文摘

血管紧张素ⅱ(AngII)引起肺微血管内皮屏障损伤,诱导的急性主动脉夹层(AAD)结合急性肺损伤(ALI)。然而,确切的机制尚不清楚。我们调查的角色去磷酸化的Y685-VE-cadherin AngII诱导肺微血管内皮屏障损伤。老鼠或肺微血管内皮细胞(PMVECs)被分成对照组,AngII集团AngII + PP2 (Src激酶抑制剂)集团和PP2组。PP2被用来抑制Y685-VE-cadherin的磷酸化。病理变化、浸润的巨噬细胞和中性粒细胞和肺微血管通透性被用来确定肺微血管内皮屏障功能。流式细胞仪是用于确定PMVECs的细胞凋亡,以及免疫荧光被用来确定骨骼安排。Transendothelial电阻是用来检测内皮屏障的通透性。的磷酸化Y685-VE-cadherin AngII刺激后显著降低(),连同骨架重排,海拔终于诱导内皮屏障损伤的内皮渗透性。PP2干扰后,Y685-VE-cadherin的磷酸化是进一步减少,内皮渗透性进一步升高。这些数据表明,AngII可以诱导肺损伤内皮屏障损伤,通过触发等过程的脱磷酸作用可能与Y685-VE-cadherin和内皮细胞骨架重排。

1。介绍

主动脉夹层(广告),高死亡率在世界范围内,造成巨大威胁公众健康(1]。我们之前研究表明,大量的广告患者合并急性肺损伤(ALI),严重影响预后。不幸的是,AAD复杂与阿里的确切机制仍不定义良好的2,3]。我们之前的研究表明,肺微血管内皮屏障损伤患者可能出现在操弄,连同大量巨噬细胞和分泌MMP-9迁移,最终诱导ALI打断后air-blood障碍(4]。这些表明,肺微血管内皮屏障损伤可能会发挥极其重要的作用与阿里AAD的发病机制复杂。

血管内皮功能障碍是高度依赖于内皮细胞之间的细胞adherens [5]。作为一个特定粘附蛋白位于内皮,粘合连接处并且VE-cadherin发挥了重要作用在维护血管内皮屏障功能完整性和(6]。在特定的微环境下,信息枢纽中断可能诱导后的酪氨酸残基磷酸化VE-cadherin [7,8]。同时,血管内皮细胞骨架重排可能诱发内皮细胞的收缩和海拔内皮空隙,这也进一步阻碍了血管内皮功能障碍(9]。目前,在正常情况下,内皮屏障功能是高度依赖于连接VE-cadherin复杂的血管内皮细胞(10]。我们所知,细胞间酪氨酸残基磷酸化和去磷酸化的VE-cadherin复杂负责VE-cadherin函数的调制(11]。韦塞尔等人表明Tyr685 Tyr731 VE-cadherin明显和有选择地调节血管通透性的感应或白细胞外渗12]。同时,报告了几个因素诱导的酪氨酸磷酸化VE-cadherin包括VEGF、TNF -α,HIF-1α随后,这可能导致的血管通透性(13- - - - - -15]。我们先前的研究显示,血清血管紧张素(AngII) AAD患者显著升高,加上海拔肺血管通透性。此外,AngII内皮功能障碍的过程中扮演着重要的角色在急性肺损伤(ALI) (16]。在这项研究中,我们调查的影响AngII Y685-VE-cadherin的磷酸化作用,以及它的角色在肺血管内皮屏障损伤。

2。材料和方法

2.1。病人和样本

共有58新诊断AAD患者承认我们医院的重症监护室(ICU) 2014年9月至2015年7月被包括在内。在58 AAD的病人,手术前的21显示并发低氧血症。十二个匹配健康个体为正常控制(表1)。AAD的诊断是根据计算机断层扫描(CT)扫描和超声检查。阿里被定义为PaO₂/ FiO₂后第一个24小时≤300 mmHg诊断根据欧美共识会议诊断标准(17]。排除标准如下:(i)承认我们医院爆发后7天或更多疾病和癌症患者(ii),胸部创伤,和前一个月内肺部感染包容。PaO₂/ FiO₂确定后1小时内样本集合。从每个病人得到书面知情同意。本研究通过武汉大学人民医院的伦理委员会。

2.2。通过抽水的AngII诱导ALI在老鼠身上

尽管微型真空泵AngII成立阿里小鼠模型。雄性C57BL / 6 j小鼠(8周)从HFK购买生物科学有限公司有限公司(中国,北京)。老鼠在一个正常的饮食,加上渗透微型真空泵(Alzet,库比蒂诺,CA) 1μ克/公斤每分钟AngII (Sigma-Aldrich) 1周。所有动物处理按照武汉执行指令的动物研究和当前实验室动物保健和使用指南发布的美国国立卫生研究院。苯巴比妥(40毫克/公斤,2%)是用于麻醉。采取了大量措施来降低动物的痛苦。动物研究是通过武汉大学人民医院伦理委员会。

