文摘
一个平衡的鞘脂类变阻器是必不可少的树突状细胞功能和生存,从而启动免疫反应。鞘脂类水平动态维护的鞘脂类酶的作用的鞘氨醇激酶,S1P磷酸酶(SGPP-1/2)和S1P裂合酶(SGPL-1),关键在S1P和鞘氨醇水平之间的平衡。在这项研究中,我们提出SGPP-1和SGPL-1调节树突细胞在炎症和导致S1P的命运。TLR-dependent随后差别造成SGPL-1激活蛋白对这些酶活性下降了三分之二。在并行共焦荧光显微镜显示,内生SGPP-1天真的树突细胞的核内表达,易位到cytoplasmatic隔间S1P炎症刺激导致脱磷酸作用。质谱测定表明,由此产生的鞘氨醇的一部分被释放的细胞,增加细胞外水平。另一条路线,细胞内递减S1P可能是由其出口通过磷酸腺苷盒式运输车C1调节阵列分析,虽然S1P运输车,老处女同族体2,在树突细胞无关。这些调查新描述顺序表达式和本地化的内生S1P监管者SGPP-1 SGPL-1和突出贡献的鞘脂类变阻器炎症。
1。介绍
除了其迁徙的影响,S1P重要的是有助于炎症过程通过细胞内信号(1]。生产、代谢和运输定义中起关键作用的鞘脂类变阻器树突状细胞(DC)生存和细胞因子分泌抗原捕获(2- - - - - -4]。S1P功能细胞作为第二信使或可以分泌出细胞,细胞外信号通过S1P受体自分泌和旁分泌方式。我们和其他人证明高分化的细胞外的S1P浓度导致直流数量少生产IL-12p70后TLR4刺激(3,5)和有限的能力,从而启动Th1反应(6]。删除一个主要S1P-producing酶鞘氨醇激酶1 (Sphk1)树突状细胞减少导致的细胞生存和代谢活动(2]。
它假定S1P水平细胞内严格监管的平衡S1P综合酶Sphk1 Sphk2和代谢/降解酶磷酸酶和S1P裂合酶(SGPL-1)。SGPL-1因此不可逆转地降解S1P hexadecenal和phosphoethanolamine [7]。S1P磷酸酯酶1和2 (SGPP-1/2)可逆代谢S1P进鞘氨醇(8,9]。
最初被明镜的小组,S1P磷酸酶1是非常具体的对长链sphingoid基磷酸盐和降解S1P dihydro-S1P, phyto-S1P [9- - - - - -11]。的转染哺乳动物SGPP-1 NIH 3 t3成纤维细胞S1P水平下降,神经酰胺水平,增加和减少细胞生存10]。人类SGPP-1表达在大多数组织中,最强的水平高度血管化的组织中(12]。SGPP-1人类胃癌组织中表达下调,在入侵中发挥作用和迁移在胃癌细胞(13]。SGPP-1导致ER应激自噬在人类乳腺腺癌MCF7细胞(14]。其生物学功能还角化细胞发展的一个突出的作用,导致失衡S1P和天然保湿因子15]。
尽管明显S1P-degrading通路的重要性,只有稀疏的调查重点是S1P磷酸酯酶在细胞分化和癌症,实际上没有研究处理SGPP-1在免疫细胞。以前,我们已经描述了一个占主导地位的丧失的S1P TLR激活树突状细胞(2]。因此,连续在这个研究中,我们调查了S1P脱去磷酸酶SGPP-1晚期SGPL-1降解酶,以及其他可能的机制,减少细胞内炎症树突细胞S1P的水平。
2。方法
2.1。隔离、分化和骨髓细胞的刺激
隔离、分化和刺激骨髓细胞进行描述之前(2]。总之,女性C57BL / 6野生型小鼠(Janvier, Saint-Berthevin Cedex,法国)。所有的动物被饲养在当地特定的无菌条件下动物设施。依照德国的所有动物实验动物福利法律和动物福利官已经宣布的伦理监督委员会的主席法兰克福歌德大学/主要。动物的住房设施由当地政府许可的Regierungspraesidium达姆施塔特(阿兹:32.62.1)。用于使安乐死动物人道的方法是一致的与美国兽医协会的指导方针建议安乐死的动物。安乐死动物骨髓是孤立于胫骨和股骨和清洗,和红血球细胞溶解。