文摘
1型糖尿病(T1DM)是一个瀑特异性自身免疫性疾病的特点是慢性和进步的胰腺β细胞的凋亡破坏。在T1DM的初始阶段,细胞因子和其他炎症介质释放的免疫细胞逐步渗透胰岛细胞,诱导基因表达的改变,引起功能障碍,最终导致细胞凋亡。长非编码rna (lncRNAs)是一个新的重要的一类普遍的基因,有各种各样的生物功能和在许多疾病中起着关键作用。然而,他们是否有一个函数在细胞因子诱导β细胞凋亡仍然是不确定的。在这项研究中,lncRNA微阵列技术是用来识别lncRNAs和mrna表达的不同MIN6细胞暴露于促炎细胞因子。四百四十四调节和279下调lncRNAs发现了一组滤波器叠化≧2.0。阐明这些lncRNAs的潜在功能,基因本体论(去)和路径分析是用来评估的潜在功能差异表达lncRNAs。此外,lncRNA-mRNA coexpression网络构造预测之间的交互是最引人注目的是监管lncRNAs和mrna。本研究可以用作背景或引用资源未来的功能研究lncRNAs相关诊断和T1DM的新疗法的发展。
1。介绍
大量流行病学调查表明,1型糖尿病(T1DM)的发病率在逐年稳步增加的儿童和青少年,大概是在2020年翻一倍1- - - - - -5]。然而,T1DM的病因和发病机制复杂,尚未完全阐明。此外,长期注射胰岛素和临床并发症酮症酸中毒等急性和慢性肾病、神经病变、视网膜病变可能会导致严重的身体和精神创伤的儿童患有这种疾病。因此,探索T1DM的发病机理以及制定新的干预策略已成为首要任务内分泌领域的研究。
胰腺β细胞分泌胰岛素来调节血糖水平在一个相对狭窄的范围内。研究表明,T1DM发病机理与胰腺β细胞凋亡(6]。T1DM瀑特异性自身免疫性疾病的特点是慢性,渐进胰腺β细胞的凋亡破坏,导致严重胰岛素缺乏(7]。自身免疫对β细胞有可能引发的环境风险因素,基因易感个体行为(7- - - - - -9]。一旦受到刺激,各种免疫细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞、树突细胞,渗入诱导的胰岛β细胞死亡通过活性氧等机制,穿孔素/ granzymes Fas和FasL,氮物种,促炎细胞因子(6),其中细胞因子被认为扮演关键角色在自身免疫调节和β细胞损失(10]。长时间暴露于免疫细胞分泌促炎细胞因子白介素- 1 (IL)等β,肿瘤坏死因子(TNF)α和干扰素(IFN)γ胰腺β细胞是高度细胞毒性,损害胰岛素分泌,最终导致β细胞凋亡的损失(10- - - - - -13]。在炎症过程中,促炎细胞因子影响许多基因网络的表达和调节pro -和凋亡通路14,15]。
到目前为止,研究主要集中在蛋白质编码基因,但最近的研究表明,蛋白质编码基因占不到2%的积极转录基因,表明大多数的成绩单都非编码rna (ncRNAs) [16]。NcRNAs可以细分成小NcRNAs长度(少于200个核苷酸)和长NcRNAs (lncRNAs),长度大于200个核苷酸,很少或根本没有蛋白质编码能力(17]。近年来,RNA生物学领域的研究主要集中在小ncRNAs [18),基本上忽略lncRNAs。很长一段时间,这些lncRNAs认为转录噪音。然而,越来越多的证据表明,lncRNAs基因组调控中扮演重要的角色,如在X染色体失活、基因印迹、染色质修改、转录、剪接、翻译、退化、和运输过程中所涉及的规定单个细胞生长和发育的细胞凋亡、增殖、分化、和其他细胞活动(17,19- - - - - -22]。这些lncRNAs的失调与许多人类疾病有关,包括不同类型的癌症,神经退行性疾病和其他疾病(23]。随着lncRNA微阵列的发展,生物信息学和高通量测序,成千上万的lncRNAs已确定,但只有少数的功能注释。目前,一些研究调查的角色lncRNAs糖尿病(24),和新兴的证据表明,lncRNAs可能参与维持胰腺β细胞功能和胰岛素信号转导,这可能会影响糖尿病发展(25]。
在这项研究中,我们研究了lncRNAs和mrna的表达谱MIN6细胞接触后il - 1的结合β肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ使用微阵列技术。我们发现许多lncRNAs和mrna的表达水平改变对促炎细胞因子的反应。一些感兴趣的lncRNAs显著监管被存在进一步验证,和基因本体论(去)和路径分析是用来分析这些差异表达的生物角色lncRNAs和mrna。Coding-noncoding基因coexpression网络被用来预测潜在的相互作用这些lncRNAs和mrna。本研究可能的发病机制提供重要的见解β细胞凋亡。
2。材料和方法
2.1。细胞培养和治疗
