文摘

六十雄性Wistar鼠被美联储控制或ethanol-containing饮食组C或大肠脂肪成分调整与25%或57%鱼油代替橄榄油组CF25 CF57 EF25, EF57。肝硫代巴比土acid-reactive物质(TBARS)水平,细胞色素P450 2 e1蛋白表达和肿瘤坏死因子(TNF)α白介素- 1 (IL)β、il - 6和il - 10的水平,以及细胞粘附分子(ICAM) 1水平明显升高,而血浆脂联素水平在E组显著降低( )。肝组织病理学的脂肪变性和炎症,在E组明显高于C组( )。肝TBARS、等离子ICAM-1和肝肿瘤坏死因子-α,il - 1βil - 10水平明显下降,血浆脂联素水平明显高于在团体EF25和EF57比E组( )。肠道紧密连接蛋白的免疫反应性的区域,ZO-1显示组只C和e组之间没有改变CF57显示更高ZO-1免疫反应性的面积与C组相比( )。25%或57%鱼油代替食用橄榄油可以防止ethanol-induced在大鼠肝损伤,但相关机制可能不是肠道紧密连接ZO-1表达式。

1。介绍

过度或慢性饮酒会导致肝损伤通过各种致病机制。酒精诱发肝损伤的三个主要类型包括脂肪肝、肝炎、肝硬化(1]。饮酒导致的肝损伤和NADH / NAD增加相关+比率,促进脂肪酸在肝细胞合成和脂质积累,CYP2E1的增加引起的氧化应激活动,增加内毒素水平触发枯氏细胞的激活和炎症过程2- - - - - -4]。然而,致病机制是复杂的,还不太清楚。

有一个新兴的理论,慢性乙醇滥用脱臼的紧密连接(TJ)肠上皮的结构,它允许从肠道细菌易位到体内循环从而诱导肝脏炎症(5]。观察表明,更高的内毒素水平在酒精性肝病(ALD)患者,似乎和肠漏的主要原因(6,7]。木糖醇,也被称为脂多糖(lps),来自革兰氏阴性细菌的细胞壁。肾上腺白质退化症患者可以预防动物研究还表明,当肠道微生物区系被抗生素(8- - - - - -10]。我们以前的研究也表明,表皮生长因子或synbiotics王亚南展出效果通过改善肠道通透性和微生物群在大鼠慢性乙醇喂养(11,12]。这些先前的研究结果有力地表明,肠道屏障干扰引起的酒精滥用在ALD内毒素的主要途径。

膳食脂肪的消费水平和类型可以影响ALD的肝损伤的进展。这是表明饮食富含饱和脂肪酸(美国)或碳链甘油三酯(mct)预防肝损伤大鼠和小鼠慢性乙醇喂养,但含有多不饱和脂肪酸的饮食(欧米伽)加重肝损伤引起的酒精摄入量(13- - - - - -15]。然而,有一些限制的先前的研究。首先,只有一种类型的脂肪是每个实验中使用的饮食。第二,影响其他器官或组织未检测到。

鱼油中含有丰富的二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA),这被称为n - 3欧。基于大多数研究鱼油(或n - 3欧米)被认为是有利影响,包括免疫调控、血管保护,和脂质代谢调制(16- - - - - -18]。然而,很少有研究探讨鱼油和退化的关系,特别是集中在肠道的完整性。根据我们之前的研究中,用鱼油代替橄榄油在乙醇暴露改善粪便微生物群组成;然而,影响肠道病变在ethanol-fed老鼠仍然不清楚。因此,我们假设鱼油可能王亚南在ethanol-fed老鼠通过维护肠道上皮屏障功能,进一步抑制内毒素在循环的出现。这种动物进行了调查研究提出假设。

2。材料和方法

2.1。动物

六十雄性Wistar鼠(8周,160 ~ 180 g)提供的BioLASCO台湾(台湾宜兰)适应在单独的笼子里22±2°C和50% ~ 70%湿度和12 h光/暗周期1周与一个标准的啮齿动物的饮食(LabDiet 5001啮齿动物的饮食;PMI营养国际,圣路易斯,密苏里州,美国)。机构台北医科大学动物保健和使用委员会批准所有程序在这个研究。