细胞分化的RPMI 1640 GlutaMax介质(美国马萨诸塞州热费希尔科学)补充10% FCS,青霉素100单位/毫升,100年μg / ml链霉素,10毫米玫瑰(Sigma-Aldrich、Steinheim、德国),1毫米丙酮酸钠,50μ米2 -β加(美国马萨诸塞州热费希尔科学)。GM-CSF-differentiated细胞已经补充了40 (CD11c ng / ml gm - csf七天+DCs)。Flt3分化已经由200 ng / ml Flt3配体和20 ng / ml gm - csf (CD103十天+美国疾病控制与预防中心)。差异化来源于DCs的骨头被收获,播种没有FCS,刺激和1μg / ml有限合伙人大肠杆菌O127: B8 (Sigma-Aldrich Steinheim,德国)表示时间点或不及时治疗。刺激后,细胞或细胞颗粒被用于RNA分离、蛋白质提取,脂质提取或染色。
2.2。人类PBMCs的隔离和分化
根据执行隔离的pmc巴菲外套Nair et al。16]。
总之,密度离心进行使用聚蔗糖(通用电气医疗集团,乌普萨拉,瑞典)。孤立PBMCs一直在镀2×10的密度8细胞每道菜,2 h后上层清液被丢弃的塑料的依从性。随后,细胞分化RPMI 1640年GlutaMax介质(美国马萨诸塞州热费希尔科学)补充10% FCS,青霉素100单位/毫升,100年μg / ml链霉素,10毫米玫瑰(Sigma-Aldrich、Steinheim、德国),1毫米丙酮酸钠,50μ米2 -β加(美国马萨诸塞州热费希尔科学)补充了40 ng / ml人类重组gm - csf(美国新泽西州PeproTech)和人类il - 4(美国新泽西州PeproTech)和一个额外的介质交换后4天。分化细胞收获细胞刮和转移到tissue-treated 8-well有房间的封面幻灯片(Ibidi Martinsried,德国)荧光显微法染色。
2.3。西方墨点法
免疫印迹分析,颗粒状细胞细胞溶解在缓冲区包含10毫米HEPES-KOH,氯化钾10毫米,0.1毫米EDTA, EGTA 0.1毫米,0.5毫米氟化钠,1毫米Na3VO4, 1 x完成™蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏诊断,曼海姆,德国)10分钟。胞质分数被离心造粒后使用核分数在13000 g×10分钟在4°C。核分数与缓冲区包含20毫米HEPES-KOH另外细胞溶解,400毫米氯化钠,1毫米EDTA, EGTA 1毫米,0.5毫米氟化钠,1毫米Na3VO4, 1 x 10分钟成套蛋白酶抑制剂和离心10分钟10000×g在4°C。蛋白质含量是由BCA(美国马萨诸塞州热费希尔科学),根据制造商的指示。完整的细胞提取物和细胞分数被用于检测与anti-SGPL-1 (ab56183) anti-SGPP-1 (ab108435) anti-MRP-1 (ab32574) (Abcam,剑桥,英国),和反β肌动蛋白(A5441) (Sigma-Aldrich、Steinheim、德国)后sds - page。根据第一抗体,第二抗体anti-rabbit免疫球蛋白(通用电气医疗集团,小都,英国)已被使用。乐队的蛋白质被发现发射极耦合逻辑(美国马萨诸塞州热费希尔科学)后,制造商的协议。定量评价是由微使用数量(Bio-Rad大力神,CA)。
2.4。脂质提取和鞘脂类分析质/女士