胰腺MIN6β肽是生长在high-glucose杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM)补充10%胎牛血清的边后卫,100μ100年g / mL链霉素μ青霉素g / mL, 50μ米β巯基乙醇在37°C的氛围中5%的股份有限公司2。MIN6细胞被播种在6-well盘子大约80%汇合,然后被处理或没有5 ng / mL il - 1β25 ng / mL TNF -α,25 ng / mL IFN -γ24 h。
2.2。RNA提取和质量控制
从MIN6细胞总RNA提取使用试剂盒试剂(美国表达载体),然后使用一个纯化RNeasy迷你包(试剂盒、希尔登,德国)根据制造商的协议。RNA浓度和纯度测定OneDrop od - 1000。RNA完整性测量使用标准变性琼脂糖凝胶电泳。
2.3。微阵列和数据分析
2.3.1。鼠标lncRNA微阵列
一个Affymetrix GeneChip鼠标转录组数组1.0,这是专为测量范围广泛的表达变化在整个鼠标转录组,用于配置文件ncRNAs和蛋白质编码基因。lncRNAs获得权威数据库,包括运用,RefSeq, UCSC的已知基因,脊椎动物基因组注释(Vega)数据库,MGC哺乳动物的基因集合,MGI, NONCODE等等。
2.3.2。RNA标签和阵列杂交
样品制备和标签、微阵列杂交和清洗进行使用GeneChip WT终端标识和控制装备,一个Ambion WT表达工具,和GeneChip杂交,洗涤、染色设备,分别根据制造商的标准协议。简单地说,1μg总RNA,影射与含有一个T7启动子序列的引物,用于合成单链的互补。然后,单链cDNA变成了双链cDNA,作为模板合成并放大了反义RNA(互补的RNA)的体外转录反应。cRNA反向转录有义链cDNA使用2 nd-cycle引物。核糖核酸酶H用于水解cRNA模板,单链的互补。水解后,2 nd-cycle单链cDNA、纯化去除盐分,酶和非公司核苷酸,是分散的和标记。标记的互补是杂化到Affymetrix GeneChip鼠标转录组数组使用GeneChip杂交炉645 1.0。洗后的杂化数组,数组与GeneChip扫描仪扫描3000 7 g。
2.3.3。数据分析
Affymetrix®表达式控制台™软件(版本1.3)被用来分析微阵列数据。之间的显著差异表达lncRNAs和mrna两组选择如果阈值的褶皱变化≧2.0或≦−2.0。三步健壮的多片分析(RMA)算法,其中包括(1)背景调整,(2)分位数正常化,和(3)总结,用于分析的原始数据。使用集群软件3.0执行层次聚类。微阵列分析是由Genminix信息有限公司,有限公司,中国。
2.4。定量实时逆转录聚合酶链反应(存在)
反应使用PrimeScript互补脱氧核糖核酸合成™RT大师混合(完美的实时、豆类、日本)根据制造商的建议。逆转录的lncRNAs执行使用SYBR绿色方法在应用生物系统公司7500系统(生活技术,我们)。基于周期的基因表达水平量化阈值(CT)价值观和规范化的内部控制基因β肌动蛋白。选择的相对表达水平lncRNAs计算的基础上方法。引物序列表中列出1。
2.5。去和路径分析
去描述基因和基因产物属性,包含三个关键域命名为生物过程,细胞组件,和分子的功能。去分析被用来与mrna表达的不同类别。基因和基因组的京都百科全书(KEGG)数据库,破译基因组生物信息学资源,用于识别目标基因的重要途径。
2.6。LncRNA-mRNA Coexpression网络
一个lncRNA-mRNA coexpression网络,可以识别差异表达之间的交互lncRNAs mrna,构造根据规范化的具体表达基因和lncRNAs的信号强度。皮尔森相关计算每个lncRNA-gene基因基因,或lncRNA-lncRNA一对,显著相关性对网络建设的选择方法。
2.7。统计分析
IBM SPSS 20.0软件被用来分析所有的统计数据。随机方差模型- - - - - -测试是用来确认控制和之间的差异表达基因和lncRNAs cytokine-stimulated组。费舍尔的确切,测试申请去途径分析。值< 0.05被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。微阵列数据概要
一个Affymetrix GeneChip老鼠转录组数组1.0旨在概要文件所有老鼠lncRNAs和蛋白质编码记录。微阵列表达分析数据显示,723年确定了不同管制lncRNAs cytokine-stimulated组与对照组相比,使用一组滤波器叠化≧2.0,和2180年不同监管mrna被确定与一组滤波器叠化≧1.5。此外,444年调节和279年下调lncRNAs检测并展示在表(在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/9275106)。层次聚类的结果显示了lncRNA和mRNA表达模式(数据1(一)和1 (b))。