2.2。研究协议

老鼠被分为组根据他们的等离子体天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)活动后1周的适应,以确保没有显著差异在等离子体AST和ALT活动组间研究的开始。老鼠被喂食控制饮食或乙醇饮食,脂肪的成分的饮食调整为25%(7.1克鱼油/公斤饮食,总热量的6%)或57%(16.2克鱼油/公斤饮食,总热量的15%)鱼油代替橄榄油。因此,在这项研究中有六组:C(控制),CF25与25%鱼油(控制),CF57与57%鱼油(控制),E(乙醇),EF25(乙醇与25%鱼油),和EF57(乙醇与57%鱼油)。老鼠成群E、EF25 EF57被灌输了一种ethanol-containing液体饮食(35%的热量来自乙醇),从Lieber-DeCarli修改公式(19),而老鼠组C, CF25, CF57 pair-fed等能量的饮食没有乙醇用乙醇与麦芽糊精(卡路里16]。一克鱼油(VIVA omega - 3™),是由生命科学万岁(美国加利福尼亚州科斯塔梅萨)包含350毫克EPA和DHA 250毫克。单一不饱和脂肪酸(MUFA) / PUFA比率的饮食没有鱼油和鱼油替换25%和57%分别为0.4,0.7和1.5,分别16]。

8周后大鼠麻醉和牺牲。通过腹主动脉血液样本收集到heparin-containing管和离心1200 g×15分钟(在4°C);等离子体是收集和储存在−80°C到分析。肝组织迅速切除,一小部分肝脏标本被切断和固定在10%的甲醛溶液。剩下的肝组织存储在−80°C进行进一步分析。此外,空肠组织(中间部分的2厘米)的小肠切除和固定在10%甲醛溶液。

2.3。测量和分析方法
2.3.1。肝功能指标

肝损伤的最常用的指标是等离子体AST和ALT测量活动ADVIA®1800化学系统(德国西门子医疗诊断、埃施博恩)在这项研究中。

2.3.2。肝组织病理学检查

肝组织固定在10%甲醛溶液和嵌入在石蜡。石蜡切片是削减和苏木精和伊红染色())和三色的污渍。有经验的病理学家的实验数据进行了半定量的组织学评估肝脏标本根据组织损伤的程度,这是得分0 =没有规模,1 =跟踪,2 =温和,3 =中等,4 =严重。

2.3.3。肝脏抗氧化状态

(1)血浆和肝脂质过氧化作用。一克肝组织了4毫升的缓冲区包含0.25毫米phenylmethylsulfonyl氟化物,0.25毫米蔗糖,10毫米Tris-HCl (pH值7.4)均质和离心机在104在4°C g×15分钟。上层清液的肝匀浆和血浆脂质过氧化的示例分析了通过测量硫代巴比土acid-reactive物质的浓度(TBARSs)如前所述20.]。

(2)CYP2E1蛋白表达。微粒体的方法制备的肝组织是前面描述的19]。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page, 10%)用于分离微粒体蛋白(30μg),蛋白质是electroblotted到聚乙二烯二氟化物转移膜和膜分别孵化与鼠单克隆anti-rat CYP2E1(美国牛津大学生物医学研究,牛津,MI)或鼠标anti-actin单克隆抗体(美国Chemicon国际,泰梅库拉,CA),然后样本处理山羊anti-mouse免疫球蛋白g(免疫球蛋白)辣根过氧化物酶(合)(Chemicon国际)和发现与西方闪电工具包(美国PerkinElmer Lifesciences,波士顿,MA)。一个Image-Pro + 4.5软件分析被用来量化乐队。

2.3.4。炎症反应

(1)细胞因子测量。冰冷的缓冲区包含50毫米(1.5毫升)三(pH值7.2),150毫米氯化钠,Triton-X 1%, 0.1%蛋白酶抑制剂添加到肝组织(0.5克),然后冰均质和动摇了90分钟。均相溶液在3000×g离心机,4°C,持续15分钟。一个DuoSet®鼠TNF -α装备,鼠il - 1β/ IL-1F2工具包,鼠il - 6包,鼠il - 10箱(研发系统,明尼阿波利斯,美国)被用来分析上层清液根据化验设备指令。标仪(美国分子器件、桑尼维尔CA)是用于读取光密度(OD) 450海里所有的细胞因子。

