文摘
先前的研究显示小CD137表达正常血管平滑肌细胞(VSMCs),重要的是要找到一个有效的方法来提高在研究它的功能。CD137的水平被rt - pcr检测,免疫印迹,流式细胞术,分别。CD137信号被激活受体激动剂激活抗体,通过表型转换测量指标和细胞功能。上层清液中的蛋白质被ELISA检测。厘米的总CD137提升不同浓度下治疗。其中,25 ng / ml CM治疗增加了主要CD137表达式。然而,流式细胞术表明10 ng / ml厘米提升表面CD137更重要的是比其他浓度,在36小时到达峰值。10 ng / ml,但不是25 ng / ml厘米预处理,SM-MHC等表型相关蛋白质的水平,αsma, calponin降低,波形蛋白和NFATc1增加,表明VSMCs进行表型转换。Transwell、CCK-8试验和ELISA表明VSMCs生存能力的能力,迁移,- 2和il - 6分泌引起CD137信号显著增强的预处理10 ng / ml厘米。这项研究表明,10 ng / ml厘米预处理浓度比其他更合理的VSMCs当探索CD137函数。
1。介绍
CD137,也称为4-1BB或TNFRSF9,属于肿瘤坏死因子(TNF)超科(TNFRSF)和越来越被认为是一个关键因素在免疫和炎症反应1]。CD137表达主要是T细胞中发现,DCs, NKs,单核细胞。激活CD137信号有助于细胞因子生产、扩张和功能成熟,能增强免疫反应(2,3]。最近的研究表明,CD137的激活和程序性死亡1 (PD-1)保持着下一代的成分免疫疗法对肿瘤(4,5]。
尽管CD137信号启示了癌症治疗,激活CD137的潜在风险不应被忽视。例如,它可能是一个动脉粥样硬化(AS)的不良因素。Olofsson等人发现CD137提升人类斑块和可能发挥重要的作用在调节动脉粥样硬化相关的功能细胞,如ECs和VSMCs [6]。在动物实验中,CD137−−/小鼠表现出明显的减少比WT小鼠动脉粥样硬化病变,表明CD137信号激活可以促进斑块形成和不稳定7- - - - - -9]。
炎症是动脉粥样硬化的标志涉及多个因素和细胞类型(10]。VSMCs参与斑块形成的中间和最后阶段。VSMCs是高度分化的细胞主要负责收缩和血管的规定(11]。在中间阶段的进展,VSMCs在媒体上可以从一个肉瘤分化表型为状态,特点是加速扩散,迁移,和细胞因子的产生,启动空斑形成一次迁移到内膜(12]。在最后阶段,扩散VSMCs凋亡和钙化,并导致斑块不稳定(13]。
最近的研究表明,CD137信号VSMCs功能调节发挥重要作用[14]。与其他细胞相比正常VSMCs表达低CD137使信号调查困难。增加CD137水平、Olofsson和荣格使用混合炎性细胞因子(il - 1厘米β干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α治疗VSMCs)。然而,我们发现这种方法的效果取决于严格细胞因子浓度,浓度不当甚至可能干扰CD137函数。因此,在本文中,我们VSMCs预处理与不同浓度的CM为了找到合理的实验条件进一步CD137的研究。CD137信号对VSMC的了解可能有助于探索粥样硬化机制的发展和指导CD137抗体在肿瘤的临床治疗,以避免未来的副作用。
2。材料和方法
2.1。老鼠主要细胞培养
三十岁的C57BL / 6 j小鼠8周从江苏大学购买。所有的动物都被安置在一个12小时,每个周期°C下%的湿度,在正常的笼子里有免费的水和食物。江苏大学动物保健和使用委员会批准的动物实验。老鼠主要主动脉平滑肌细胞提取如前所述[14]。一般来说,老鼠被公司实施安乐死2和胸部被移除。胸主动脉被曝光;单独的脂质和纤维膜血管手术显微镜下。动脉切除和PBS洗几次治疗II型胶原酶。然后,船只被切成块,在细胞培养瓶直到组织块培养被用于实验和5日至8日代。小鼠原代细胞培养在看看/ F12 (Hyclone)中含有15%的边后卫在37°C和5%的公司2。
2.2。细胞治疗
