文摘

氧化应激引起内质网(ER)压力诱导的蛋白质反应(UPR)在肺部的慢性阻塞性肺(COPD)科目。的抗氧化剂,谷胱甘肽peroxidase-1 (GPx-1)计数器香烟烟雾暴露引起的氧化应激。在这里,我们调查是否GPx-1表达阻止了UPR后暴露于香烟烟雾中。表达ER应激标记进行完全分化正常的人类支气管上皮细胞(NHBE)隔绝不吸烟,吸烟,慢性阻塞性肺病捐助者和redifferentiated空气液体界面。NHBE细胞慢性阻塞性肺病捐助者表示高度ATF4 XBP1, GRP78、GRP94, EDEM1,切相比,细胞不吸烟的捐助者。这些变化与此同时减少GPx-1表达式。再引入GPx-1进入NHBE细胞与慢性阻塞性肺病捐助国减少了UPR隔离。确定GPx-1表达式的损失有直接影响这些ER应激标记在烟雾暴露,Gpx- - - - - -1−−/老鼠被暴露于香烟烟雾为1年。的损失Gpx- - - - - -1表达增强香烟烟雾诱发ER应激和凋亡。同样,ER应激与衣霉素诱导表达增强抗氧化剂在鼠标展示肺片。烟雾吸入也加剧了UPR响应在呼吸道合胞病毒感染。因此,ER应激可能是一个在慢性阻塞性肺病antioxidant-related病理生理活动。

1。介绍

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是美国的第三大死因(1),吸烟是最重要的环境危险因素。香烟烟雾吸入改变了表达谱的氧化剂和抗氧化剂在肺部并产生一个巨大的氧化剂负担(2]。抗氧化酶对抗氧化应激(2)和阻止肺部炎症反应通过针对多个信号通路(3]。排毒活性氧(ROS)是一种治疗策略限制香烟烟雾诱发疾病的组织损伤(3]。最近,香烟smoke-mediated氧化应激诱导内质网(ER)展示了压力(4]。然而,抗氧化剂对抗ER应激的能力并没有得到充分的特点。

完善,香烟烟雾诱发ER应激激活的蛋白质反应(UPR) [5- - - - - -9]。然而,慢性阻塞性肺病是一个复杂的异构疾病和UPR在疾病的意义和强度是未知的。UPR是一个复杂的应力响应程序,调节多种细胞反应和生存,通过调节蛋白质合成、折叠和降解10]。三个主要途径的UPR特征:(i) PKR-like ER激酶(活跃)/ eIF2α4 /激活转录因子(ATF) /切,(ii) inositol-requiring酶1 (IRE1) / x - box结合蛋白1 (XBP1),和(3)ATF6通路11]。这些通路调节ER伴侣的反应和减少细胞蛋白质翻译后的压力12]。然而,持续的ER应激导致的重要表达proapoptotic基因C / EBP同源蛋白(切),导致细胞死亡(11]。我们以前接触表明,烟触发一个小主细胞ER应激反应和啮齿类动物模型5]。然而,可能需要二次侮辱激起巨大的烟雾诱发UPR。

我们组表明,过度的谷胱甘肽过氧化物酶(GPx) 1,硒蛋白家族的一员,防止香烟烟雾诱发空气空间扩大在老鼠13]。GPx-1是最丰富的GPx同种型在真核细胞和缺乏这种酶会导致内皮功能障碍(14和细胞凋亡15]。GPx-1不足也被实现为一个贡献者动脉粥样硬化(16]。Gpx- - - - - -1有缺陷的小鼠暴露于香烟烟雾更容易受到香烟烟雾诱发肺部炎症和肺气肿(13,17]。氧化应激诱导ER应激(4)和ER的表达增加压力标记是在吸烟者的肺8]。GPx-1表达,然而,减少在COPD的肺13]。因此,我们推测,GPx-1可以调节ER应激反应与COPD的发病机制有关。