(2)血浆脂联素浓度。酶联免疫吸附试验(ELISA)工具包(AssayMax鼠脂联素酶联免疫试剂盒Assaypro,圣查尔斯,密苏里州,美国)被用来测量血浆脂联素浓度。细胞因子的OD是一样的测量。

(3)细胞粘附分子测量。等离子体VCAM-1 ICAM-1水平,分别确定一只老鼠ICAM-1 / CD54 Quantikine酶联免疫试剂盒(研发系统,明尼阿波利斯,美国)和细胞粘附分子1分析工具包(USCN生命科学,武汉,中国)。程序遵循制造商的指示。细胞因子的OD是一样的测量。

2.3.5。小肠组织病理学检查

(1)圆)染料染色。中间部分空肠组织(2厘米)固定在10%甲醛和嵌入石蜡。石蜡切片切和圆)染料染色。半定量的组织学评估是由一位训练有素的病理学家盲治疗组和视觉评估组织损伤的程度,根据赵的分数小肠损伤的分类21]。评分范围0 ~ 5元等描述的一样。22]。

(2)ZO-1 TJ蛋白免疫组织化学染色。ZO-1免疫组织化学的方法(包含IHC)染色是前面描述的23]。组织部分是deparaffinized和孵化主要抗体ZO-1 (Abcam 1: 300年,剑桥,英国)一夜之间在4°C,其次是孵化与生物素化的二次抗体(日本Chemi-Con 1: 300年,东京,日本)在室温下1 h。实施后的反应peroxidase-linked avidin-biotin复杂(向量)在室温下1 h, diaminobenzidine解决方案工具包(向量)是用于检测ZO-1免疫反应性。“数量/尺寸”和“区域”命令是用来确定强度ZO-1免疫反应性。

(3)血浆内毒素水平。血浆内毒素水平测量使用鲎变形细胞溶解产物工具包(Associates的科德角,东法尔茅斯,妈,美国)。标仪(分子设备)是用于读取OD在405海里。

2.4。统计分析

数据给出平均值±标准平均误差(SEM)。SAS软件更小。9.4 (SAS研究所卡里、数控、美国)和学生的t测试被用于确定统计差异组C和E .单向方差分析(方差分析)其次是邓肯的新的多重范围测试是用来确定统计差异组C, CF25,和CF57和组E, EF25, EF57。双向方差分析是用来证实乙醇和鱼油之间的互动。 < 0.05的值被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。食物摄入量和乙醇消费

没有发现差异在食物摄取六组(C组:74.8±3.9千卡/天;集团CF25: 74.1±3.9千卡/天;集团CF57: 74.3±4.1千卡/天;E组:76.4±3.2千卡/天;集团EF25: 72.0±3.2千卡/天;和组EF57: 70.1±3.0千卡/天)。平均乙醇消费群体E, EF25 EF57 11.4±0.2, 11.3±0.2, 11.1±0.2克/公斤体重/天,分别。没有这些酒精摄入量组之间的差异。

3.2。体重和肝脏相对重量

最后身体权重如表所示1。最后身体重量在两组之间没有差别C和E .然而,最后身体重量组EF25和EF57明显低于E组( )。肝脏相对重量在E组明显高于C组( )。然而,肝脏相对重量展出E组间没有差异,EF25, EF57。

表1
最后身体重量,在每组肝脏相对重量1、2、3。
3.3。肝组织病理学检查

喂养8周后,血浆AST和ALT活动E组明显高于C组( 、表2)。然而,等离子体AST活动团体EF25和EF57 E组相比显著降低( )。

表2
最后的等离子体天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)每组活动1、2。

肝脏是在表的组织病理学评分3。脂肪的变化(包括微小和microvesicular),炎症细胞浸润,细胞变性和坏死在E组观察;然而,脂肪改变、炎症和细胞变性和坏死组织FE25和FE57明显低于那些在E组( )。根据图1他走时染色显示,肝细胞变性和坏死伴有脂肪堆积和炎性细胞浸润。

