文摘

肿瘤坏死因子(TNF) receptor-associated因子5 (TRAF5)是肿瘤坏死因子受体超家族成员,是重要的关键中介T辅助(Th)细胞免疫和多个信号通路的调控。澄清TRAF5对炎症性肠病(ibd)的影响,我们研究了TRAF5缺乏对葡聚糖硫酸酯钠的影响——(DSS)诱导结肠炎。结肠炎是诱导TRAF5淘汰赛(KO)及其野生型小鼠(WT)同窝出生的口头管理3% DSS 7天。老鼠被牺牲了,他们的冒号被移除。我们的数据表明,KO小鼠更容易DSS-induced结肠炎。TRAF5缺乏显著提高干扰素-γ、il - 4和IL-17a信使rna和蛋白质水平的冒号DSS-fed老鼠,和mRNA表达T-bet GATA-3也明显升高。然而,ROR -α和ROR -γt mRNA水平没有差异DSS-induced KO和WT老鼠。流式细胞仪显示Th2和干扰素-频率增加γ/ IL-17a-coproducing CD4+冒号DSS-induced KO小鼠T细胞。此外,TRAF5缺乏显著增强NF -的激活κB在CD4+DSS政府后T细胞。这些结果表明TRAF5缺乏显著加剧DSS-induced结肠炎,最有可能通过调节细胞介导炎症。

1。介绍

炎症性肠病(ibd)包括克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)是胃肠道的慢性和复杂的炎症性疾病(1]。尽管炎症性肠病的确切病因仍然是难以捉摸的,众多研究表明,CD4细胞+辅助T细胞(Th)扮演重要角色在ibd的感应和维护2,3]。Th细胞通常分为三个子集:Th1、Th2, Th17。加州大学通常被认为是一个th2型疾病,所表示的水平升高interleukin-4 (il - 4)、IL-5, IL-13。相比之下,在CD,有人建议,Th1和Th17细胞发挥重要作用在疾病的发展4- - - - - -6]。

喂养小鼠与葡聚糖硫酸酯钠(DSS)解决方案连续几天可以诱导急性结肠炎,特点是腹泻、直肠出血,体重损失,缩短结肠粘膜溃疡。这个相对简单和可复制的方法化学结肠炎小鼠诱导已经被广泛地应用于人类炎症性肠病的实验动物模型,尤其是加州大学(7,8]。

肿瘤坏死因子(TNF) receptor-associated因素(TRAFs)代表一群重要信号传感器il - 1、TNF, toll样受体(TLR)总科。结构,TRAFs包含一个氨基半胱氨酸/问题区域的同源区域以及糖基(9]。众多研究表明,TRAFs参与多种生理功能,如肿瘤发生、压力反应,先天免疫和适应性免疫10- - - - - -13]。到目前为止,七个成员,名叫TRAF1 TRAF7, TRAF家族已确定,尽管TRAF5是相对较少的理解9,14]。尽管TRAF5股票与TRAF3明显的结构性同源性,它的分子功能是最相似的TRAF2 [13,15,16]。与小鼠缺乏TRAF2或TRAF3过早死亡,TRAF5敲除小鼠(KO)蓬勃发展和显示没有明显异常的迹象(17]。TRAF5被建议的重要调节器Th细胞免疫力,也扮演着重要的角色在中介核factor-kappa (NF - BκB)信号通路(15,18- - - - - -22]。然而,的具体贡献TRAF5 ibd仍不清楚。

在目前的研究中,第一次,我们使用3% DSS诱导急性结肠炎TRAF5 KO小鼠和野生型(WT)同窝出生决定的具体角色TRAF5在炎症性肠病的发病机制。

2。材料和方法

2.1。道德声明

在我们的研究中,所有的动物实验根据指南中的建议武汉大学的护理和使用实验动物,和协议批准武汉大学动物实验的伦理委员会。

2.2。动物

育种对TRAF5 KO小鼠C57BL / 6(背景)是一个慷慨的礼物Hongliang李教授(武汉大学心血管研究所)。TRAF5 KO小鼠backcrossed与C57BL / 6小鼠6或更多的后代,和杂合的父母老鼠intercrossed TRAF5屈服−−/和TRAF5+ / +的后代,被用于进一步的研究。我们实验的动物饲养和维护在特定无菌(SPF)条件和随意获取食物和水。小鼠适应这些条件超过5天前开始的实验。使用的老鼠都是男性,年龄在8 - 10周,体重20 - 24 g。

