文摘
食管鳞状细胞癌是最常见的鳞状细胞癌。葡萄籽提取物原花青素是被认为具有抗癌活性对几种不同类型的癌症。我们旨在确定花青素抑制食管鳞癌细胞和NF -参与的可能性κ在这个过程中。人类食管鳞癌细胞线ECA109对待花青素(0 - 80μg / mL)和bay11 - 7082 (10μmol / L) 12、24、48 h。MTT分析是用于确定细胞增殖;改变在细胞凋亡的检测是通过流式细胞术;水平的炎症因子白细胞介素- 6和cyclooxygenase-2和凋亡蛋白伯灵顿/ bcl - 2通过ELISA测定;存在和西方的屁股被用来检查caspase-3和NF -的激活κB信号。花青素抑制ECA109细胞的增殖和诱导细胞凋亡以时间和剂量依赖性的方式。ELISA结果表明,花青素和bay11 - 7082降低炎性细胞因子的分泌白细胞介素- 6和cyclooxygenase-2。聚合酶链反应和免疫印迹结果表明,花青素和bay11 - 7082激活caspase-3和减毒NF -的激活κB信号通路。花青素ECA109细胞诱导细胞凋亡和抑制ECA109细胞增殖通过减少炎性细胞因子的分泌。这种机制可能与NF -的衰减κB活动和caspase-3的敏化作用。
1。介绍
食管癌癌(EC),最常见的癌症之一,是由食管恶性转变引起的。这是第六恶性癌症死亡的主要原因,和最常见的病理类型是食管鳞状细胞癌(ESCC)。新疆哈萨克地区、中国电子商务是一项高风险地区。尽管进步在理解癌症恶化的机制和不同的治疗策略的发展,电子商务仍然是死亡率在恶性肿瘤死亡的主要原因在新疆哈萨克族人口,特别是由于转移(1]。
慢性食管炎是最重要的因素之一,对食道癌的发生。墨菲等人发现non-Barrett食管炎ESCC的风险增加(2]。张等人报道,当地领导的炎症细胞浸润的中断和删除本地在食管鳞状上皮细胞基底膜(3促进细胞增殖和诱导EC)。核转录因子(NF -κBκB),一个转录因子在炎症中起着重要的作用,参与了慢性食管炎的进展(4]。NF -κB参与细胞增殖(5),细胞骨架改建计划(6),细胞入侵(7),和细胞凋亡8]。研究发现,NF -κB是一个关键因素发展的各种恶性癌、肝癌等(9],结肠癌[10],和乳腺癌[11]。然而,NF -之间的直接连接κB信号和EC较不确定。
原花青素(pc)的一类多酚类化合物,是植物中普遍存在,主要在表皮和种子。我们先前的研究确定,电脑减少氧化损伤和炎症(12,13]。最近的研究证明了电脑的抗癌的活动(14),在各种癌症细胞系(肝细胞毒性影响报告(15),结肠(16],乳腺癌[17),食管(18]),主要是通过介导的细胞凋亡和没有不良生物对正常细胞的影响。虽然这是发现电脑可以诱导癌细胞凋亡,NF -的作用κB在EC的逆转,以及机制,仍不清楚。因此,我们进行了本研究确定花青素食道癌细胞诱导凋亡和NF -检查任何可能的参与κ在这个过程中。
2。材料和方法
2.1。试剂
花青素(≥95.0%)是来自JF-Natural公司(天津)。湾11 - 7082和抗体IKK, caspase-3, NF -κB (p65)由Abcam(英国剑桥),我和抗体κB, phospho-IκB (》κB)和NF -κB (p100 / p50)从细胞信号技术有限公司采购(丹弗斯,MA)。抗体GAPDH买来Goodhere生物科技(杭州)。杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)、青霉素、链霉素、胎牛血清(的边后卫)和胰蛋白酶/ EDTA买来HyClone(犹他州洛根)。5-Dimethylthiazol-2-yl 3 - (4) 3, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT)从建成生物技术有限公司(南京,中国)。的膜联蛋白V-FITC /π凋亡装备采购从Multisciences(杭州)。ELISA试剂盒对il - 6和cox - 2从Elabscience购买(武汉,中国)。