表3
在每组肝组织病理学评分1、2。

图1
鱼油对他走时的影响染色肝组织部分大鼠慢性乙醇喂养。简历:中央静脉;PV:门静脉;C:对照组;CF25:控制饮食与鱼油代替橄榄油的25%;CF57:控制饮食与鱼油代替橄榄油的57%;艾凡:乙醇组;EF25: alcohol-containing饮食与鱼油代替橄榄油的25%;EF57: alcohol-containing饮食鱼油代替57%的橄榄油。)染色显示肝细胞变性和坏死伴有炎症细胞浸润(三角形)组E .此外,脂肪变化在E组(箭头)也被发现。
3.4。氧化应激

TBARS浓度和CYP2E1表达被认为是评估肝脏抗氧化状态的指标。结果血浆和肝TBARS浓度表4。血浆和肝TBARS浓度明显高于在E组( );然而,血浆和肝TBARS浓度都显著降低组EF25和EF57比E组( )。如图2在E组,CYP2E1表达明显高于C组( );然而,E组间没有差异,EF25, EF57。

表4
硫代巴比土acid-reactive物质(TBARS)浓度在每组1、2。
(一)
(一)
(b)
(b)
图2
每组肝CYP2E1表达的蛋白质。值表示为均值±SEM。C:对照组;CF25:控制饮食与鱼油代替橄榄油的25%;CF57:控制饮食与鱼油代替橄榄油的57%;艾凡:乙醇组;EF25: alcohol-containing饮食与鱼油代替橄榄油的25%;EF57: alcohol-containing饮食鱼油代替57%的橄榄油。酒吧与 组间显著不同的C和E 根据学生的水平t测试。
3.5。炎症反应

老鼠在E组显著升高TNF -α,il - 1β、il - 6和il - 10浓度相比,在C组大鼠( 、表5)。肝肿瘤坏死因子-α,il - 1β、il - 6和il - 10水平明显低组EF25 EF57比E组( )。

表5
肝肿瘤坏死因子(TNF)α白介素- 1 (IL)β每组、il - 6和il - 10水平1、2。

此外,E组显示显著最低血浆脂联素浓度在所有组( 、表6)。此外,血浆脂联素水平明显高于在团体EF25和EF57比E组( )。

表6
每组血浆脂联素水平1、2。

每组血浆VCAM-1和ICAM-1水平如表所示7。等离子体VCAM-1和ICAM-1 E组明显高于C组( )。然而,等离子体VCAM-1浓度显著降低相比,团体EF25和EF57 E组( )。血浆浓度ICAM-1 EF25组明显低于在E组( )。

表7
等离子体血管细胞粘附分子1 (VCAM)和细胞间粘附分子1 (ICAM)每组大鼠的水平1、2。
3.6。小肠组织病理学检查和TJ蛋白ZO-1分布

根据赵的分数分类小肠损伤,大量的小肠损伤图所示3 (b)。所有组间没有差异,但组E, EF25,和EF57显示更高的趋势相比,c组得分2 ~ 4,这意味着存在的细胞裂解,villosities之间的间距增加,结构破坏villosities等等(图3(一个))。ZO-1表达式在小肠粘膜被包含IHC检测,结果显示上皮结构不同组间(图4)。在C组小肠粘膜的上皮是完好无损。相比组C和CF25组CF57显示一个大大大ZO-1免疫反应性的区域( )。然而,C和E组之间没有变化,甚至在酒精摄入量组。