2.3。结肠炎的归纳和评价

急性结肠炎在TRAF5诱导−−/和TRAF5+ / +老鼠( 每组中)使用3% DSS(36000 - 50000兆瓦,MP生物医学,梭伦,OH)溶解在饮用水为7天。正常的控制整个实验小鼠给予蒸馏水。动物体重每天观察一次,粪便一致性和神秘的存在或者重大粪便的血液。疾病活动指数(DAI)计算像库珀et al。(表所描述的那样1)[23]。在实验结束时,老鼠被公司牺牲2吸入。后期,整个冒号被迅速删除,拍照,轻轻地清理粪便使用4°C生理盐水。小段的远端冒号收集的组织病理学和免疫荧光分析正常缓冲福尔马林固定在10%。剩下的结肠组织存储在−80°C用于其余的实验。

表1
疾病活动指数(DAI)评分标准。
2.4。组织学分析

结肠段的组织病理学在10%福尔马林固定,如上所述。石蜡包埋后,5μ部分被削减和苏木精和伊红染色(圆))符合标准协议。由两个病理组织学评分进行盲目。根据Obermeier et al。24),得分是基于结合上皮损伤和炎性细胞浸润(表2)。

表2
组织学评分系统用于这项研究。
2.5。髓过氧化酶(MPO)活动分析

MPO酶发现主要在粒细胞及其活动评估使用MPO分析工具包(南京建成生物工程,中国)根据制造商的指示。短暂,结肠的MPO活动样本检测利用动力学分析中,H2O2退化的MPO从嗜中性粒细胞释放。然后吸光度在460纳米测量使用DU 530生命科学UV / Vis分光光度计(美国贝克曼库尔特)。MPO的活性单位所示每克组织(U / g组织)。

2.6。RNA提取和定量实时聚合酶链反应(存在)

总RNA提取使用试剂盒从结肠癌样本试剂(美国英杰公司)根据制造商的协议。RNA进行量化使用分光光度计(美国热科学NanoDrop 2000)。互补脱氧核糖核酸是合成使用合成第一链cDNA工具包(美国热科学)和2μg总RNA。存在使用QuantStudio随后进行™美国6 Flex实时PCR系统(ABI)和SYBR®预混料Taq交货™二世(豆类、日本)。gene-specific底漆对表中列出3。的 方法被用来确定相对mRNA水平。

表3
在这项研究中gene-specific底漆对列表。
2.7。结肠细胞因子的测定

结肠组织取自KO和WT小鼠称重和均质磷酸盐(PBS) Tween-20含有0.05%,0.1毫米phenylmethylsulfonyl氟化物(PMSF), 0.1毫米苄索氯铵,10毫米EDTA, 20桥抑肽酶。随后,组织匀浆在12000 g离心10分钟,上层清液被移除和储存在−80°C到使用。细胞因子的量化干扰素-γ、il - 4和IL-17a当时使用商用执行酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(Joyee生物技术,上海,中国)根据制造商的协议。

2.8。免疫荧光染色

免疫荧光染色,5μ米部分从石蜡包埋组织deparaffinized,孵化与柠檬酸钠缓冲(10毫米,pH值6.0)抗原检索,然后用5%的山羊血清阻塞在室温下30分钟。随后,一夜之间,幻灯片被孵化与特定的抗体主要在4°C。以下主要使用抗体:anti-IFN -γ(1:200稀释;美国Proteintech)、anti-IL-4(1: 100稀释;美国BioLegend)、anti-IL-17a(1: 200稀释;美国Proteintech)、anti-p65(1: 100稀释;细胞信号技术,美国),anti-CD4(1: 100稀释;美国BioLegend)和anti-CK18(1: 100稀释;Goodbio科技有限公司,中国)。经过仔细清洗与PBS、幻灯片和适当的特有的二次孵化抗体1 h。最后,部分沾4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)细胞核形象化,使用荧光显微镜和可视化了。

2.9。隔离的固有层单核细胞(LPMCs)