炎性细胞因子il - 1β干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α从Peprotech购买。细胞被分成组不同浓度梯度(0、10、25、50、75和100 ng / ml)或时间点(0、6、12、24、36和48 h),和细胞上清液收集sCD137检测。CD137信号激活试验,细胞使用相对厘米36 h和进一步处理或没有10 ng / ml兴奋剂CD137抗体(R&D)激活CD137轴。
2.3。定量实时聚合酶链反应
从VSMCs总RNA提取试剂盒(表达载体)。1 ug进行反转录RNA使用热费希尔RT试剂。CD137向前引物:CCTCCAAGTACCTTCTCCAGCA和扭转:CCTCCAAGTACCTTCTCCAGCA。GAPDH向前引物:GGCATTGCTCTCAATGACAA和扭转:TGTGAGGGAGATGCTCAGTG和被Sangon合成(上海,中国)。
2.4。免疫印迹分析
膜蛋白和胞浆蛋白被隔绝VSMCs通过膜和胞质蛋白提取工具包(Beyotime,中国)。蛋白质是量化利用Vazyme BCA试剂盒(中国),与5 x SDS混合加载缓冲区和10% SDS - page凝胶电泳。的anti-CD137多克隆抗体(美国Abcam)是用于检测CD137的单体或聚合物。抗体如SM-MHC(美国Abcam) NFATc1(美国CST)、波形蛋白(美国Immunoway) calponin(美国Abcam)α美国sma(σ)被用来观察CD137的表型转换轴。
2.5。酶联免疫吸附试验
收集细胞培养上清液从VSMCs梯度处理细胞因子组合或厘米+ agonist-CD137抗体。Anti-CD137酶联免疫试剂盒(美国Raybio)是用于检测sCD137水平刺激下分泌从VSMCs厘米。和白介素- 2从Multi-Science购买(中国)测量VSMCs诱导的炎症反应CD137信号激活。酶联免疫试剂盒的敏感性是6 pg / ml - 1500 pg / ml。
2.6。流式细胞术
流式细胞术进行观察CD137的膜,这进一步验证免疫印迹的结果。细胞消化和PBS洗。Anti-CD137-PE(美国eBioscience)稀释根据协议和添加到100年μl细胞悬液在4°C 30分钟。孵化后,细胞被洗一次,然后分析了流式细胞术(BD章)。
2.7。Transwell和CCK-8化验
不同浓度的细胞进行预处理厘米(0,10、25、50 ng / ml) 36 h;5×104细胞/毫升于200年镀μl的DMEM没有的边后卫在参议院,众议院充满了500μl DMEM含有2%的边后卫有/没有兴奋剂CD137。迁移的细胞被允许24小时37°C的5%的股份有限公司2的气氛。的细胞保持在较低的底部室和4%多聚甲醛固定,沾0.1%结晶紫,列举使用Image-Pro + 6.0软件。
VSMCs治疗如前所述,2000个细胞被镀在96孔板和扩散决定使用CCK-8工具包(Vazyme生物技术)。
2.8。统计分析
数据表示为至少三个独立实验的平均数±标准差(体外)和比较以及或方差分析使用SPSS 12.0版(美国SPSS,芝加哥,IL)。小动物——一张长有被认为是显著的。
3所示。结果
3.1。比较CD137表情VSMCs CM梯度引起的治疗
VSMCs治疗与不同浓度的厘米(0、10、25、50、75和100 ng / ml)。CD137的信使rna和蛋白质水平膜或细胞质分别测量(图1)。我们的数据表明,CD137根据位置以不同形式存在;它更有可能存在四聚物在细胞质膜,但单体或二聚体。CD137的表达在各种浓度的提高除了50厘米刺激ng / ml,到达峰值25 ng / ml治疗,但只有10 ng / ml厘米可以在膜诱导CD137的表达。流式细胞仪分析显示相同的结果(图1(d))。
3.2。比较CD137表情VSMCs在不同的时间点