质/ MS进行描述之前(17]。详细的量化鞘脂类,细胞颗粒或上层清液上升了一个内部标准的解决方案(500 ng / ml;Sph-d7、S1P-d7 Saph-d7、C16:0-Cer-d31 C17-Cer, C18:0-Cer-d3, C18:0-dhCer-d3, C17:0-LacCer, C16:0-LacCer-d3, C18:0-GluCer-d5;美国两代情极性脂质,雪花石膏;合成由ChiroBlock GmbH, C24:0-Cer-d4沃尔芬,德国)。150年之后,μl水添加和分析物提取与600年的两倍μl甲醇:氯仿:盐酸(15:83:2v/v/v)。收集到的有机相蒸发在45°C下温柔的氮和重组在50个μl甲醇。色谱分离,卢娜C18柱(150毫米×2.0毫米,5μ100粒子大小、孔隙大小;使用Phenomenex Aschaffenburg,德国)。高效液相色谱的移动阶段由water-formic酸(100:0.1,v/v)(A)和acetonitrile-tetrahydrofuran-formic酸(50:50:0.1,v/v/v)(B)。分离,梯度程序使用的流量0.3 ml / min。最初的缓冲区组成60% (A) / 40% (B)举行了0.6分钟,然后在3.9分钟线性(A) / 100%改为0% (B)和6.5分钟。随后,构成线性变化在0.5分钟(A)的60% / 40% (B),然后另一个4.5分钟。每个样品的运行时间(注入量:15μl Cer和dh-Cer决心和10μl其他鞘脂类)是16分钟。MS / MS分析API4000三重四极质谱计上配备了一个APCI(大气压化学电离离子源(SCIEX,达姆施塔特,德国)Cer和dh-Cer决心和ESI(电喷雾电离离子源的确定其他的鞘脂类。分析了在多反应监测(MRM)模式。两个米/z转换20 ms的停留时间为每个分析物记录,量化的第一个和第二个资格,排除假阳性结果。进行分析和量化分析软件1.6 (SCIEX,达姆施塔特,德国)使用,每个分析物的峰面积由峰面积校正相应的内部标准。校准曲线建立了用线性回归1 /x权重。相关系数是至少0.99。精度小于15%的变化在整个范围的校准,除了量化的最低限制,接受变化20%的准确性。
2.5。定量实时聚合酶链反应
使用peqGOLD颗粒状细胞总RNA提取总RNA工具包(peqlab,埃朗根,德国)推荐的制造商。RNA浓度测量使用Nano-Drop 1000(美国马萨诸塞州热费希尔科学)分析仪,并调整为1μ克/μl为使用高容量cDNA逆转录合成第一链cDNA工具包(生活技术,卡尔斯巴德,CA)。TaqMan®基因表达分析(生活技术,卡尔斯巴德,CA)申请sgpl-1, sgpp-1, abcc1, abca1, abcg1, spns2(应用生物系统公司,达姆施塔特,德国)和管家基因csnk2a2和fbxo38(引物设计、南安普顿、英国)。精度快速Mastermix(引物设计、南安普顿、英国),和定量实时PCR在95°C运行2分钟,40倍在95°C 5 s和60°C 20年代(7500快速实时PCR系统,应用生物系统公司,达姆施塔特,德国)。比较CT方法用于分析结果使用的均值两个管家基因作为参考。
2.6。荧光显微镜
细胞生长在tissue-treated 8-well有房间的封面幻灯片(Ibidi、Martinsried、德国),与300年洗两次μl冰冷的PBS和固定4分钟冰冷的甲醇在冰上。洗后与300年的三倍μl PBS, 2%的细胞被封锁BSA-PBS 1 h和随后沾第一抗体鼠或人类anti-SGPP-1 (ab108435和ab129253 Abcam,剑桥,英国)或小鼠anti-SGPL-1(从Abcam ab56183)一夜之间在4°C。实验证实了抗体特异性、小鼠anti-SGPP-1抗体与相应的屏蔽preincubated肽(从Abcam ab223885)的比率1:2 30分钟前的细胞。洗三个步骤之后,第二抗体(anti-rabbit,通用电气医疗集团,英国)和DAPI (4 ,6-Diamidine-2-phenylindole盐酸盐)解决方案(罗氏诊断,曼海姆,德国)申请了1小时。最后,细胞被洗了,在黑暗中保持在4°C到微观分析。ER追踪colocalization,与4%多聚甲醛固定细胞代替甲醇和ER追踪蓝白色(美国马萨诸塞州热费希尔科学)已经应用在固定。共焦激光扫描显微镜进行了蔡司LSM510元系统配备一个倒置的观察者Z1显微镜和Plan-Apochromat 63×/ 1.4油浸物镜(卡尔蔡司缩微成像GmbH,哥廷根,德国)。