LPMC悬浮液收集所述,次要的修改(25]。简而言之,冒号纵向剖开,小心翼翼地用冰冷的PBS洗净,切成小块(5毫米)。去除上皮细胞和上皮内淋巴细胞,结肠段preincubated在哈佛商学院−−/缓冲(没有Ca2 +/毫克2 +消息灵通的EDTA)包含2毫米,10毫米,1毫米德勤,5% FCS两次15分钟在37°C。剩下的部分在哈佛商学院被孵化+ / +缓冲(Ca2 +/毫克2 +第八)含有1.5毫克/毫升胶原酶(美国Sigma-Aldrich), 0.1毫克/毫升DNase我(热科学、美国),和5% FCS为45分钟37°C。消化组织通过筛网过滤器过滤后,孤立的细胞纯化使用40%和80% Percoll梯度(美国Sigma-Aldrich)离心20分钟的1000克。LPMCs被收集在40%和80%的接口Percoll梯度。

2.10。细胞内染色

用于染色细胞干扰素-γ、il - 4和IL-17a,获得LPMCs刺激与白细胞激活鸡尾酒(美国BD生物科学)至少5 h体外。细胞然后收获沾phycoerythrin-cyanine 7 - (PE-Cy7)共轭anti-CD4抗体(美国eBioscience) 30分钟。随后,这些细胞被固定和使用BD Cytofix / Cytoperm permeabilized™固定/透化作用工具包(美国BD生物科学)根据制造商的指示,紧随其后的是染色allophycocyanin——(APC)共轭anti-IFN -γ藻红蛋白抗体——(PE)共轭anti-IL-4抗体,和PE-conjugated anti-IL-17a抗体(所有从BD购买生物科学,美国)。最后,分析了细胞使用FACSCalibur流式细胞分析仪(美国BD生物科学)。积极性被定义的阈值之外的非特异性结合观察到相关isotype-control抗体的存在。

2.11。SDS-Polyacrylamide凝胶电泳(PAGE)和免疫印迹

结肠组织取自KO和WT老鼠细胞溶解在里帕裂解缓冲含有蛋白酶抑制剂的鸡尾酒,和蛋白质浓度检测用BCA分析工具包(Beyotime生物技术,中国)。共有50个μg蛋白然后加载12% sds - page凝胶分离和转移到聚乙二烯二氟化物(PVDF)膜使用wet-transfer装置(微孔)。TBST膜被封锁(Tris-buffered盐水Tween-20)含5%脱脂奶粉1 h在室温下,紧随其后的是孵化与特定的主要抗体在一夜之间在4°C。在TBST 3洗后,膜被孵化与辣根过氧化物酶(合)共轭种特异的抗体在室温下2小时。3洗TBST,墨迹图可视化使用高灵敏度的化学发光,其次是暴露在放射自显影法电影。密度分析使用数量的墨迹图进行一个软件(Bio-Rad)。特定的蛋白质表达水平在同一膜被规范化GAPDH水平。以下主要使用抗体:anti-phospho-p65(没有。3033),anti-total-p65(没有。8242),anti-phospho-IκBα(没有。2859年),和anti-total-IκBα(没有。4814)(1:1000稀释;从细胞信号技术,贝弗利,妈,美国)。抗体对GAPDH是购自Sungene生物科技(天津)。

2.12。统计分析

所有数据提出了均值±SD。统计上显著的差异进行了分析使用单向方差分析(方差分析)或一个未配对t以及。一个 值小于0.05被认为是显著的。所有使用SPSS 17.0软件进行统计分析。

3所示。结果

3.1。TRAF5-Deficient老鼠与WT发展相比更严重的结肠炎小鼠DSS-Induced结肠炎模型

评估的角色发展的TRAF5小鼠实验性结肠炎、急性结肠炎在TRAF5 KO小鼠诱导及其WT同胞管理3% DSS在7天的饮用水。

DSS管理期间,TRAF5 KO小鼠遭受显著更大的身体减肥开始5天与WT老鼠相比(第五天: %与 %, ;第六天: %与 %, ;7天: %与 %, )(图1(一))。此外,傣族的TRAF5-deficient小鼠显著恶化相比DSS-fed WT老鼠(第四天, ;第五天, ;6天, ;7天, )(图1 (b))。众所周知,结肠长度是DSS-induced结肠炎模型中的参数以更少的灵活性;我们发现的冒号KO小鼠短得多比WT老鼠与DSS(治疗后 毫米和 毫米, )(数据1 (c)和1 (d))。