在视图之间的潜在联系GPx-1和香烟smoke-mediated UPR我们探索GPx-1表达式的损失是否提高了UPR,导致肺细胞损伤和死亡。使用正常的人类支气管上皮细胞(NHBE)从非吸烟者,吸烟,慢性阻塞性肺病和主题,我们发现ER应激标记显著升高细胞与COPD受试者和增加恰逢GPx-1表达减少。重新GPx-1到这些细胞抑制了UPR。直接确定肺部GPx-1损耗提高ER应激,Gpx-1−−/老鼠被暴露于香烟烟雾为1年。有趣的是,失去GPx-1表达激活的所有三个分支UPR活跃/ eIF2α/ ATF4 /切,IRE1 / XBP1, ATF6。这UPR恰逢高架肺细胞死亡Gpx-1−−/老鼠接触后烟。有趣的是,展示肺片(pcl)小鼠高架GPx蛋白质诱导后ER应激。这些发现表明,改变GPx-1表达COPD肺有助于提高ER应激。此外,早期感应ER应激诱发的抗氧化剂来对抗氧化应激反应,从而限制了UPR。

2。材料和方法

2.1。人类主要气道细胞

NHBE细胞不吸烟者,吸烟和慢性阻塞性肺病患者分离出人类的肺。肺器官捐赠者获得的肺移植(见表被拒绝1人口统计)。同意研究生命联盟获得的器官恢复机构迈阿密大学的。所有同意IRB-approved,符合《赫尔辛基宣言》。从捐助者与慢性阻塞性肺病、肺图表中列出的诊断是死亡前的捐赠,我们证实了macropathological存在在这些肺肺气肿。所有COPD受试者吸烟史。NHBE细胞隔绝不吸烟,吸烟者,并且肉瘤COPD受试者通过扩张和redifferentiated处于气液界面(ALI) 24日毫米不知道过滤器(美国纽约配角康宁,康宁)在37°C, 5%的公司2,如前所述18]。收集细胞对蛋白质和RNA分析。CD45和CD11C表达式分析了决定一个低水平的炎性细胞污染和证实NHBE细胞纯度。完全分化NHBE细胞不吸烟者也暴露于香烟烟雾使用Vitrocell VC-10吸烟机器人(Vitrocell系统GMBH, Waldkirch,德国)。四个烟熏根据ISO标准3308:6个泡芙/香烟每粉扑35毫升容量和等待时间之间的60秒。NHBE细胞暴露每隔一天,分开三天、4香烟。NHBE细胞的RNA提取定量PCR (qPCR)分析。的一个子集从COPD受试者NHBE细胞蛋白转染2μ人类GPx-1 g蛋白质或白蛋白(从信号奥尔德里奇)使用皮尔斯转染试剂(ThermoFisher科学)如前所述13,19]。RNA和蛋白质是收集24小时后。人类RSV病毒A2(写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州;# vr - 1540)是感染NHBE细胞如前所述[20.]。RNA和蛋白质是收集24小时后。

表1
供体上皮细胞的人口。
2.2。动物模型

Gpx-1−−/C57BL / 6小鼠饲养×CBA / J背景。八周大野生型和Gpx-1−−/老鼠用于所有实验。所有的老鼠都保持在一个特定的无菌设施在哥伦比亚大学。8-week-old,雄性和雌性老鼠在起始点用于所有实验,每个实验参数至少有10动物/组。老鼠被暴露于香烟烟雾室(美国爱尔兰人企业,戴维斯,CA)每天4小时,每周5天在总颗粒物浓度为80毫克/米3。烟雾暴露持续了1年。肯塔基大学的参考研究香烟3 r4f(美国肯塔基州列克星敦)是用于生成烟。另一组野生型动物感染1×106pfu RSV的6个月后暴露于室内空气或吸烟。研究所实验动物保健和使用委员会批准的哥伦比亚大学。本研究进行了严格按照指南中建议实验室动物保健和使用的美国国立卫生研究院和机构的动物保健和使用委员会(IACUC)的指导方针。

2.3。展示肺片(pcl)

鼠标展示肺片(pcl)准备如前所述21,22]。简单地说,老鼠安乐死,气管插管,动物被割颈静脉抽血。肺部是通过套管1.5毫升低熔点琼脂糖溶液(1.5%最终浓度的琼脂糖在PBS)。肺是放在冰15分钟来巩固琼脂糖。叶分离和组织核心准备个人的叶,后叶切片厚度300μ米使用Krumdieck组织切片机(美国阿拉巴马州研发、Munford,艾尔)厄尔的平衡盐溶液(西格玛奥德里奇)。组织切片在杜尔贝科的修改鹰孵化中/营养混合物F-12火腿的解决方案(西格玛奥德里奇)37°C下在潮湿的气氛中5%的股份有限公司2空气/ 95%。将琼脂糖和细胞碎片,片每30分钟洗了2个小时。pcl在DMEM培养补充与青霉素(100 U /毫升)和链霉素(100μg / mL) (Gibco®被生活技术)。片培养在37°C下在湿润的气氛中5%的股份有限公司2/ 95%空气6-well组织培养板,使用3片/。与1片治疗μ米衣霉素(西格玛奥德里奇)24小时。评估pcl的生存能力受到衣霉素、乳酸脱氢酶(LDH)释放pcl进入孵化介质进行了分析。最大LDH释放是由溶解3片和1% Triton x - 100 30分钟37°C。LDH释放决定使用一种分析西格玛奥德里奇。