2.7。ABC转运体数组
TaqMan数组为ABC转运蛋白(美国马萨诸塞州热费希尔科学)执行根据制造商的建议。总之,RNA是孤立和转录成互补。互补脱氧核糖核酸与主混合分发到96孔板阵列,应用了热循环条件如下:在95°C 20秒40次为95°C 3年代和60°C 30年代(7500快速实时PCR系统,应用生物系统公司,达姆施塔特,德国)。比较CT方法用于分析结果。
2.8。SGPL-1活动测量
SGPL-1活动的量化测量是由(2 e) -hexadecenal 2-diphenylacetyl-1衍生化后,3-indandione-1-hydrazone (DAIH)之前所述18]。总之,细胞提取冷methanol-chloroform 0.9%生理盐水混合物在冰上。有机相在乙腈干和解决。进行衍生化混合物含有0.6毫克/毫升DAIH在乙腈和2 M盐酸在4°C的7%。醛的分析进行了安捷伦1200液相色谱系统耦合到一个安捷伦6530四极/飞行时间质谱仪(来自Waldbronn,德国)。色谱分离进行ZORBAX Eclipse XDB-C18列。
2.9。统计数据
6.0软件GraphPad棱镜(拉霍亚,CA)是用于输入数据,显示图形,并执行统计学生的t如果图中表示传说以及或其他。数据被表示为意味着±SD和重要值都象征着星号(//),代表值≤0.05 / /≤0.001≤0.01。
3所示。结果
3.1。监管SGPL-1和SGPP-1表达炎性树突细胞
阐明树突细胞的鞘脂类变阻器调节,我们对如何调制在DCs鞘脂类酶的表达。以前,我们已经表明,随着时间的推移,S1P水平消失在炎症细胞(2]。与此同时,sphk1和sphk2mRNA水平并不表达下调对LPS刺激可能表明调制S1P-producing酶可能不是导致炎症DCs (S1P损失2]。因此,我们研究是否S1P-degrading酶SGPL-1和SGPP-1 S1P命运中扮演重要角色。因此,我们从野生型小鼠和孤立的骨髓产生GM-CSF-differentiated CD11c+DCs。我们观察到,sgpl-1和sgpp-1水平下降或保持不断降低炎症DCs随着时间的推移而天真的DCs(数字1(一)和1 (b))。同样,SGPL-1蛋白质水平降低48 h后炎性刺激而天真的DCs(图1 (c))。降低蛋白质含量是反映在减少SGPL-1酶活性顺序,拒绝在炎症刺激三分之二表明炎症DCs S1P退化的主要力量是抑制(图1 (d))。值得注意的是,减少sgpp-1mRNA水平并未导致减少SGPP-1蛋白质含量,而倾向于增加(数据1 (e)和1 (f))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.2。SGPP-1但不是SGPL-1炎症树突细胞转移
自从SGPP-1蛋白质含量在整个细胞溶解产物倾向于增加炎症DCs SGPL-1浓度降低时,我们接下来详细检查水平。使用共焦荧光显微镜在休息,我们发现饥饿的DCs,大部分anti-SGPP-1染色细胞核内被本地化,仅少量存在于核外室(图2(a))。相比之下,在炎症DCs,大多数anti-SGPP-1染色细胞核内不再存在,但cytoplasmatic隔间(图中找到2(b))。在一个支持实验中,我们生产Flt3 ligand-differentiated CD103+疾病预防控制中心,刺激他们以类似的方式。还在这里,炎症反应是伴随着anti-SGPP-1染色的易位细胞质细胞核(数字2(c)和2(d))。进一步证实了这些结果,我们孤立的细胞分数分离原油从胞质核分数(多数核蛋白质),溶酶体,ER(称为胞质分数)。免疫印迹显示SGPP-1乐队在两个隔间。值得注意的是,在原油核提取蛋白浓度高于在核外舱天真DCs。然而,在炎症条件下,SGPP-1胞质部分蛋白质含量增加,减少核分数。因此,天真的DCs相比,SGPP-1核酸蛋白质含量减少在LPS刺激的隔间(数字2(e)和2(f))。