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图1
TRAF5-deficient老鼠更容易DSS诱导。(一)体重百分比的变化。戴(b)的变化分数。((c)和(d))老鼠牺牲了7天,并删除他们的冒号,拍照,测量的长度。并给出了数据均值±SD。 每组。 与DSS-treated WT组和 与DSS-treated WT组。

DSS管理导致失去正常的结肠架构,这是表现为上皮损伤和炎性细胞的浸润。使用综合评分系统量化程度的损害,我们观察到更严重的组织损伤TRAF5 KO小鼠与WT老鼠DSS诱导(数字2(一个)和2 (b))。我们也取得了所有的控制老鼠的组织学和在未经处理的KO没有观察到明显的炎症或WT老鼠。此外,MPO水平升高的活动被发现后的冒号TRAF5-deficient动物DSS政府(图2 (c)),这表明TRAF5的损失可以明显促进结肠嗜中性粒细胞浸润对DSS的回应。因此我们的数据表明,TRAF5不足可能大大加剧DSS-induced结肠炎的严重程度。

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图2
TRAF5缺乏对结肠组织的组织病理学和MPO活动。组织学评价DSS-induced结肠炎是由显微镜和圆)染色。结肠部分从TRAF5 KO和WT老鼠在盲评,如部分所述2。(一)代表远端结肠的横截面。图像的放大100倍和400倍。(b)定量组织学分析的结果( 每组)。在冒号(c) MPO活动确定节中描述2( 每组)。并给出了数据均值±SD。 与DSS-treated WT组和 与DSS-treated WT组。
3.2。TRAF5缺乏改变细胞因子和转录因子生产的冒号DSS-Induced老鼠

理解的机制在TRAF5-deficient DSS-induced结肠炎小鼠的恶化,我们研究了典型的mRNA水平与Th1相关细胞因子和转录因子(TNF -α干扰素-γ和T-bet), Th2 (il - 4和GATA-3), Th17 (IL-17a, il - 22生成时,ROR -α和ROR -γt)细胞中存在。

与水平相比DSS-treated WT老鼠,典型的mRNA水平Th1 / Th2细胞因子(IFN -γ和il - 4,职责。)和转录因子(T-bet GATA-3, resp)均显著升高的冒号TRAF5 KO小鼠接受DSS(图3)。此外,我们的数据也显示IL-17a转录的增强DSS-induced TRAF5-deficient动物(图3)。然而,意外,我们没有发现显著差异在mRNA水平Th17-associated转录因子,包括ROR -α和ROR -γt, DSS-fed KO和WT老鼠(图之间的关系3)。结果,我们推测,冒号的高架IL-17a DSS-induced TRAF5-deficient老鼠可能是分泌的一种细胞除了Th17细胞。尽管如此,没有发现差异在mRNA水平的细胞因子或未经处理的KO和WT老鼠之间的转录因子。

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图3
分析细胞因子和转录因子mRNA表达的Th细胞TRAF5 KO的冒号和WT老鼠。(一)TNF -α,(b) IFN -γ(c) il - 4, (d) IL-17a, (e) il - 22生成时,(f) T-bet GATA-3 (g), (h) ROR -α,(我)ROR -γ实时PCR t mRNA表达水平测定。三个独立实验的数据是代表(平均数±标准差)。 每组。 与DSS-treated WT组; 与DSS-treated WT组。NS:不重要和DSS-treated WT组。

此外,细胞因子的蛋白质含量干扰素-γ、il - 4和IL-17a被ELISA和免疫荧光染色检测。我们的数据表明,TRAF5缺乏可以显著提高干扰素的蛋白质含量γ、il - 4和IL-17a引起DSS(图4),这是符合上述存在的结果。

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图4
删除TRAF5增加细胞因子的蛋白表达干扰素-γ、il - 4和IL-17a冒号的老鼠引起的DSS。(一)干扰素的生产γ、il - 4和冒号的IL-17a DSS-induced老鼠或控制老鼠被ELISA检测( 每组)。(b)干扰素的免疫荧光染色——代表γ、il - 4和冒号的IL-17a TRAF5 KO小鼠和WT(放大400倍)。(c)量化阳性细胞( 每组)。三个独立实验的数据是代表(平均数±标准差)。 与DSS-treated WT组; 与DSS-treated WT组。
3.3。缺TRAF5 Th2和干扰素的频率增加γ/ IL-17a-Coproducing CD4+T细胞的固有层DSS-Induced老鼠