2.4。qPCR分析

总RNA分离细胞和小鼠肺组织使用试剂盒RNeasy迷你工具被制造。基因转录水平的老鼠和人类特定的排骨,ATF4, XBP1, GRP78、GRP94, EDEM1, GPx-1, GPx-2, GPx-3, GPx-4, il - 6, ACTB实时PCR使用量化的Bio-Rad CFX384实时系统(Bio-Rad)。TaqMan®基因表达分析从应用生物系统公司购买(见下表2详情)。②数据表示为相对量化ACTB纠正。XBP1拼接也检查NHBE细胞使用以下引物:5′-TTA CGA GAG AAA行动猫GGC-3′, 5′-GGG太极拳亚美大陆煤层气有限公司TTG苑AGA ATG c - 3′。XBP1 PCR产品解决,运行在2.5%琼脂糖凝胶23]。289年和286年碱基对扩增子生成unspliced和拼接XBP1的分别。百分比XBP1的切片进行检测的微密度分析unspliced (XBP1u)和拼接(XBP1s) XBP1的扩增子,使用Bio-Rad实验室图像实验室软件(版本4.0,建立16)。

表2
基因表达分析TaqMan调查细节。
2.5。免疫印迹

单层细胞被取消在寒冷的磷酸盐和resuspended在100年μL的蛋白质裂解缓冲(50毫米玫瑰,pH值7.5,150毫米氯化钠,特里同x - 100 1%, 1%的甘油,EDTA 1毫米,10毫米氟化钠,2μg / mL亮抑酶肽,1μg / mL抑肽素10毫米Na3签证官41毫米phenylmethylsulfonyl氟化物),20μg蛋白质分离12% SDS-polyacrylamide凝胶和转移到硝化纤维膜。兔抗体砍(细胞信号;# 5554),ER degradation-enhancingα-mannosidase-like (EDEM)(圣克鲁斯生物技术;pho-eIF2 sc - 27389)α(Ser51)(细胞信号;# 9721),eIF2α(细胞信号;# 9722),pho-PERK (Thr980)(细胞信号;# 3179),活跃(细胞信号;# 5683),XBP-1(细胞信号;# 12782),IRE1α(细胞信号;# 3294),毕普/ GRP78(细胞信号;# 3183),GRP94(细胞信号;# 2104),ATF4(细胞信号;# 11815),ATF6 (Abcam;# ab11909)、GPx-1(细胞信号;# 3206),GPx-2 (Abcam;# ab140130), GPx-3 (Abcam;# ab27325)、GPx-4(细胞信号;# 2104)β肌动蛋白(细胞信号;# 4970)与增强化学发光检测试剂(皮尔斯)。化学发光检测执行使用Bio-Rad实验室分子成像仪ChemiDoc XRS +成像系统。微上执行的每个目标,表示为一个像素强度的比率相比,总蛋白质或β肌动蛋白,使用Bio-Rad实验室图像实验室软件(版本4.0,建立16)。

2.6。统计分析

数据表示为点阴谋手段±SEM高亮显示。通过学生的两组之间的差异比较 测试(双尾)。以上两组实验分析与图基的双向方差分析事后测试分析。 意义的值被设定在0.05和所有重要的变化被发现 。所有使用GraphPad棱镜分析软件(版本6.0 h为Mac OS X)。