值得注意的是,我们发现大部分的内生anti-SGPP-1染色在细胞核本地化成熟dc分化(图七天后3(a))。证实了抗体特异性的预培养相应的染色前阻断肽和显示没有染色细胞核(补充图1)。在额外的支持,我们人类产生monocyte-derived DCs中核的位置SGPP-1也证实使用人类anti-SGPP-1抗体(图3(b))。Anti-SGPL-1染色出现只在胞质隔间。SGPP-1相比,类似SGPL-1蛋白质定位的变化并不是发现在刺激(图3(c))。
进一步澄清SGPP-1易位的炎症DCs,我们用一个ER costained细胞追踪,发现大部分的改变蛋白质存在ER舱在刺激(数字3(d),3(e)3(f))。
3.3。细胞外鞘氨醇增加在树突细胞的炎症反应
因为我们发现一个upregulation SGPP-1蛋白质的胞质分数,我们问衰落S1P水平观察炎症条件下(2)由于其脱磷酸作用增加了SGPP-1导致鞘氨醇的形成。因此,我们下一个决定在DCs鞘氨醇的水平。然而,随着时间的推移,我们发现鞘氨醇没有积累在细胞减少(图4(一))。调查如果鞘氨醇转化为神经酰胺物种相反,我们确定细胞内C14-C24神经酰胺水平。虽然和神经酰胺水平远高于鞘氨醇的水平,没有单一的物种差异天真和炎症DCs观察(作为整个神经酰胺水平在图4 (b))。阐明如果鞘氨醇被释放的细胞,我们进一步量化细胞外脂质,发现增加了鞘氨醇的水平,可能表明鞘氨醇的比例由SGPP-1被释放炎症介质的DCs(图4 (c))。
(一)
(b)
(c)
3.4。Spns2不负责从树突细胞S1P出口
在这种情况下,问题出现S1P是否由转运蛋白在细胞外还积极运输导致其胞内减少。因此,我们集中在已知S1P运输车的规定。磷酸腺苷的盒式磁带(ABC)运输车数组和披露存在几个执行ABC转运蛋白在树突细胞(补充图2)。三位著名的冲击,即abca1,abcc1,abcg1进一步进行了分析。而abcg1表达下调是在长期炎症条件下,abca1和abcc1信使rna调节(图5(一个))。Abcc1也调节蛋白水平在48 h的炎症刺激可能导致S1P命运(图5 (b))。主要的S1P运输车,老处女同系物2 (spns2) [19),略表示选择的绝对水平相比ABC转运蛋白(图5 (c))。没有观察到炎症upregulation DCs(图5 (d))。细胞外S1P水平确定在一个适应和高档手机设置比传统实验进行克服检测限制质/女士。分析表明,没有积累S1P介质中刺激(补充图3)。
(一)
(b)
(c)
(d)
4所示。讨论
当我们和其他人发表之前,中央树突细胞的免疫功能是依赖的S1P receptor-controlled调制的关键细胞因子和生存的基本细胞或细胞凋亡由鞘脂类代谢酶(2,3,20.,21]。详细,不同模型鞘脂类研究从酵母到HEK293细胞,在初级淋巴细胞和树突细胞如下所示,没有直接的相互依存关系S1P合成与S1P-degrading酶。因此,与当前的调查,我们旨在更详细地解释这一现象。事实上,我们的数据证实了一个相当复杂的S1P序列和鞘氨醇变阻器相应的鞘脂类的酶和转运蛋白表达。这神秘的胞内S1P情况的一个例子,我们观察到细胞S1P水平inflammatory-activated DCs的差别正在消退,尽管对这些SGPL-1蛋白质和酶活性。可能差别虽然这对这些进步的S1P损失的补偿机制,我们认为对减少S1P水平在这种情况下是相当小。相反,我们可以分配一个重要的作用对SGPP-1 S1P的命运。尽管mRNA水平的sgpp-1拒绝通过刺激,我们表明,增加蛋白质含量,而在胞质隔间。这相反的mRNA水平的监管可能意味着另一个补偿机制越来越多的蛋白质或衰落S1P水平但也可能暗示对不同半衰期的信使rna和蛋白质并没有反映实际的转化过程的范围。