进一步检查是否缺TRAF5可能影响CD4的构成+Th细胞子集,表面表达CD4分子和细胞内的表达il - 4,干扰素-γ,IL-17a检查LPMCs孤立对待DSS冒号的老鼠。

如数据所示5(一个)和5 (b),CD4细胞的百分比+il - 4+Th2细胞在TRAF5-deficient小鼠显著增加。同时,TRAF5缺乏症也增强干扰素-的频率γ/ IL-17a-coproducing CD4+T细胞(图5(一个)和5 (c))。然而,没有显著差异的百分比古典Th1和Th17细胞CD4细胞特征+干扰素-γ+IL-17a−和CD4+IL-17a+干扰素-γ−分别在KO和WT DSS管理局(数据后小鼠5(一个),5 (d),5 (e))。综上所述,这些结果表明,TRAF5缺乏可以明显促进Th2和干扰素的生成γ/ IL-17a-coproducing CD4+T细胞对DSS IL-17a细胞因子的水平升高,甚至干扰素-γ在冒号DSS-fed KO小鼠可能分泌的干扰素-γ+IL-17a+double-positive细胞。

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图5
Th2和干扰素的比例增加γ/ IL-17a-coproducing CD4+T细胞的冒号TRAF5-deficient DSS诱导的动物。LPMCs获得DSS-fed KO的冒号和WT老鼠和PMA刺激/ ionomycin CD4和受到表面染色。固定和透化作用后,细胞内染色il - 4,干扰素-γ节中描述,IL-17a执行2。CD4+T细胞被封闭和分析。(一)代表流的情节。(b) Th2细胞(CD4的百分比+il - 4+),(c)干扰素-γ/ IL-17a-coproducing CD4+T细胞(CD4+干扰素-γ +IL-17a+古典Th1细胞(CD4), (d)+干扰素-γ +IL-17a−),古典Th17细胞(CD4 (e)+IL-17a+干扰素-γ −)提出了均值±SD。的数据是代表三个独立的实验。 每组。 与DSS-treated WT组。NS:不重要和DSS-treated WT组。
3.4。删除TRAF5增强了NF -κB在炎症信号通路冒号

TRAF5 KO的冒号和WT老鼠孤立免疫印迹分析探索潜在的分子机制TRAF5 deficiency-mediated DSS-induced结肠炎的恶化。因为NF -κB是一个中介ibd的主要组件,它扮演着重要的角色在Th细胞功能分化和发展的子集(26,27]。因此,我们调查了磷酸化的蛋白质含量和总p65和我κBα冒号的KO和WT老鼠。

符合变更p65总额的磷酸化水平p65显著增加在冒号TRAF5 KO小鼠与WT老鼠DSS诱导后(数字6(一),6 (b),6 (c))。另一个重要的调停人的NF -κB通路,磷酸化κBα也显著增强TRAF5-deficient动物针对DSS的冒号(数据吗6(一)和6 (d))。然而,在没有区别的基线活动NF -κ未经处理的KO和WT老鼠之间的信号。同样,免疫荧光染色的结肠部分显示TRAF5缺乏明显增强的核本地化的价格相比p65 DSS-induced WT老鼠(数字7(一)和7 (b))。因此,这些结果表明,TRAF5缺乏可以显著促进NF -激活κB信号后DSS管理。