3所示。结果

3.1。NHBE细胞与慢性阻塞性肺病捐赠者表达比细胞ER应激标记吸烟者

我们组之前证明未分化NHBE细胞ER应激增加趋势在暴露于香烟烟雾提取物(CSE) [5]。检查是否完全分化NHBE细胞培养在气液界面(ALI) UPR抽烟,NHBE细胞不吸烟者暴露在0(室内空气,RA)或重复暴露于四香烟(CS)使用Vitrocell VC-10吸烟机器人(数字1(一)- - - - - -1 (b))。重复暴露进行最大化烟雾刺激没有诱导细胞凋亡,由LDH释放化验(图1(一))。il - 6基因表达是用作积极控制充分暴露在烟(20.)(图1(一))。CD45和CD11C表情分析却发现低于显著放大水平从而证实了低水平的炎性细胞污染(数据没有显示)。基因表达水平的ATF4 XBP1, GRP78、GRP94 EDEM1,和切被检查。这些目标是读数的UPR的三个主要途径。没有显著改变ER应激标记后烟雾暴露(图1 (b)),正如我们先前所描述的水下培养NHBE细胞(5]。然而,当比较相同的ER应激标记NHBE细胞与不吸烟者,吸烟,慢性阻塞性肺病和捐助者的表情ATF4,XBP1,GRP78,GRP94,EDEM1,和切慢性阻塞性肺病都增加了细胞分离对象(图1 (c))。EDEM1基因表达显著增强细胞中分离出吸烟者(图1 (c))。有增加趋势变化从吸烟者ER应激标记细胞。蛋白质分析也证实ATF4表达的增加,IRE1α,GRP78、GRP94 EDEM,砍在细胞与COPD受试者(图2(a))。同样,高架的磷酸化eIF2和活跃只观察细胞与慢性阻塞性肺病捐助者(图2(a))。

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图1
NHBE细胞与慢性阻塞性肺病捐助者增强ER应激反应相比,不吸烟者和吸烟者。(一)完全分化NHBE细胞不吸烟的个人( )暴露于室内空气(RA)或香烟(CS)从4香烟每隔一天(3曝光)使用Vitrocell VC-10吸烟机器人。LDH释放到媒体和il - 6基因表达检测。(b)基因的表达ATF4,XBP1,GRP78,GRP94,EDEM1,和切是检查。(c)完全分化NHBE细胞不抽烟(NS),吸烟者(SM)和慢性阻塞性肺病(COPD)个人( 捐助者/组)基因表达的检测ATF4,XBP1,GRP78,GRP94,EDEM1,和切。②点图表示为相对量化相比ACTB表达式显示为均值±SEM,其中每个测量独立进行3天6捐助者/组。 表示 值< 0.05,当比较两种治疗由线连接,由学生的决定 以及(2组)或与图基的双向方差分析事后测试(> 2组)。


图2
NHBE细胞与慢性阻塞性肺病捐助者增强ER应激蛋白质反应相比,不吸烟者和吸烟者。蛋白质来自完全分化NHBE细胞不吸烟者(NS),吸烟者(SM)和慢性阻塞性肺病(COPD)个人( 捐助者/组)。(一)蛋白表达ATF6 ATF4, GRP78、GRP94, EDEM,排骨,β肌动蛋白免疫印迹了。磷酸化elF2和活跃也决定。(b) XBP1拼接在XBP1放大检查cDNA从NHBE细胞不抽烟(NS),吸烟者(S),慢性阻塞性肺病(COPD)的个人。XBP1的蛋白表达β肌动蛋白免疫印迹了。(一)——(b)为每一个污点或凝胶,每车道代表单个细胞捐献者。微密度分析的XBP1s DNA通过分析免疫印迹凝胶和其他目标。XBP1切片被列为XBP1s XBP1总数的百分比。点图表示为微单元(DU)的像素强度表示为一个比例β肌动蛋白或总elF2和活跃。数据显示为均值±SEM,每个测量独立进行3天6捐助者/组。 表示 值< 0.05,当比较两种治疗由线连接,由双向方差分析的图基的决定事后测试(> 2组)。

XBP1坐标的适应性UPR中扮演至关重要的角色维护功能。细胞基因表达结果表明NHBE隔绝COPD受试者增强XBP1信使rna剪接细胞相比,不吸烟者和吸烟者(图2(b)),展示活动XBP1信号;细胞内蛋白质分析也证实了增加XBP1的表达与慢性阻塞性肺病捐助者(图2(b))。总的来说,疾病状态容易使NHBE细胞增强ER应激。另一方面,急性烟雾暴露只有轻微影响ER应激。

3.2。GPx-1调节切NHBE细胞表达与慢性阻塞性肺病

由于氧化应激诱发ER应激(4),GPx-1表达式是减少COPD肺(13],GPx-1缺乏易感性增加香烟烟雾诱发肺气肿(13,17),我们检查GPx-1表达式是否改变了在完全分化NHBE细胞与不吸烟者,吸烟,慢性阻塞性肺病捐助者(图3)。GPx-1表达式持平在NHBE细胞不吸烟者暴露于香烟烟雾(图3(一个))。NHBE细胞不吸烟者和吸烟者表示类似的GPx-1级别(数字3 (b)- - - - - -3 (c))。然而,细胞与COPD受试者显著降低GPx-1表达,证实了q-PCR(图3 (b))和免疫印迹(图3 (c))。因此,疾病状态容易使NHBE细胞抑制GPx-1表达式。