SGPP-1描述与ER和高尔基colocalize MCF7细胞,HEK293细胞,NIH 3 t3成纤维细胞在瞬态表达式SGPP-1构造(12,22,23]。在这项研究中,我们首次展示SGPP-1的内生本地化。在分化DCs,内生SGPP-1本地化主要在细胞核。在应激状态像饥饿和更在炎症条件下,SGPP-1从细胞核转移到胞质间,与ER colocalization终于观察到的地方。因此,我们得出这样的结论:系统转变SGPP-1离原子核细胞质对S1P的新陈代谢为鞘氨醇,因此细胞质S1P的损失。之前提出,SGPP-1-mediated S1P代谢导致神经酰胺的生产而非积累的鞘氨醇mSGPP-1-transfected HEK293细胞(22,23]。在我们的树突细胞炎症,鞘氨醇不是积累;然而,神经酰胺水平没有变化的意思是天真和炎症条件之间的关系。自树突细胞的神经酰胺水平远高于鞘氨醇的水平,直接代谢可能不过不可见。值得注意的是,鞘氨醇的一部分被释放到细胞外空间,因此,我们假设S1P代谢增加了胞质SGPP-1至少是部分导致鞘氨醇的释放。
S1P的释放到细胞外空间可能会演示处理S1P的另一条路线。据报道,S1P出口,例如,从红细胞和血小板ATP-dependent地(24,25]。一些出版物显示或假定S1P的传输特定的ABC转运蛋白,例如,通过Abcc1 antigen-activated肥大细胞(26- - - - - -28]。中描述的upregulation Abcc1也是SGPL-1-deficient成纤维细胞(29日]。我们同样观察到的upregulation Abcc1在DCs TLR4激活这可能导致炎症DCs中S1P的命运。然而,在我们的研究中,细胞外S1P没有增加。除了ABC转运蛋白,spns2是一个杰出的S1P运输车在内皮细胞(30.]。然而,这里,我们另外表明spns2以来DCs不歧视的作用只是略微表达,而不是调节炎症刺激。同样,spns2没有已被证明对血细胞之前(31日]。
5。结论
这项研究导致了三个主要的新发现。首先,我们证明和建议的主要比例内生SGPP-1位于小鼠,human-differentiated树突细胞的核间。第二,在炎症刺激,发生易位的SGPP-1 ER和可能有助于S1P命运和鞘脂类变阻器在树突细胞免疫反应。第三,spns2只是略微树突细胞中表达,而在炎症树突细胞S1P运输无关。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
作者感谢安德烈亚斯Hildenbrand技术援助和桑德拉·特罗特曼脂质提取和分析。这项研究是由德国研究基金会(DFG SFB1039)(安雅Schwiebs,多米尼克•托马斯•约瑟夫•M Pfeilschifter和Heinfried H Radeke)和德国联邦教育和研究(BMBF) (BB3R Berlin-Brandenburg研究平台,031 a262f) (Burkhard Kleuser)。
补充材料
补充1。图1:代表共焦显微镜的照片GM-CSF-differentiated树突状细胞(a) anti-SGPP1染色后(n= 7)和(b) anti-SGPP1染色后30分钟预孵化与SGPP-1阻断肽(1:2)(n= 2)和(c)二级抗体染色控制(n= 7)。
补充2。图2:ABC转运体阵列(n= 1)。
补充3。图3:细胞外S1P水平的量化质/女士(n= 3)。