2.2。细胞培养
人类食管鳞状ECA109细胞病理学系提供的请重点实验室新疆流行和民族疾病,石河子大学医学院(中国新疆)。所有细胞单层培养在DMEM补充90%与10%的边后卫和1%青霉素和链霉素37°C在湿润的气氛中5%的有限公司2。媒介是改变了每隔一天。
2.3。细胞生存能力分析
MTT试验被用来衡量ECA109细胞的可行性。这些细胞被镀成96 -孔板的密度2000细胞/在200年μL DMEM。孵化后37°C一夜之间,花青素(0 - 400μg / mL)被加入到细胞12、24、48小时。每个治疗和时间点化验一式三份。经过规定的治疗时间和花青素,MTT细胞4 h。随后,上层的丢弃,甲瓒沉淀于150年解散μL二甲亚砜(DMSO)。自动微型板块使用分光光度计测量光密度(OD)为每个。检测波长为490 nm和参考波长为620 nm。
2.4。膜联蛋白V-FITC / PI染色
ECA109细胞凋亡测定使用膜联蛋白V-FITC /π凋亡工具包。治疗后与花青素(0、25、50、80μ24 h g / mL),这些细胞被收集和清洗两次冷PBS。随后,1×106细胞悬浮在绑定缓冲,沾膜联蛋白V-FITC和π,利用流式细胞术和分析。
2.5。细胞迁移试验
花青素在ECA109迁移的影响通过使用细胞划痕试验进行了分析。细胞被镀成6-well板的密度5×106细胞/在2毫升DMEM补充10%的边后卫。细胞被允许遵循,挠吸管技巧,对待花青素(0、25、50、80μg / mL) 24 h。每个治疗化验一式三份。孵化后37°C一夜之间,这些细胞被使用一个倒置显微镜观察。
2.6。细胞入侵检测
Transwell细胞入侵检测。简单地说,参议院Millicell细胞培养插入涂有50μL人工基底膜稀释1:8与PBS。随后,4×105ECA109细胞在无血清DMEM 0.4毫升、有或没有花青素,添加到参议院。众议院充满了0.6毫升DMEM补充与20%的边后卫化学引诱物诱导入侵。在37°C孵化后24 h,文化插入被移除和非侵入性细胞的上表面文化利用棉拭子插入被移除。通过基底膜基质细胞入侵和甲醇为30分钟和固定沾0.1%结晶紫为10分钟20°C。利用光学显微镜图像被抓获。
2.7。ELISA
简而言之,这些细胞被培养与花青素(0、25、50、80μg / mL)和花青素(0、25、50和80μg / mL) + bay11 - 7082 (10μmol / L) 12、24、48 h。来自实验文化的上层清液被收集并存储在−80°C到使用。上层清液中的il - 6水平和cox - 2的测定采用细胞因子检测ELISA包按照制造商的指示;检测在450 nm使用微型板块是由读者。伯灵顿的浓度和bcl - 2细胞培养上清液是由使用伯灵顿和bcl - 2检测酶联免疫试剂盒。
rt - pcr进行评估的mRNA表达caspase-3、IKK, NF -κB (p50)和NF -κ治疗后B (p65)与花青素(0、25、50、80μg / mL)和花青素(0、25、50和80μg / mL) + bay11 - 7082 (10μ摩尔24 h / L),如前所述[19]。设计引物如表所示1。
2.8。免疫印迹分析
ECA109细胞治疗与花青素(0、25、50、80μg / mL)和花青素(0、25、50和80μg / mL) + bay11 - 7082 (10μmol / L) 24 h。治疗后,细胞与PBS收集和清洗三次。收获细胞细胞溶解在冰100毫升30分钟的裂解缓冲。总蛋白被使用布拉德福德收集和量化分析。分离蛋白转移到硝化纤维膜,第一次孵化caspase-3抗体、IKK phospho-IκB,我κB, NF -κNF - B (p50)κB (p65), GAPDH,然后用二次孵化anti-mouse或anti-rabbit抗体。免疫印迹的研究都是重复三次。