我们选择10 ng / ml CM和检测浓度CD137的表达(0)6、12、24、36岁,通过免疫印迹和48 h, Q-PCR和流式细胞术。CD137的总水平提升与时间和到达峰值36 h(图2)。流式细胞术和免疫印迹显示膜CD137可能存在高水平从12 h 36 h但降低48 h。有趣的是,细胞质CD137的较高水平0 h和48 h,表现出一种相反的趋势与膜CD137。
3.3。sCD137的检测细胞上清液
细胞质中的CD137可能与可溶性CD137的水平(sCD137),据报道,是膜CD137的强有力的竞争抑制剂(15,16]。因此,我们使用西方和ELISA观察的形式和内容从VSMCs sCD137分泌引起厘米。免疫印迹显示sCD137浮在表面的二聚体,类似于细胞质CD137(图3(一个))。ELISA结果显示sCD137水平与CM浓度梯度增加,但在不同的时间点(数据显示没有区别3 (b),3 (c),3 (d))。sCD137水平由VSMC分泌明显增加在25日,50和75 ng / ml厘米比其他组。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.4。VSMCs CD137信号引起的表型转换不同的CM浓度
在以前的研究中,我们组发现CD137 VSMCs信号可以诱导表型转换,导致动脉粥样硬化斑块的形成。在目前的研究中,我们调查了VSMCs识别的表现型CD137信号激活。
四个浓度(0,10、25、50 ng / ml)厘米被选为预处理前36 h添加agonist-CD137抗体激活CD137信号。免疫印迹显示VSMCs使用10 ng / ml厘米经历显著的表型转换agonist-CD137抗体引起的。10和25 ng / ml CM组表现出VSMCs表型转换;SM-MHC等表型蛋白的表达,αsma和calponin减少而VSMCs波形蛋白的表达增加(图4)。在0 ng / ml CM浓度组,根据蛋白质显示无显著差异。有趣的是,在50 ng / ml CM组中,我们观察到相反的效果VSMCs表型。SM-MHC增加而波形蛋白和表型调控蛋白NFATc1下降50 ng / ml CM组相比,10 ng / ml组。
(一)
(b)
3.5。VSMCs CD137引起的迁移和增殖信号与不同的CM浓度
CD137信号的影响在不同浓度的CM治疗之前被transwell试验来确定测量细胞的迁移能力(数据5(一)和5(b))。在图5迁移细胞数量没有显著差异在0 ng和25 ng / ml当处理或没有agonist-CD137 CM组。在CM组10 ng / ml, CD137信号激活诱导细胞迁移而抑制50 ng / ml CM组。应该注意的是,高浓度(25 ng / ml或50 ng / ml)厘米刺激可以提高基本的细胞迁移。
在细胞生存能力分析,VSMCs 10 ng / ml 25厘米,ng / ml CM组显示增加扩散agonist-CD137处理时(图5(c))。
3.6。VSMCs CD137信号被激活时,分泌和白介素- 2不同浓度的厘米
2、il - 6的浓度在上层清液分泌VSMCs由ELISA(图测量5(d))。- 2和il - 6水平明显升高CD137信号激活时10 ng / ml厘米治疗。我们还观察到一个高基本水平的il - 6时被ng / ml 50厘米。
4所示。讨论
CD137的T细胞和通过绑定的costimulators CD137配体激活CD137信号和促进增殖和细胞因子的生产17]。近年来,CD137信号被认为是肿瘤治疗的一个重要目标,因为它刺激免疫系统。例如,agonist-CD137抗体和PD-1封锁根除肿瘤通过诱导强烈的免疫T细胞(4]。此外,构建的嵌合T细胞抗原受体修改(车)anti-CD20 scFv,和人类CD137及CD3ζ信号被证明是一种有效的治疗方式的患者复发或难治性咄咄逼人的弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL) [18]。