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图6
缺乏TRAF5增强NF -的激活κB信号。的磷酸化和总蛋白表达水平p65和我κBα发现在冒号TRAF5 KO和WT老鼠。(一)代表的屁股。((b)、(c)、(d)和(e))的定量结果。三个独立实验的数据是代表(平均数±标准差)。 每组。 与DSS-treated WT组; 与DSS-treated WT组。NS:不重要和DSS-treated WT组。
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图7
TRAF5缺乏显著增强p65在CD4的激活+T细胞在DSS的管理。(一)代表p65免疫荧光染色。p65-labeled细胞显示红色荧光,细胞核显示蓝色荧光(放大400倍)。(b)量化p65阳性细胞。(c)代表对CD4和p65免疫荧光染色。CD4-labeled细胞显示绿色荧光,p65-labeled细胞显示红色荧光,细胞核显示蓝色荧光(放大400倍)。(d) p65量化+CD4+细胞。免疫荧光染色法(e)代表CK18和p65。CK18-labeled细胞显示绿色荧光,p65-labeled细胞显示红色荧光,细胞核显示蓝色荧光(放大400倍)。(f) p65量化+CK18+细胞。三个独立实验的数据是代表(平均数±标准差)。 每组。 与DSS-treated WT组。NS:不重要和DSS-treated WT组。

除了免疫细胞的功能,激活NF -κB是扮演着一个重要角色在上皮归还从损伤或炎症。如果激活NF -澄清κB主要发生在免疫细胞,上皮细胞,或者两者兼有,colocalization核p65免疫或上皮细胞制造商(CD4和CK18、职责)也表现在我们的研究中。如数据所示7 (c)和7 (d),p65和CD4 double-positive细胞比例高DSS-induced KO小鼠相比,WT老鼠。然而,在p65率无显著差异+CK18+两组之间细胞(数字7 (e)和7 (f))。综上所述,这些研究结果表明,升高激活NF -κB在冒号TRAF5 KO小鼠主要发生在免疫细胞而不是上皮细胞。

4所示。讨论

在我们的实验中,我们得到了小说发现TRAF5参与当地的规定肠道炎症。功能丧失的实验表明,TRAF5不足可能会加剧DSS-induced结肠炎,特点是惊人的体重损失,大大增加戴得分,显著缩短结肠,更严重的组织损伤。此外,我们检查MPO的活动,一种酶发现主要在粒细胞,并发现TRAF5 KO小鼠表现出更高水平的DSS诱导后比WT老鼠MPO活动。因此我们的数据表明,删除TRAF5可能大大加剧DSS-induced结肠炎的严重程度。

因为适配器TRAF5与CD4的规定+Th细胞免疫(15,21,22),我们接下来研究了典型的细胞因子和转录因子的水平Th细胞的子集(Th1、Th2和Th17)冒号的KO和WT老鼠。我们的研究结果表明,细胞因子的表达水平干扰素-γ、il - 4和IL-17a都显著升高TRAF5-deficient老鼠与WT DSS引起的小鼠相比。此外,我们的数据表明TRAF5缺乏可以显著提高mRNA转录因子T-bet和GATA-3水平。然而,令我们吃惊的是,我们没有发现显著差异水平的任何特定Th17转录因子之间的两组老鼠。因此,我们假设的高架IL-17a冒号DSS-fed KO小鼠可能分泌的一种细胞除了Th17细胞。除了Th17细胞,一种独特类型的细胞,即干扰素-γ/ IL-17a-coproducing CD4+T细胞,还可以分泌IL-17a [28- - - - - -31日),这些不同的人群激起了我们的兴趣。

据我们所知,干扰素-γ/ IL-17a-coproducing CD4+T细胞是一群从Th1细胞转化或Th17细胞。虽然古典Th1和Th17细胞主要是干扰素-γ分别和IL-17a阳性,这群细胞干扰素-γ和IL-17a double-positive [28- - - - - -31日]。越来越多的证据表明,这些人群发挥重要作用在炎症性肠病的发病机制和其他自身免疫性疾病(29日,32,33]。来证实我们的假设,进一步阐明机制,CD4细胞的百分比+Th细胞亚种群被流式细胞术分析。

我们的数据表明,干扰素-的百分比γ/ IL-17a-coproducing CD4+T细胞明显升高的LPMCs TRAF5-deficient老鼠相比WT DSS诱导后的老鼠。然而,古典Th1和Th17细胞的频率没有显著不同的两组之间。基于这些发现,我们认为增加干扰素-γ+IL-17a+double-positive细胞可能发挥关键作用的增强IL-17a和干扰素的生产γ冒号的TRAF5-deficient动物对DSS的回应。尽管Th17细胞的可塑性是广泛接受,Th1细胞不太理解的灵活性。刘和他的同事们发现,Th1细胞转变成干扰素-γ/ IL-17a-coproducing CD4+T细胞甚至Th17细胞,这种转变依赖于转录因子的表达T-bet [30.]。同样,我们的实验显示百分比的增加干扰素-γ/ IL-17a-coproducing CD4+T细胞和高表达T-bet DSS-induced KO小鼠。因此,我们建议干扰素-比例的增加γ+IL-17a+double-positive冒号DSS-fed KO小鼠细胞可能是由于Th1细胞转化。然而,精确的机制还不清楚,需要进一步的调查。