2.9。统计分析
所有的值表示为平均值±标准偏差(SD),并通过使用SPSS 20.0分析计算。免疫印迹分析计算通过使用Image-Pro +软件。意味着在多个组的比较进行了方差分析。组间两两比较进行最少的显著差异(LSD)测试。预先计划的或先天的对比规定的主要假设,0.05或0.01的显著性水平被认为是显示统计学意义。
3所示。结果
3.1。花青素抑制ECA109细胞的生存
花青素对ECA109细胞生存,施加一个明显的抑制作用,如图1。较高的花青素剂量ECA109细胞导致更强的抑制作用;同样,一个更高的应用程序时间具体花青素剂量明显减少ECA109细胞的存活率( )。花青素有大量的时间和剂量依赖性抑制作用ECA109细胞。通过集成电路的计算50花青素的应用不同的时间后,我们选择治疗剂量的花青素25、50和80μ克/毫升(表2)。此外,我们的研究结果表明,ECA109的存活率是下降了的花青素干预24小时和48 h,但是差异没有统计学意义。
3.2。花青素在ECA109细胞诱导细胞凋亡
我们使用流式细胞仪确定花青素ECA109细胞的细胞凋亡的影响。花青素浓度之间的25、50和80μg / mL, ECA109凋亡细胞的比例从34.0%上升到76.3%,每组之间的差异具有统计学意义( )。在这个实验中,我们使用FITC和π双重染色。直方图,第一象限代表了细胞凋亡晚期和第二象限代表了早期凋亡细胞。我们发现花青素的应用(25 - 80μg / mL) 24 h增加的百分比ECA109细胞早期凋亡和细胞凋亡(年末 );此外,存在剂量依赖的相关性被发现(图的关系2)。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
3.3。花青素抑制ECA109细胞迁移
基于MTT和流式细胞仪检测的结果,我们观察到的变化花青素治疗24小时后细胞迁移能力。25μg / mL花青素,细胞迁移距离的变化没有明显的价格相比控制,但在50和80μg / mL,距离明显缩短(图3)。
3.4。花青素+ bay11 - 7082抑制ECA109细胞的入侵
与对照组相比,花青素的应用(25、50和80μg / mL)细胞的数量减少,通过(数字4(一)- - - - - -4 (d))。建议ECA109细胞的抑制作用与增加花青素的浓度升高,而ECA109细胞的侵入性能力下降。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(我)
同步应用程序后花青素(0、25、50、80μ和10 g / mL)μmol / L bay11 Transwell室- 7082,24小时后观察培养细胞(数字4 (e)- - - - - -4 (h))。与对照组相比,所有的花青素浓度+ bay11 - 7082抑制细胞运动通过Transwell钱伯斯(图4(我))。
3.5。花青素和bay11 - 7082抑制炎性细胞因子水平ECA109细胞
在缺乏花青素,高水平的il - 6的分泌和cox - 2在ECA109观察细胞。的花青素,il - 6的分泌和细胞抑制cox - 2;花青素剂量的增加导致更明显抑制( )(数据5(一个)和5 (b))。另外,我们观察到相同的花青素的作用剂量申请不同时期对il - 6的分泌和cox - 2,发现强抑制发生在相同的花青素剂量应用长时间( )。il - 6的浓度的测量和cox - 2在ECA109细胞治疗后花青素+ bay11 - 7082表明,花青素+ bay11 - 7082可以在ECA109抑制炎性细胞因子的分泌细胞;此外,花青素+ bay11 - 7082的抑制作用强于花青素所造成的治疗(数据5 (c)和5 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.6。花青素和bay11 - 7082提升伯灵顿和bcl - 2抑制的活动