CD137信号能增强免疫和炎症反应。但肿瘤治疗的祝福在动脉粥样硬化可能是有害的,一种疾病引起的炎症和免疫overactivation。包括我们在内的许多研究表明,激活CD137斑块形成的信号可能是一个风险。CD137的同时,研究动脉粥样硬化仍然有限的由于低基层CD137表达几个动脉粥样硬化相关细胞尤其是VSMCs [6,8]。研究人员总是VSMCs预处理细胞因子组合提升CD137表达研究CD137信号之前,但这个方法定义,没有验证。因此,在本文中,我们进行了系统的研究来验证方法的效果。
在我们的研究中,我们发现,CM的浓度是非常重要的,因为CD137的高程与CM的浓度不是线性的。在图1,我们表明,尽管25 ng / ml厘米诱发最总CD137的表达,可能是功能的膜CD137升高10 ng / ml厘米刺激。应该注意到CD137可能存在不同的形式根据位置和功能。例如,CD137膜是四聚物,细胞质CD137的二聚体或单体,在VSMCs sCD137总是存在二聚体(数字1和3)。CD137是否在其他组织四聚物或二聚体以及不同形式的CD137是否有不同的函数是未知的。这是暗示CD137的不同结构可以作为目标,这可能避免的副作用的细胞特异性agonist-CD137抗体在临床试验中。
我们还发现时间梯度找到更适合的时间点CD137信号激活。有趣的是,膜CD137的表达增加从12 h和到达山顶36小时,而细胞质CD137有相反的趋势。这一现象的原因可能是在细胞质CD137经历一个动态的易位sCD137膜或分泌到细胞外。
如上所述,CM刺激诱导总CD137高程。超过膜CD137 sCD137,这被认为是一种有效的竞争性抑制剂CD137也可能升高(15,16]。因此,我们测量在上层清液sCD137 ELISA。与我们的假设一致,sCD137还与CM梯度增加。与其他浓度相比,10 ng / ml厘米显示sCD137分泌更少,这意味着更少的干涉CD137信号激活。
我们终于发现CD137信号激活使用agonist-CD137抗体在不同浓度的厘米。因为没有公认的标准来衡量CD137信号激活VSMCs [19,20.),我们把VSMCs表型转换和细胞功能的指标与炎症相关细胞因子(il - 6 - 2)分泌,证明我们之前的研究中。与我们的假设一致,三个指标表现出明显的变化引起agonist-CD137只有10 ng / ml厘米预处理。荣格等人25 ng / ml厘米VSMCs预处理用于进一步CD137激活,显示出良好的性能8]。然而,在我们的研究中,我们发现,尽管25 ng / ml厘米有一些影响,进一步激活CD137不稳定而10 ng / ml厘米预处理。这些差异的原因可能是由于厘米或细胞状态的实际浓度。此外,我们发现由CD137 VSMCs诱导信号的反应可能会依赖于CM浓度。例如,VSMCs被高浓度的CM (25 ng / ml, 50 ng / ml)甚至可能执行CD137信号被激活时相反的效果。在图4,我们显示一个相反的趋势在表型转换标记细胞进行预处理时ng / ml 50厘米。同样的现象也存在于细胞迁移和- 2分泌。
因此,我们的数据表明,CM方法预处理的效果之前CD137激活试验严格依赖于细胞因子浓度,浓度不当甚至可能干扰CD137函数。值得一提的是,Olofsson和荣格发现CD137 VSMCs信号激活诱导VSMC凋亡,但我们观察到轻微的增加通过CCK-8测定细胞生存能力。的差异也可能归因于厘米预处理的不稳定性。
在本文中,我们研究了不同聚合物的CD137的功能和执行一个调查进一步验证和改进的CM VSMCs CD137信号处理方法研究。我们发现10 ng / ml厘米预处理比其他更合理的浓度在VSMCs当探索CD137函数。结果可能帮助我们选择一个更好的条件学习时CD137信号的机制。超过这一点,炎性细胞因子之间的关系和CD137激活可能是考虑将来诊所CD137抗体在肿瘤治疗中避免副作用比如或其他炎症相关的疾病。
相互竞争的利益
作者没有利益冲突声明。
确认
这个项目是江苏省自然基金(BK20161355)和中国国家自然科学基金(81670405,81670405)。