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图3
重新GPx-1 NHBE细胞从慢性阻塞性肺病捐助者制服UPR孤立。(一)基因的表达GPx-1确定完全分化NHBE细胞不吸烟的个人( 暴露于室内空气(RA)和香烟(CS;每隔一天从4支(3曝光))使用Vitrocell VC-10吸烟机器人RNA (b)和(c) GPx-1表达的蛋白进行了分析从完全分化NHBE细胞不抽烟(NS),吸烟者(SM)和慢性阻塞性肺病(COPD)个人( 捐助者/组)。(d) NHBE细胞与COPD受试者与白蛋白或GPx-1蛋白质和转染切表达式由qPCR决定。(e)免疫印迹和相应的微密度分析切,Gpx-1,β从NHBE细胞肌动蛋白白蛋白或GPx-1蛋白转染后COPD受试者。在每个免疫印迹,每车道代表单个细胞捐献者。数据显示为均值±SEM,每个测量独立进行3天6捐助者/组。 代表一个 值< 0.05,当比较两种治疗由线连接,由学生的决定 以及(2组)或与图基的双向方差分析事后测试(> 2组)。

是否恢复NHBE GPx-1水平细胞COPD受试者会扭转高度UPR我们protein-transfected GPx-1蛋白质成NHBE细胞从COPD受试者。白蛋白是转染消极的控制。转染的GPx-1显著降低切基因(图3 (d)(图)和蛋白质3 (e))从COPD受试者NHBE细胞中表达。因此,GPx-1 UPR在肺部的一个强有力的监管机构。

3.3。病毒性肺提高UPR的发作

确定第二个环境暴露可能会改变UPR在我们的模型中,我们被感染NHBE细胞和小鼠呼吸道合胞体病毒(RSV)。病毒感染的发病机制涉及慢性阻塞性肺病急性加重(24,25]也触发UPR [26]。RSV感染减少GPx-1表达式并切NHBE细胞中表达显著增强各学科组(数字4(一)- - - - - -4 (b))。类似的变化无常GPx-1表达观察小鼠的肺部感染RSV(数字4 (c)- - - - - -4 (d))。重要的是,之前暴露于香烟烟雾中提高了UPR相比,动物也感染RSV感染动物暴露于室内空气(RA)(图4 (d))。因此,吸烟者的肺和COPD受试者可能对病毒感染诱导ER应激更敏感,这可能影响疾病进展。

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图4
RSV感染增强了UPR的肺。(一)GPx-1和切NHBE细胞基因表达测定隔绝不抽烟(NS),吸烟者(SM)和慢性阻塞性肺病(COPD)个人( 捐助者每组)由qPCR模拟RSV感染和分析。(b)的蛋白表达GPx-1 ATF6, ATF4,排骨,β肌动蛋白免疫印迹了。(c)野生型小鼠暴露于香烟烟雾或室内空气6个月,随后感染1×106空斑形成单位RSV。动物安乐死(0,1,3,5,7,9天后感染(dpi)和Gpx-1和切表达式是由qPCR决定。(d)蛋白的表达GPx-1、ATF6 ATF4,排骨,β肌动蛋白免疫印迹了。数据显示为均值±SEM,每个测量独立进行3天。 代表一个 值< 0.05,当比较两个连接一条线或同一治疗感染,由学生的决定 以及(2组)或与图基的双向方差分析事后测试(> 2组)。
3.4。Gpx-1−−/老鼠ER应激和凋亡加剧香烟烟雾暴露