(一)
(一)
(b)
(b)
图3
每组分数的小肠损伤。C:对照组;CF25:控制饮食与鱼油代替橄榄油的25%;CF57:控制饮食与鱼油代替橄榄油的57%;艾凡:乙醇组;EF25: alcohol-containing饮食与鱼油代替橄榄油的25%;EF57: alcohol-containing饮食鱼油代替57%的橄榄油。(一)代表的组织学图像在所有组大鼠100 x放大。(b)组间小肠损伤的量化分数。
(一)
(一)
(b)
(b)
图4
ZO-1包含IHC染色的紧密连接蛋白,在每组小肠粘膜。C:对照组;CF25:控制饮食与鱼油代替橄榄油的25%;CF57:控制饮食与鱼油代替橄榄油的57%;艾凡:乙醇组;EF25: alcohol-containing饮食与鱼油代替橄榄油的25%;EF57: alcohol-containing饮食鱼油代替57%的橄榄油。(一)代表的组织学图像在所有组大鼠200 x放大。箭头表示ZO-1-positive地区。正常小肠展示完整的上皮细胞有显著的深棕色ZO-1表达式。 (b) Quantification of ZO-1-immunoreactive areas among groups. Bars with different letters (A, B) significantly differ among groups C, CF25, and CF57 at the 水平根据单向方差分析(方差分析)其次是邓肯的新的测试多个范围。
3.7。血浆内毒素水平

如表所示8、血浆内毒素水平明显高于在E组与C组( )。然而,组织EF25和EF57呈现显著降低血浆内毒素浓度相比,E组( )。

表8
在每组血浆内毒素水平1、2。

4所示。讨论

类似于我们的以前的研究,平均酒精摄入量为11.1 ~ 11.4克/公斤体重/天的酒精摄入量组,将可媲美酗酒者在人类(超过50 ~ 60克/天绝对酒精)转换后动物的剂量相当于人类基于身体表面区域(16,17]。

ethanol-containing液体饮食喂养的大鼠(E组)8周出现了轻微的体重的损失。然而,当老鼠同时食用乙醇和鱼油(团体EF25和EF57),最后身体重量明显降低(表1)。鱼油与身体在高脂减肥效果食源性肥胖动物研究[24,25]。鱼油的潜在抗体脂肪机制提出了包括增加血浆脂联素水平(25),增加脂肪细胞凋亡(26),和改变脂肪氧化27]。因此,乙醇和鱼油对脂肪组织的影响应该在将来的研究中检查。

更高的AST和ALT活动、肝脂质积累和炎性细胞浸润在E组大鼠观察(表2和3)。乙醇滥用诱发肝脂肪肝和炎症所证明的数以百计的研究(28我们先前的研究[],也11,12,20.]。Ethanol-induced肝脏病理改变是由于脂质代谢异常,pro -之间的不平衡和抗炎细胞因子,升高血浆内毒素水平(20.]。在目前的研究中,服用鱼油王亚南显示效果与ethanol-containing老鼠喂流食基于ALT活性和肝组织病理学得分较低(表2和3)。我们推测,鱼油的防护机制ethanol-induced肝脏损伤的老鼠的可能与antilipid积累,抗氧化压力(表4),(表免疫调节作用5)。鱼油的抗氧化潜力是有争议的。Ramaiyan等人表明,鱼油是添加到饮食ain - 70(50克/公斤食物,2.5克/公斤体重)降低大鼠肝TBARS内容(29日]。相反,Tsuduki等人表明,鱼油的饮食消费(鱼油:红花油50的比例:50克/公斤的饮食,5.53克/公斤体重)28周显著增加男性SAMP8小鼠血浆和肝TBARS内容(30.]。在目前的研究中,摄入鱼油含量1.07和2.43克/公斤体重在老鼠喂食鱼油,是类似于Kikugawa水平等的研究(27]。因此,适当比例的美国,MUFAs,欧米非常重要的防止氧化应激引起的疾病(31日]。另一方面,一些研究证实,鱼油的抗炎作用与生产n resolvin (EPA)和d resolvin (DHA)通过环氧合酶(COX) 2通路(32]。在我们之前的研究中,我们还发现,鱼油规范化肝支持和抗炎细胞因子分泌在大鼠慢性酒精滥用(20.]。