动物被随机分为四组,其中包括(i)对照组,(ii) AngII集团(iii) AngII + PP2 (Src激酶抑制剂),受AngII抽20紧随其后μ通过腹腔内注射g PP2溶解在DMSO, (iv) PP2组腹腔内注射20μg PP2溶解在DMSO溶液。PP2是注射3次(每两天18]。

2.3。细胞培养

老鼠PMVECs购买从希伯来文名字文化收藏有限公司有限公司(分类号BNCC338210;北京,中国)。在RPMI 1640培养基培养细胞(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)补充10%胎牛血清的边后卫,青霉素和链霉素1%,0.5%二性霉素b(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA),和1%的内皮细胞生长补充(美国ScienCell,卡尔斯巴德,CA),其次是培养在37°C在湿润的气氛中5%的有限公司₂在空气中。细胞的生长被取代10%的边后卫RPMI 1640 FBS-free RPMI 1640 24小时。细胞被分成四组,包括对照组;由AngII AngII集团刺激(1μ美国圣路易斯M Sigma-Aldrich);由AngII AngII + PP2集团刺激(1μ美国圣路易斯M Sigma-Aldrich)和PP2 (0.1μ米,Selleck化工有限责任公司、美国)如前所述19];和PP2集团由PP2刺激(0.1μ米,Selleck化工有限责任公司、美国)。

2.4。ELISA

血清AngII测量使用商业ELISA试剂盒(类别EK0459数量,Biofavor生物技术服务有限公司,有限公司,武汉,中国)根据制造商的指示。所有的测试进行了至少一式三份。

2.5。组织病理学检查

在肺组织的集合,样本固定和嵌入。后来,他走时染色和immunohistostaining进行确定的表达CD68 (BioLegend, 333801)和MPO (Proteintech, 66177 - 1 - ig)根据前面的描述20.,21]。图像观察使用BX51光学显微镜(奥林巴斯公司(日本东京)。免疫组织化学图像分析是使用IPP6.0执行软件。

2.6。西方墨点法

VE-cadherin和pY685 VE-cadherin使用标准的免疫印迹检测协议确定VE-cadherin Y685的磷酸化水平。转移膜被10%的脱脂牛奶在室温下1 h,然后屏蔽膜主要抗体孵育VE-cadherin(稀释1:1000;类别数量pa1 - 84328热费希尔)、pY685VE-cadherin(稀释1:700;类别数量AB119785 Abcam),β肌动蛋白(稀释1:700;圣克鲁斯生物技术)在一夜之间在4°C,分别。在与辣根peroxidase-conjugated孵化后二次抗体(稀释1:5000;北京Zhongshan-Golden桥生物科技公司、北京、中国)1 h在室温下,免疫印迹信号可视化使用西方发光检测设备(有力的生物技术,北京)。

2.7。Immunofluorometric化验

Immunofluorometric试验进行确定细胞骨架。PMVECs的盖玻片包装是用多聚甲醛固定,然后Actin-Tracker绿色(1:100年,BeoTime C10330)添加其次是酝酿在黑暗中在室温下30分钟。洗后用PBS含有0.1% Triton x - 100细胞复染色。混合物在室温下孕育了30分钟。Fluoromount-G(南方生物技术类别编号为0100 - 01,伯明翰,美国)被用来阻止盖玻片(22]。最后,使用BX53图像观察荧光显微镜(奥林巴斯、东京、日本)。

2.8。渗透试验

Transendothelial电阻,一个索引的EC屏障功能,实时测量使用电动细胞基质阻抗传感(欧洲互通性系统委员会)系统(欧洲互通性系统委员会1600年,应用生物物理学)23]。培养细胞在无菌eight-chambered镀金镀电极阵列(8 w10e +)预镀与纤连蛋白和生长完全融合。电极阵列安装在欧洲互通性系统委员会系统在一个孵化器(37°C, 5%有限公司₂,95%的室内空气)及其录音机连接到设备。单层电阻被记录在5分钟的间隔15 kHz 3 h。

2.9。测定肺微血管通透性

的肺微血管通透性是通过政府azovan coerulen通过尾静脉注射。的内容azovan coerulen决心在波长625纳米,这是用来确定肺微血管通透性的程度。

2.10。Wet-to-Dry体重比率测定肺组织

牺牲后,肺组织被从老鼠迅速获得以权衡湿重。随后,组织在70°C 72 h烤,直到恒重。后来,wet-to-dry重量比率计算。所有的测试进行了至少一式三份。

2.11。统计分析

所有与SPSS 20.0统计分析。提出了定量数据均值±SEM,至少从三个独立的实验。在统计上有显著差异的平均值被学生的测试以及使用Dunnett或单向方差分析的测试在多个比较。的差异值< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。海拔AngII AAD复杂ALI患者的血液样本