确定的损失GPx-1表达直接影响ER应激后吸入香烟烟雾在活的有机体内我们检查了ER应激标记Gpx-1−−/小鼠和野生型的同胞暴露在香烟烟雾中1年。我们之前证明损失的Gpx-1老鼠表达导致增强的空气空间扩大和炎症长期吸烟暴露后(13]。表达水平的Atf4,Xbp1,Grp78,Grp94,Edem1,和切在检查Gpx-1−−/和野生型小鼠。长期暴露于香烟烟雾中并没有显著提高ER应激标志表达野生型小鼠的肺(图5(一个))。我们以前观察到类似的结果在野生型小鼠(5]。然而,Gpx-1−−/小鼠暴露于香烟烟雾增强基因表达的Atf4,Xbp1,Grp78,Grp94,Edem1,和切(图5(一个))。同样,损失Gpx-1表达ATF4导致肺组织蛋白水平升高,XBP1, GRP78、GRP94, EDEM,切后烟雾暴露(图5 (b))。微分析证实肺ATF4水平明显增加,XBP1, GRP78、GRP94, EDEM,插嘴Gpx-1−−/小鼠暴露于香烟烟雾(图5 (b))。

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图5
Gpx-1缺乏小鼠肺ER应激增高后暴露于香烟烟雾中。Gpx-1 −−/和野生型小鼠暴露于香烟烟雾每日1年。(一)肺癌的基因表达切,Atf4,Edem1,Grp78,Grp94,和Xbp1是检查。(b)免疫印迹进行整个肺的蛋白质对砍,ATF4, EDEM, GRP78、GRP94, XBP1。点图表示为(a)相对量化(RQ)相比ACTB表达式或(b)微单元(DU)的像素强度表示为一个比例β肌动蛋白。每一个车道代表一个单独的老鼠。数据显示为均值±SEM,每个测量独立进行3天6捐助者/组。 代表一个 值< 0.05,当比较两种治疗由线连接,由双向方差分析的图基的决定事后测试(> 2组)。

长期激活砍的ER应激可以导致细胞凋亡。结构和增加免疫细胞凋亡也观察到在COPD肺(27]。因此,我们检验Gpx-1−−/小鼠暴露于香烟烟雾中升高细胞凋亡。Gpx-1−−/小鼠暴露于香烟烟雾增强肺细胞凋亡,观察到通过TUNEL caspase-3乳沟,乳酸脱氢酶(LDH)释放化验(图6)。Gpx-1−−/小鼠暴露于香烟烟雾展出TUNEL阳性细胞(图的最高频率6(一))。增强caspase-3乳沟被观察到Gpx-1−−/小鼠暴露于香烟烟雾(图6 (b))。此外,高浓度的LDH BALF的观察Gpx-1−−/小鼠暴露于香烟烟雾而其他组(图6 (c)),这表明增强细胞膜损伤肺。因此,增强肺部细胞凋亡可能导致肺改造和未能明确凋亡细胞可能导致肺部炎症。

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图6
Gpx-1缺乏小鼠肺ER应激增高后暴露于香烟烟雾中。Gpx-1 −−/和野生型小鼠暴露于香烟烟雾每日1年。(一)TUNEL分析各组小鼠的肺组织。(b)增强肺组织caspase-3乳沟恰逢(c) LDH BALF的升高Gpx-1 −−/暴露于香烟烟雾。每个车道(b)代表一个单独的鼠标和微单元(DU)的像素强度表示为一个比总caspase-3水平。点图表示为±SEM,其中每个测量独立进行3天6捐助者/组。 代表一个 值< 0.05,当比较两种治疗由线连接,由双向方差分析的图基的决定事后测试(> 2组)。
3.5。触发了UPR增强GPx-1、GPx-2 GPx-4表达鼠标展示肺片

在Gpx-1和Gpx-2双基因敲除小鼠,凋亡细胞增加回肠隐窝(28),这表明GPx蛋白调节细胞凋亡。然而,ER应激对GPx蛋白质的影响没有直接调查。确定的影响ER强调GPx-1表达式,鼠标展示肺片(pcl)暴露在ER应激诱导物,衣霉素为24小时。衣霉素的浓度测试没有诱导LDH释放pcl(图7(一)),表示没有诱导细胞凋亡。衣霉素诱导的所有三个分支UPR和切表达在pcl(数字7 (b)- - - - - -7 (c))。衣霉素增强基因(图7 (b)(图)和蛋白质7 (c))表达ATF4 XBP1 ATF6,砍在pcl。有趣的是,衣霉素诱导GPx-1、GPx-2 GPx-4基因(图7 (d)(图)和蛋白质7 (e)在pcl)表达式。因此,急性ER应激诱发的抗氧化剂来对抗进一步的氧化剂和ER的表达压力。