脂联素抑制ICAM-1和VCAM-1通过抑制核转录因子的表达(NF)κB激活和有几个antiatherogenic和消炎作用33]。此外,一些动物模型表明,hypoadiponectinemia和改变肝脂联素信号引起的慢性乙醇摄入与脂肪变性和炎症(34]。我们还发现,血浆脂联素水平明显降低;相比之下,等离子体ICAM和VCAM水平增加老鼠只与乙醇(E组表6和7)。然而,当ethanol-fed老鼠摄入鱼油,降低血浆脂联素水平是改善;此外,等离子体ICAM和VCAM水平相对较低(团体EF25和EF57表6和7)。膳食摄入omega - 3 (n)欧已成为一个重要的方式来修改心血管风险通过调节内皮细胞粘附分子的表达和发病,如ICAM VCAM,脂联素在心血管疾病和糖尿病35,36]。我们最好的知识,这是第一个研究发现鱼油替代的饮食可以提高血浆脂联素水平和降低血浆粘附分子在大鼠慢性乙醇喂养。进一步的研究是必要的澄清鱼油和脂质代谢相关的分子之间的关系因素,脂联素的监管途径。

一项研究表明,乙醇及其代谢产物(如乙醛)破坏肠道上皮TJ蛋白,包括ZO-1和occludin,从而导致慢性肠道屏障的完整性差酒精摄入量动物模型(37]。在这项研究中,没有区别在小肠损伤或ZO-1免疫反应性的区域被发现在老鼠美联储与乙醇(E组的数据3和4);然而,老鼠与乙醇长期喂养8周(E组)血浆内毒素水平显著升高(表8)。因此,肠组织病理学上的数据在这个研究是不足以解释hyperendotoxinemia在大鼠暴露于慢性乙醇摄入。其他TJ蛋白、occludin或肠道通透性监管机构zonulin,应该以未来的研究(38]。有趣的是,当鱼油是用橄榄油代替nonethanol-containing饮食(集团CF57),明显大ZO-1免疫反应性的区域被发现(图4)。相比之下,没有明显的变化ZO-1免疫反应性的区域在老鼠喂食鱼油和ethanol-containing饮食(集团EF57图4)。鱼油的喂养模式混合到ethanol-containing液体饮食可能是一个可能的原因为肠上皮细胞的保护作用减弱,鱼油补充剂。然而,我们仍然发现鱼油改善高血浆内毒素水平在大鼠慢性酒精摄入量(团体EF25 EF57,表8)。摩尼等人表示,餐后血清内毒素浓度增加餐后丰富的美国和减少高n PUFA摄入量在猪模型(39]。先前的研究还表明,内毒素的信号和传输过程是在专门的膜microdomains称为脂质筏、和石油丰富的n - 3欧可能扰乱脂质筏,抑制内毒素大交通(39,40]。因此,我们建议的机制的n - 3 PUFA-enriched鱼油抑制内毒素运输在肠道上皮细胞可能与脂肪酸调节肠膜脂质筏而不是结构完整性。

在这项研究中,没有剂量反应鱼油替代水平对饮酒导致的肝损伤的影响观察肝组织病理学评分或炎症因子,包括细胞因子、粘附分子,发病。因此,根据我们的数据,采取更多的鱼油补充剂不能提供更大的老鼠对酒精性肝损伤的保护作用。

5。结论

总之,慢性乙醇喂养血浆内毒素水平升高,可能引发炎症反应,从而导致肝损伤。此外,鱼油用橄榄油代替乙醇暴露下循环抑制内毒素的外观,从而减少炎症反应,产生潜在王亚南在大鼠慢性乙醇喂养。然而,降低血浆内毒素水平的机制鱼油补充剂可能不是相关改善肠道结构完整性。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

怡文博士简是第一作者。怡文简,杨Suh-Ching设计研究。Hsiang-Chi彭和陈Ya-Ling进行了实验。Man-Hui派进行了小肠组织病理学检查。小李干壮族测量血浆内毒素水平。彭Hsiang-Chi Suh-Ching杨,Hsiao-Yun王写的原稿。

确认

这项研究由科技部、台湾(nsc100 - 2320 b - 038 - 023 - my3;most104 - 2320 - b - 038 - 041 - my3)。作者感谢生命科学万岁,台湾分支机构提供的鱼油。