-specific,这可能会导致不同的后果。

尽管PB1-F2报道在感染细胞凋亡的促进因素(5,12,18),它被认为是无法在上皮细胞在诱导细胞凋亡早期研究[5]。然而,我们发现,PB1-F2 H9N2病毒可能会增加caspase-9活动(图5),凋亡细胞被感染时减少变异H9N2(ΔPB1-F2)病毒至少在早期阶段(图1 (d))在人类肺上皮细胞。的确,流感病毒的序列和结构变量,和许多流感病毒株只有拥有截断和功能失调的PB1-F2,其中大流行性H1N1病毒(2009年)是模范。变量PB1-F2功能可能观察到不同的病毒感染。事实上,PB1-F2甚至可有可无的一些病毒株病毒毒力和发病机理,包括许多H1N1病毒。

总之,我们发现在人类肺上皮细胞,PB1-F2的H9N2 AIV对病毒复制至关重要但也能导致细胞凋亡。PB1-F2-induced细胞凋亡,这可能是抑制病毒复制,由HAX-1监管,大量蛋白质,导致减少procaspase-9激活和细胞凋亡。HAX-1促进流感病毒复制的肺上皮细胞可能通过一种机制包括抑制细胞凋亡,促进伯灵顿表达式(数据未显示)。PB1-F2可能是毒性因子也可有可无的取决于流感病毒株。PB1-F2不同病毒的比较研究在不同组织类型和物种的进一步阐明其功能和精确的角色在病毒的发病机理,在鸟类和人类。

伦理批准

没有人体或动物被用于这项研究。这篇文章不包含任何与人类参与者或动物研究由作者。

的利益冲突

所有作者声明没有利益冲突。

作者的贡献

李娜和郑洁雪兴的构思和设计实验。雪,瞿Bingqian、Ganlin他和郑兴做了实验。雪,瞿Bingqian,卡罗尔·j·卡多纳·和郑兴分析数据。雪,瞿Bingqian,卡罗尔·j·卡多纳·Yongchun歌,和郑兴写道。雪和李Bingqian瞿了同样工作。

确认

这项研究得到了明尼苏达州农业部奖(学院人工智能的响应;奖号。con000000058786 - 00056110和00056110)郑邢和卡罗尔·j·卡多纳·和由中国国家自然科学基金(批准号81571993)郑兴。作者感谢林叮海德堡大学,德国提供的质粒表达HAX-1 MitoTrack试剂。