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图7
ER应激的影响衣霉素对小鼠抗氧化剂表达谱展示肺片(pcl)。pcl得到从野生型小鼠暴露于衣霉素(1μ米)为24小时。(一)LDH释放到媒体和(b)切,Atf4,Atf6,和Xbp1基因表达检测。(c)进行了免疫印迹切,Atf4,Atf6、Xbp1 andβ肌动蛋白。(d)GPx-1, GPx- - - - - -2、GPx- - - - - -3、GPx- - - - - -4,和Sod1被qPCR量化和(e)免疫印迹分析。每一个车道代表一个单独的老鼠。②点图表示为相对量化相比ACTB表达式或微单元(DU)的像素强度表示为一个比例β肌动蛋白。数据显示为均值±SEM,每个测量独立进行3天6捐助者/组。 代表一个 值< 0.05,当比较两种治疗由线连接,由学生的决定 以及(2组)。

4所示。讨论

吸烟是最相关的环境危险因素与慢性阻塞性肺病的发展有关。然而,烟雾吸入研究问题作为长期吸烟暴露引发疾病的形成需要在动物模型和二次事件可能需要模仿人类的疾病状态。我们观察到的损失GPx-1表达增强了香烟烟雾诱发ER应激。GPx-1调节UPR烟雾暴露后,我们发现GPx-1本身的表达是由急性ER应激刺激。NHBE细胞与慢性阻塞性肺病捐助者表示GPx-1大大减少,伴随着提高UPR。重新GPx-1蛋白质成NHBE细胞与慢性阻塞性肺病捐助国减少了UPR。RSV感染导致肺GPx-1表达式,在肺部暴露于烟雾和夸大恰逢UPR升高。Gpx-1−−/老鼠表现出更强的UPR和随后的增强细胞凋亡后长期吸烟暴露。有趣的是,引发急性ER应激小鼠的肺中产生一种强有力的抗氧化剂的反应。这种抗氧化反应是减少COPD肺(29日),这可能解释了UPR NHBE细胞与COPD受试者中观察到。的确切作用提高UPR在慢性阻塞性肺病的发展仍不能完全肯定。然而,我们已经证实GPx-1的损失在活的有机体内导致显著增加在所有三个分支的UPR(见图8提出了信号方案),这正好与增强细胞凋亡和小鼠的肺组织破坏13]。我们的研究结果表明,GPx-1显著调节UPR在慢性阻塞性肺病和增强GPx-1抵消了UPR的表达式可能可行的方式和肺损伤反应,这种疾病的发病和进展。

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图8
可能的信号机制GPx-1 UPR的监管。在这项研究中提出的证据表明,接触后烟GPx-1防止ER应激(a)。然而,在疾病状态GPx-1表达减弱,导致增强的UPR (b)。RSV感染明显有助于减少伴随着提高UPR GPx-1表达式。

多项研究利用Gpx-1−−/和转基因小鼠的保护作用GPx-1对抗氧化损伤和细胞死亡由活性氧(13,30.]。GPX-1活动也会影响蛋白激酶磷酸化(31日)和NF - oxidant-mediated激活κB (32]。在当前的研究中,GPx-1 NHBE细胞显著减少隔绝COPD受试者相比,不吸烟者和吸烟者。其他人已经报道,GPx-1表达式的改变不影响其他硒蛋白的mRNA表达或活动(33),这表明任何补偿其他硒蛋白的表达后失去GPx-1表达式。目前吸烟的机制调节GPx-1表达尚未完全阐明,但考虑到我们GPx-1恢复数据的进一步分析GPx-1监管是至关重要的。GPx-1表达式和活动已报告由Nrf2 [34),转录因子TFAP2C (35),CpG GPx-1启动子的甲基化(35),bcr - abl / mTOR [36],硒[37),雌激素(38],腺苷[39),Sec-insertion序列(seci)因素40),表皮生长因子受体(41),和同型半胱氨酸42]。具体来说,肺内烟雾暴露期间,辛格等人表现GPx-1表达在一个月后的肺香烟烟雾暴露Nrf2[监管的34]。然而,Nrf2表达式是迷失在COPD受试者表明这个次要的事件可能导致GPx-1表达减少,加剧了ER应激。老鼠失去Nrf2结果在加强对香烟烟雾43,44和弹性蛋白酶45)诱导小鼠肺气肿。然而基因组研究Nrf2−−/鼠标样品表明,Nrf2可能调节其他GPx基因但不是GPx-1 [46]。RSV感染是否会改变GPx-1表达式以类似的方式调节慢性吸烟是未知的。有趣的是,UPR在RSV感染可以对抗病毒的扩散26]。进一步研究的规定GPx-1烟雾暴露和慢性阻塞性肺病和ER应激在肺部的意义是必需的。这将是一个主要领域为我们的未来的工作。