我们调查的影响,不同时间和不同剂量的花青素与对照组相比。伯灵顿的蛋白质含量增加和bcl - 2蛋白水平的降低;时间和剂量依赖性关系观察数据6(一)和6 (b))。同样的变化被发现在不同浓度的花青素和10μ摩尔/毫升bay11 - 7082同时应用(数字6 (c)和6 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.7。花青素和bay11 - 7082 Caspase-3激活
我们检查了花青素的影响和bay11 - 7082的mRNA和蛋白表达caspase-3利用PCR和免疫印迹,分别。在未经处理的ECA109细胞信使rna和蛋白质的表达caspase-3发生在一个相对较低的水平。增加剂量的花青素以及bay11 - 7082, caspase-3信使rna和蛋白质的表达水平增加(数据7(一)和7 (b))。这表明花青素和bay11 - 7082提升ECA109细胞的凋亡通过caspase-3的激活。
(一)
(b)
3.8。花青素和bay11 - 7082抑制NF -κB通路
NF -的重要作用κB在调节细胞因子和细胞凋亡的诱导,我们研究了影响花青素和bay11 - 7082的转录因子。我们用免疫印迹检测蛋白表达水平的各种经典的因素,包括IKK,我κB,》κB p50 p65, NF -κB通路。
没有任何治疗干预,我们观察到各种转录因子的蛋白表达在ECA109细胞处于高水平,这表明NF -的激活κB在食道癌细胞信号通路。然而,IKK的mRNA和蛋白表达水平,我κB,》κB, p65治疗后下降了25岁,50和80μg / mL 24 h,而mRNA和蛋白表达水平的p50 p65增加(数据8和9)。也发现类似的结果时,花青素和bay11 - 7082同时应用于ECA109细胞。然而,我们发现单独治疗bay11 - 7082并没有导致减少IKK mRNA水平(图8(一个))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
4所示。讨论
食管癌是最常见的恶性肿瘤之一。EC的发病率在新疆哈萨克族人口,中国正在增加。临床操作是最常见的治疗这种疾病,但复发率高由于EC的转移率高20.]。因此,有必要探索有效的天然植物药物和分子治疗靶点,从而诱导细胞凋亡和抑制细胞迁移和转移的机制。在这项研究中,确定ECA109细胞的存活率在不同浓度的花青素。花青素被发现抑制ECA109的扩散;随着剂量的增加,一个更强大的效果观察食管癌细胞的迁移和入侵。这些抑制效应,伴随着炎症因素如il - 6的分泌减少,CRP, cox - 2,和前列腺素E2 (PGE2);伯灵顿激活;bcl - 2抑制;caspase-3的激活;和抑制NF -κB通路。
il - 6,类似于许多炎症因素,核心是增加了大量肿瘤细胞的炎性微环境;通过c反应蛋白的诱导发生这种情况,这激活了NF -κB通路减少caspase-3的活动和抑制肿瘤细胞的凋亡21]。相比之下,细胞外基质降解酶的激活可以促进肿瘤细胞的迁移和入侵17]。在这项研究中,花青素的分泌减少炎性细胞因子(il - 6和cox - 2)在细胞,引起的抑制增长,ECA109细胞增殖,迁移和入侵。高水平的il - 6和cox - 2与经济增长密切相关19),移民(22],[入侵23的癌细胞。cox - 2的病原反应酶被认为是花生四烯酸转化为前列腺素E2 (PGE2),通常表现在组织损伤或炎症反应。体外实验表明cox - 2在食管癌中表达的高度24),肝癌25),和子宫内膜癌26)和cox - 2高水平导致更高的细胞增殖。cox - 2的相关分析和伯灵顿在癌细胞的肾癌患者,发现了一个负相关。相信通过抑制cox - 2促进癌细胞的扩散的伯灵顿活动(27]。因此,我们假设花青素ECA109细胞诱导凋亡caspase-3通过激活和抑制伯灵顿通过抑制炎性细胞因子的表达。这是确认的测量caspase-3的mRNA和蛋白水平。