此外,我们的数据显示一个高架Th2 (CD4的频率+il - 4+)细胞的冒号TRAF5-deficient DSS诱导小鼠后,这是符合细胞因子和转录因子配置文件的变更。几项研究表明,过度的GATA-3 T细胞可以明显加剧的严重性DSS-induced结肠炎在老鼠和老鼠IL-4-deficient发展那么严重DSS-induced比WT小鼠结肠炎(34,35]。因此,我们有理由相信Th2细胞水平的升高和其特定细胞因子il - 4的冒号TRAF5 KO小鼠中可能发挥促炎作用DSS-induced结肠炎的发展。

NF -κB家族包含五个不同的成员,包括cRel RelA (p65) RelB, NF -κB1 (p50)和NF -κB2 (p52) [36]。在休息的情况下,NF -κB主要是灭活和保存在细胞质中由我与抑制蛋白质的交互κb在刺激,一系列激酶激活和磷酸化κB,导致其快速通过泛素化降解。最后,NF -发布κB进入细胞核,它绑定到特定的靶基因序列(37,38]。在我们的研究中,我们观察到TRAF5缺陷增加了p65的磷酸化和我κBα在对DSS诱导的反应。按照免疫印迹数据,免疫荧光染色还显示增强的核本地化的p65 DSS-fed KO小鼠。这些结果表明,删除TRAF5可以显著促进NF -的激活和易位κB在小鼠结肠炎模型。虽然我们的数据表明NF -κB被激活TRAF5基因敲除小鼠在DSS结肠炎,目前还不清楚如果这激活发生在免疫细胞,上皮细胞,或两者兼而有之。为了找出这个谜题,colocalization核p65免疫或上皮细胞制造商也表现在我们的研究中。结果表明,活化NF -升高κB在冒号TRAF5 KO小鼠主要发生在免疫细胞而不是上皮细胞。值得注意的是,NF -κB信号已被证明调解Th细胞发育和分化的许多方面(26,39,40]。因此我们认为TRAF5缺陷的影响Th细胞反应的子集可能NF -在我们的实验κB-dependent。据我们所知,先前的研究已经表明,适配器TRAF5参与NF -的激活κB信号(18,19,41]。我们的研究表明NF -挑战这种常见的视图κB是激活的冒号TRAF5-deficient老鼠引起的DSS。同意我们的发现,扁等人也发现增强NF -κB在TRAF5-deficient动物的心脏压力过载(42]。因此,我们建议TRAF5对NF -的影响κB信号可能是特定的组织和疾病。

总之,我们的研究发现TRAF5作为抗炎调制器在小鼠实验性结肠炎。在肠道炎症条件下,TRAF5缺乏提高Th2和干扰素-的反应γ/ IL-17a-coproducing CD4+T细胞。与此同时,NF -的激活κB在CD4+T细胞也增强。这些结果表明,TRAF5缺乏明显加剧DSS-induced结肠炎,最有可能通过调节细胞介导炎症。针对TRAF5可能因此提供一种很有前途的新颖策略人类炎症性肠病的治疗。

的缩写列表

炎症性肠病: 炎症性肠病
CD: 克罗恩氏病
加州大学: 溃疡性结肠炎
Th: 辅助T
决策支持系统: 葡聚糖硫酸酯钠
TRAF5: 肿瘤坏死因子receptor-associated因子5
TLR: toll样受体
戴: 疾病活动指数
DAPI: 4′,6-Diamidino-2-phenylindole
LPMC: 固有层单核细胞。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

剑商和历下李同样这项工作。

确认

作者感谢教授Hongliang李(武汉大学心血管研究所)提供TRAF5 KO小鼠。他们也感谢Bing夏教授他的伟大贡献他们的研究。这项工作得到了国家自然科学基金的研究资助中国(没有。81270467)。