的浓度AngII患者AAD的复杂与阿里相比显著升高正常个体和AAD病人没有阿里(图1),这暗示AngII可能与发病有关的油气地质复杂的阿里。

3.2。AngII导致肺微血管通透性的高度通过诱导肺损伤

基于卓越的海拔AngII在油气地质复杂的ALI患者,在这项研究中,我们试图通过微型泵诱导ALI AngII。此外,PP2 (Src激酶抑制剂)是通过腹腔内注射确定角色Y685-VE-cadherin磷酸化的肺微血管屏障功能和阿里由AngII。他染色和immunohistostaining显示明显的肺肠水肿在小鼠模型中,连同大量炎症细胞浸润在肺组织AngII组(图2)。此外,肺微血管通透性和wet-to-dry (W / D)比率在肺显著升高(表2)。然而,AngII + PP2组中,没有发现明显的变化在肺巨噬细胞和中性粒细胞的浸润组织相比AngII组。除此之外,没有发现明显的变化在肺微血管通透性和W / D AngII + PP2组和AngII组之间的比率。

3.3。AngII诱导PMVECs渗透率的增加

肺微血管内皮渗透性是肺损伤的发病机制的关键(24]。调查的AngII内皮屏障功能,培养PMVECs四组(即。,control group, AngII group, AngII+PP2 group, and PP2 group) were subject to determination of monolayer PMVECs permeability using the electrical cell substrate impedance sensing (ECIS) system. In the confluent and quiescent monolayer, the transendothelial impedance in PMVECs was apt to decrease 10 minutes after AngII stimulation, which reached the minimal concentration at 30–40 min after stimulation. After administration of PP2, the transendothelial impedance showed continuous decrease (Figure3),这表明AngII刺激可能导致瞬态海拔PMVEC渗透率。然而,这样的进步是抑制Src激酶后不断增加。

3.4。PMVEC AngII诱导细胞凋亡

据报道,内皮细胞屏障损伤是血管内皮细胞凋亡密切相关25]。在本节中,流式细胞术进行了确定培养的细胞凋亡PMVECs四组(即。对照组,AngII集团AngII + PP2集团和PP2集团)。没有明显的细胞凋亡诱导AngII刺激后3小时内;然而,细胞凋亡显著发现12 h-24 h刺激后,尤其是在团体PP2干扰。有趣的是,细胞凋亡是PP2小组注意到12 h和24 h,分别(图4)。这说明细胞收缩和增加细胞间隙引起的内皮细胞骨架重排而非内皮细胞凋亡是导致因素的短期增加内皮屏障后渗透率AngII刺激而在后期阶段AngII刺激后,内皮屏障损伤和海拔高度的渗透性主要是与明显的内皮细胞凋亡有关。综上所述,PP2可能抑制Src激酶活性增加PMVEC细胞凋亡,但这种现象并没有观察到后3小时内PP2干扰。

3.5。AngII pY685-VE-Cadherin水平下降和VE-Cadherin小鼠肺组织

调查的影响AngII pY685-VE-cadherin的磷酸化,免疫印迹分析。结果表明的Y685 VE-cadherin对照组肺组织的磷酸化在某种程度上。然而,AngII刺激后,pY685-VE-cadherin水平显著下降,尤其是在AngII + PP2组。与此同时,pY685-VE-cadherin PP2治疗后对照组也降低(图5(一个))。此外,VE-cadherin水平也显著降低AngII刺激后,虽然没有明显的变化发现PP2治疗后(图5 (b))。所有这些表明AngII可能导致Y685-VE-cadherin的去磷酸化,Y685-VE-cadherin可能差别,但对这些基因的差别有关对这些VE-cadherin AngII引起的。

3.6。AngII诱导的Y685-VE-Cadherin PMVECs脱磷酸化

AngII确定Y685-VE-cadherin诱导的去磷酸化,我们确定磷酸化Y685-VE-cadherin PMVECs AngII治疗后。结果表明,VE-cadherin被磷酸化的Y685 PMVECs在生理条件下。Y685-VE-cadherin的去磷酸化PMVECs AngII诱导时间的方式。确切地说,pY685-VE-cadherin水平达到最低水平大约30分钟后AngII刺激,但VE-cadherin下降后约12 h AngII刺激(图6(一))。这表明AngII导致脱磷酸作用Y685-VE-cadherin在早期阶段。pY685-VE-cadherin显然降低了约1 h AngII或PP2刺激后。在AngII + PP2集团pY685-VE-cadherin进一步降低(图6 (b))。这表明,脱磷酸作用的潜在机制Y685-VE-cadherin AngII和PP2是不同的。此外,Src Y685-VE-cadherin磷酸化的激酶是至关重要的。