NF -κB信号通路参与了多种恶性肿瘤的发生和发展(28]。NF -κB产生凋亡活动主要是通过影响各种炎性因子的表达,如il - 6和cox - 2,和效应器,如伯灵顿/ bcl - 2和caspase-3。研究发现,花青素显著抑制蛋白质的表达》κ我在ECA109细胞,显著提升κB mRNA和蛋白表达,暗示花青素抑制NF -κ我可能主要通过抑制κB磷酸化。Terra等人用原花青素B1和C1干扰LPS-induced巨噬细胞,发现原花青素抑制NF -的激活κB通路通过抑制我的磷酸化κB (29日]。然而,赵等人发现花青素抑制κ在人类卵巢癌A2780 B细胞,抑制NF -κ随后B途径和促进细胞凋亡(15]。花青素的影响的基础上,我们还调查了NF -的治疗κB-specific抑制剂bay11 - 7082,发现花青素+ bay11 - 7082是一个更有效的抑制剂的磷酸化水平的我κB与花青素。这表明,抑制NF -κB花青素是通过我的抑制κB磷酸化;类似的效果发生bay11 - 7082,表明花青素和bay11 - 7082可能对NF -协同抑制作用κB在ECA109细胞。
此外,我们发现花青素抑制NF -的表达κB p50 / p65信使rna和蛋白质在细胞。NF -κB p50 / p65, NF -最常见的异质二聚体κB信号通路,也是一个重要的蛋白质的功能NF -κ在休眠细胞,NF -κB p50 / p65和我κB形成复合物,以非活性的形式存在于细胞质中。当细胞是由一个细胞外刺激信号,我κB激酶复杂(IKK)激活我的磷酸化κNF - BκB是暴露于核本地化网站。分离NF -κB是迅速转移到细胞核,绑定到一个特定的κB序列和诱导相关基因的转录。花青素抑制NF -κB p50 / p65引起我的抑制κB磷酸化的花青素,这是符合Mackenzie等的研究。30.]。一些研究表明,原花青素抑制NF -的能力κB p50 / p65表达抑制可能产生的原花青素二聚体的外观模仿NF -精氨酸残基的κB p50 / p65序列,氢键,抑制p50 / p65[的表达31日]。然而,我们的研究并没有表明是否花青素的化学结构与NF -的表达κB p50 / p65。
此外,我们发现IKK的mRNA和蛋白表达均抑制花青素。然而,没有明显区别花青素组和花青素+ bay11 - 7082组。bay11 - 7082,特定抑制剂的NF -κB,抑制我的磷酸化κb .因此,我们的研究结果还表明,花青素可能直接影响IKK,抑制IKK的激活和抑制我的磷酸化κB;在一起,这可以抑制NF -κB通路。
一般来说,NF -κB信号通路中起着重要作用的抑制花青素ECA109细胞的生长。花青素促进凋亡蛋白的激活伯灵顿,通过抑制NF - caspase-3κB通路的激活和抑制凋亡蛋白质和炎性细胞因子的表达,从而抑制增殖,迁移和入侵ECA109细胞系的诱导细胞凋亡(图10)。
5。结论
我们的研究说明了花青素的作用的可能的分子机制与癌症;然而,癌症的发生与发展和癌症细胞的迁移和入侵是复杂的,涉及到多种因素。因此,具体机制需要广泛的研究探讨原花青素和提供一个基础的抗癌效果的有效使用。结果和讨论可能单独提出,或在一个部分相结合,可以被分成部分。
数据可用性
使用的数据集或分析在当前研究可从相应的作者以合理的要求。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
这项研究得到了国家自然科学基金(81760584和81760584号),中国科学技术研究项目的关键领域的新疆生产建设兵团(没有。2014 ba039也没有。2015 ag014),石河子大学的国际合作项目(没有。GJHZ201602)。