自从GPx-1表达调节的所有三个分支UPR GPx-1可能影响的共同中介UPR或单独每个分支。离解的GRP78 /毕普ER应激是所有三个分支的UPR所需。GPx-1 GRP78的表达直接调控基因表达。然而,是否GPx-1影响GRP78离解ER应激期间是未知的。直接与活跃(Nrf2交互47)和可能发挥重要作用从而调节UPR GPx-1表达式。ER应激诱导物,thapsigargin,诱发Nrf2 16-HBE细胞蛋白的生产(47),这表明UPR诱发Nrf2回应反向ER应激。我们观察到类似的效果在pcl GPx-1表达式后衣霉素治疗。同样,XBP1调节几种抗氧化剂,包括过氧化氢酶、SOD1,硫氧还蛋白TRX1 [48]。然而,XBP1并不规范GPx蛋白(48),但XBP1表达式由GPx-1监管。XBP1调节基因,EDEM1,也增强Gpx-1−−/暴露在烟雾下的老鼠,这进一步证实GPx-1 XBP1的监管信号。ATF6需要对高尔基体进行易位乳沟和随后的易位细胞核作为转录因子(49]。是否GPx-1调节这个信号尚未确定。这种抗氧化剂之间的串扰信号和UPR部分迷失在慢性阻塞性肺病,可能扮演一个关键的步骤,这一疾病的发病机理。

UPR在细胞凋亡的作用依赖于刺激,暴露时间和强度的信号。失去GPx-1表现直接影响细胞死亡和细胞死亡是COPD恶化的一个重要因素50]。烟雾诱发细胞凋亡与几个有关流程、神经酰胺等信号(51),有关分子模式分子(抑制)52),肿瘤坏死factor-related凋亡诱导配体(TRAIL) [53]。的损失Gpx-1加剧了香烟烟雾诱发小鼠的细胞凋亡,表明Gpx-1−−/基因型恶化细胞死亡至少部分通过归纳UPR。我们组也曾表明GPx-1调节激活蛋白酪氨酸磷酸酶1 b(应用PTP1B)和蛋白磷酸酶2 (PP2A) [13]。这两种磷酸酶可能影响烟雾诱发细胞生存54,55]。同样,Nrf2缺乏细胞进行增强细胞死亡后暴露在ER应激(47),这可能是依赖GPx-1表达式。因此,本文提供的数据表明,增强切表达NHBE细胞和小鼠的肺可能导致细胞凋亡。其他的研究还表明,某些元素的UPR在其他器官几个凋亡和抗炎作用。从CSE-induced XBP1减少CSE-induced剁碎,从而保护细胞凋亡在视网膜色素上皮细胞(RPE)细胞株56通过调节eIF2)α和p38磷酸化4]。切损失加剧了细胞死亡的Nrf2差别通过对这些基因的表达在RPE细胞(4]。切缺乏提高海马细胞凋亡和受损的老鼠与内存相关的行为表现与衣霉素治疗(57]。最近,缺乏砍夸张的脂多糖(LPS)诱导小鼠的炎症和肾损伤(58]。ER应激的重要性和每个成员的角色的UPR在肺部疾病的发展仍然完全解决。然而,我们已经表明,提高UPR恰逢恶化的症状与GPx-1的表情反驳老鼠。

5。结论

我们证明GPx-1 NHBE细胞表达降低COPD受试者隔绝,GPx-1是一个主要的监管机构的UPR在烟雾暴露条件下,和急性ER应激诱发肺GPx-1表达式。在一起,我们的数据表明,GPX-1表达式的损失在COPD肺可以通过提高UPR导致疾病进展。这些研究表明,加强GPX-1活动可能是一种有效的治疗方法,防止损伤引起的UPR的肺。

相互竞争的利益

所有的作者有一个金融与商业实体的关系感兴趣的主题这手稿。

确认

这项工作是提供给帕特里克Geraghty赠款支持(空姐医学研究所(113380)YCSA),罗伯特·f·Foronjy(美国国立卫生研究院5 r01hl098528-05空姐医学研究所(130020年CIA)),萨拉瑟博士(Matthias a .空姐医学研究所中央情报局103027年和130033年;詹姆斯和以斯帖国王生物医学研究项目的FL 5 jk02),和珍妮·m·D 'Armiento (R01 HL086936-07)。