(一)
(b)
3.2。LncRNA分类和亚组分析
进一步探索特异表达的潜在功能lncRNA cytokine-stimulated组中,我们调查了他们的长度和染色体分布。长度分布表明,管制lncRNAs大多是少于500个基点或超过5000个基点(图2)。染色体分布表明,调节lncRNAs大多位于染色体1,表达下调lncRNAs大多位于染色体2(图3)。
3.3。去和路径分析
基于我们的分析,以下十大丰富条款与调节lncRNAs:(1)先天免疫反应,炎症反应(2),(3)凋亡过程,(4)积极的监管I-kappa B激酶/核因子- (NF)κB级联,(5)防御应对病毒,生物过程(6),(7)应对病毒,免疫反应(8)、(9)积极监管RNA聚合酶II启动子的转录和(10)负调节肽链内切酶活动(图4(一))。以下十大丰富去条款相关的表达下调lncRNAs:(1)运输、细胞周期(2),(3)氧化还原过程,(4)核小体组装、(5)细胞分裂,有丝分裂(6),(7)代谢过程,生物过程(8),(9)蛋白质运输和(10)离子传输(图4 (b))。
(一)
(b)
基于我们的途径分析,以下十大丰富通路与调节lncRNAs: (1) cytokine-cytokine受体相互作用,(2)nf -κB信号通路,(3)toll样受体信号通路,(4)nod样受体信号通路,MAPK信号通路(5),(6)RIG-I-like受体信号通路,(7)细胞凋亡,Jak-STAT信号通路(8),(9)趋化因子信号通路,(10)河马信号通路(图5(一个))。另外,以下十大丰富通路相关的表达下调lncRNAs:(1)代谢途径,病毒致癌作用(2),(3)蛋白在内质网处理,(4)细胞周期,(5)N-glycan生物合成,(6)转录misregulation在癌症、(7)嘌呤代谢,胰岛素分泌(8),(9)生物合成的不饱和脂肪酸,年轻的成熟(10)发病型糖尿病(图5 (b))。
(一)
(b)
3.4。建设lncRNA-mRNA Coexpression网络
基于差异表达之间的相关性lncRNAs mrna和重要的皮尔逊相关系数,我们开发了一个概要文件之间lncRNAs和编码mrna cytokine-stimulated和对照组(数字6(一)和6 (b))。coexpression网络显示一个lncRNA与一个几十个mrna和lncRNAs。在网络分析中,学位中心是用来衡量一个基因或lncRNA中心在一个网络内,确定其相对重要性。从两个网络,我们确定了核心监管lncRNAs和mrna,最大程度(表2和3)。
(一)
(b)
3.5。实时定量PCR验证
我们随机抽取15兴趣lncRNAs验证使用中存在微阵列分析数据。中存在的结果在很大程度上与微阵列(图中的数据一致7)。
4所示。讨论
在T1DM的初始阶段,细胞因子和其他炎症介质释放的免疫细胞逐步渗透小岛,导致β细胞的功能抑制和死亡(12]。在nonobese糖尿病(NOD)小鼠β细胞凋亡是之前大量淋巴细胞浸润(26]。这些观察导致产生的概念,促炎介质浸润细胞诱导β细胞死亡中起重要作用。因此,长时间暴露于促炎细胞因子是高度细胞毒性胰腺β细胞的功能(10- - - - - -13和影响许多基因网络的表达14,15]。先前的研究主要集中在各种microrna调节β细胞凋亡。小的信息存在于lncRNAs调节β细胞凋亡和促进T1DM发展27- - - - - -29日]。相比之下,这些研究中,我们使用一个新的和不同的基因芯片,扩大lncRNA表达谱,并更新数据库。在这里,我们报告lncRNA表达谱的MIN6细胞暴露在促炎细胞因子il - 1β肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ。
综合分析表明,lncRNAs下级通常表达与蛋白编码基因和最有可能显示组织表达模式(30.,31日]。1.0的Affymetrix GeneChip鼠标转录组数组,其中包含lncRNA和信使rna探针,采用lncRNAs和mRNA的表达谱MIN6细胞。在这项研究中,我们确定了不同管制lncRNAs 723和2180不同监管mrna cytokine-stimulated组与控制细胞相比,其中444调节和279下调lncRNAs发现了一组滤波器叠化≧2.0。存在是用于验证的微阵列分析数据,结果是与微阵列数据一致。这些结果表明,lncRNA表达式签名MIN6细胞中是独一无二的。
主要是调节lncRNA NONMMUT036704,被发现与lipocalin展览意义重叠2 (Lnc2),也被称为嗜中性粒细胞gelatinase-associated lipocalin (NGAL)。NGAL发挥重要作用在各种疾病。荣格等人发现,il - 10可能在乳腺癌细胞介导NGAL表达,这可能导致肿瘤恶化[32]。此外,NGAL可以创建本地和系统性炎性环境诱导动脉粥样硬化的促炎介质(33]。,NGAL在皮下脂肪组织过度超重女性妊娠期糖尿病(GDM),这表明它可能参与胰岛素抵抗的形成在GDM [34]。目前,还没有对NGAL细胞凋亡的研究β细胞。但在薄壁组织细胞的作用,我们推测lncRNA NONMMUT036704可能发挥重要作用的发展T1DM NGAL的规定。NONMMUT034373是另一个高度调节lncRNA。这个记录被发现意义重叠CD274抗原(CD274),也称为程序性死亡1 ligand-1 (PD-L1)。PD-L1 PD-1的配体。最近的一项研究表明,转基因小鼠PD-1被迫表达显著减少自身免疫性糖尿病的发病率(35]。另一项研究也表明,PD-1或PD-L1封锁迅速沉淀糖尿病前驱糖尿病的女性nonobese糖尿病(NOD)小鼠无论年龄(36]。PD-L1不足可能增加对糖尿病的易感性对致病性T细胞通过直接影响,而调节性T细胞和B细胞避免自身免疫性糖尿病通过独立机制PD-1 / PD-L1通路(37]。因此,我们推测lncRNANONMMUT034373可能通过调节PD-L1 T1DM的发展做出贡献。
T1DM发展的遗传素质是主要病因学的因素。有研究报道,有易感基因在某些染色体,T1DM如PTPN22 1号染色体上的CTLA4 2号染色体上IFIH1 2号染色体上,IL2RA 10号染色体上(38- - - - - -41]。在这项研究中,相比与其他染色体,染色体1有较高比例的调节lncRNAs,和2号染色体有更高比例的表达下调lncRNAs。这一发现表明,我们可能会有更高的机会找到导致β细胞凋亡的易感lncRNAs染色体1和2。
评估潜在的生物功能差异表达lncRNAs,浓缩和路径分析是用来分析这些lncRNAs相关的差异表达蛋白编码基因。在我们现有的数据,我们发现主要的生物过程,丰富lncRNAs特异表达的“先天免疫反应,”“炎症反应,”“凋亡过程,”和“积极的监管I-kappa B激酶/ nf -κB级联。“这些发现与一个协议目前的概念,免疫介导的炎症可能作为一个1型糖尿病的发病机理。释放炎性细胞因子对β细胞的受体结合,激活转录因子p38, c-Jun n端激酶(物)、信号传感器和催化剂的transcription-1 (STAT-1)和nf -κB和增殖作用(地图)激酶信号通路,引起内质网应激和最终导致功能损伤和细胞凋亡6]。
路径分析是一个映射到KEGG通路基因的功能分析。这里的路径分析表明,所确定的lncRNAs主要参与nf -κB信号通路,toll样受体信号通路,MAPK信号通路,和Jak-STAT信号通路,间接表明这些差异表达lncRNAs扮演了一个重要的角色在细胞因子诱导的胰岛细胞损伤。通路分析还表明,河马lncRNAs参与标识信号通路,RIG-I-like受体信号通路。河马的信号通路在器官尺寸控制和组织再生中扮演关键角色通过抑制细胞增殖和促进细胞凋亡。部分肝切除术后(PH)老鼠,河马信号通路抑制早期在肝脏再生(42]。此外,河马的失活途径或激活其下游效应器,YAP转录共激活剂,提高心脏再生(43]。因此,我们认为,河马信号通路的激活可能诱发β细胞凋亡和失活的河马信号通路可能诱发β细胞增殖。这可能是一个新的治疗目标为1。RIG-I-like受体是关键细胞质病原体识别受体参与病毒的识别,包括功能主要传感器的RNA病毒,和促进承认一些DNA病毒(44]。尽管没有证据表明RIG-I-like受体与1型糖尿病有关,环境因素如病毒感染被认为引发T1DM。因此,我们推测,RIG-I-like受体的激活可能会导致先天免疫细胞炎症反应促进β细胞凋亡,导致T1DM。
5。结论
我们目前的研究揭示了许多差异表达lncRNAs及其相关mrna在使用微阵列分析细胞因子诱导的MIN6细胞凋亡。这些差异表达lncRNAs可能扮演关键角色或部分cytokine-mediatedβ细胞功能障碍。理解这些lncRNAs的功能可以帮助我们确定T1DM新的诊断和治疗靶点。因此,进一步的研究来确定一些感兴趣目标的贡献T1DM的发病机制基于当前的研究是重要的和有价值的。
相互竞争的利益
作者宣称他们没有利益冲突有关。
补充材料
差异表达lncRNAs。