3.7。角色PMVEC Y685-VE-Cadherin去磷酸化的骨架重排AngII引起的

肌动蛋白细胞骨架重组和扰动与其他模型系统至关重要,细胞死亡独立PMVEC屏障破坏机理(26,27]。此外,磷酸化的Y685 VE-cadherin是内皮屏障功能障碍密切相关28,29日]。因此,我们检查了PMVECs形态学和细胞内的分布和安排phalloidin f -肌动蛋白纤维在固定细胞的染色和荧光共焦显微镜。图7表明,f -肌动蛋白纤维主要是局部在老鼠PMVECs外围细胞膜。AngII或PP2刺激后,pY685-VE-cadherin下降,,同时,明显的变化被发现在f -肌动蛋白纤维的形态和分布,结合应力纤维细胞的存在。在AngII + PP2集团pY685-VE-cadherin进一步下降。丝状伪足PMVECs被注意到,与内皮收缩、增加细胞间隙。综上所述,我们推测,去磷酸化Y685-VE-cadherin可能积累密切相关,细胞骨架的重排。

4所示。讨论

油气地质复杂的机理与阿里仍不明确。几个因素已报告等相关疾病,包括全身急性炎症反应,血清MMP-9,体温,和AAD的规模2,4,30.,31日]。我们的研究结果表明,AngII水平更高的AAD患者复杂阿里相比之下,那些没有或正常的个体。在此基础上,我们推测,AngII可能涉及与阿里AAD的发病机制复杂。我们建立了一个老鼠通过抽水AngII ALI模型,肺微血管通透性的增加以及大量炎症细胞浸润和明显的水肿。综上所述,我们推测AngII可能诱发阿里通过损害肺微血管内皮屏障。

VE-cadherin,由780个氨基酸组成,是一个重要组成部分的血管内皮粘附[32,33]。在结构,VE-cadherin由细胞外区域,胞内区、跨膜区。细胞外区域可能坚持邻VE-cadherin血管内皮细胞,而细胞内的地区可以坚持P120-catenin,β连环蛋白和plakoglobin。除此之外,它可以形成VE-cadherin复杂的一起α连环蛋白和f -肌动蛋白34- - - - - -36),扮演了重要的角色在内皮屏障功能通过压缩血管内皮细胞的粘附(10,36]。

酪氨酸的磷酸化的胞内区域VE-cadherin VE-cadherin复杂的稳定至关重要。VE-cadherin ICAM-1导致磷酸化的刺激,这是一个adherens结拆卸的先决条件。在HUVECs激酶Src和Pyk2使磷酸化VE-cadherin p120和β连环蛋白结合位点酪氨酸残基658年和731年,分别。这种抑制p120的绑定β连环蛋白VE-cadherin 33。因为这些蛋白质之间的相互作用与VE-cadherin adherens为留住VE-cadherin结至关重要,这种情况会使连接不稳。此外,Rac1导致VE-cadherin于665年丝氨酸的磷酸化,激活信号其clathrin-dependent内化(37]。

最近的研究显示,Y685-VE-cadherin的磷酸化是相关的动态和粘合连接处并且血管内皮通透性炎症因素的刺激下(28,29日]。Wallez等人发现VEGF-induced-VE-cadherin酪氨酸磷酸化是由Src Y685,这个过程似乎是VEGF-induced内皮细胞迁移的关键(28]。西迪贝等人报道,血管内皮生长因子诱导VE-cadherin酪氨酸磷酸化在Y685 Src-dependent方式和网站Y685 VE-cadherin参与的生理调节毛细血管通透性(38]。此外,Orsenigo等人发现,VE-cadherin磷酸化Y658 Y685体内,在静止条件下静脉。此外,血管舒缓激肽可能诱发的磷酸化Y658 Y685 VE-cadherin,导致内化和泛素化磷酸化VE-cadherin和海拔血管通透性,而在体外研究表明,点突变Y658F和Y685F有助于预防血管内皮钙粘蛋白内化,泛素化,高度渗透的缓激肽(29日]。

我们的研究显示VE-cadherin磷酸化在Y685 PMVECs在静止的条件下。pY685-VE-cadherin是减少PMVECs AngII刺激后15分钟,达到最低水平后约30分钟的刺激。然而,VE-cadherin开始减少的水平大约12 h后AngII刺激。这些表明,AngII可能诱发的Y685-VE-cadherin PMVECs脱磷酸化。后PP2 (Src激酶抑制剂)治疗,pY685-VE-cadherin进一步抑制的水平,这表明Src激酶的磷酸化可能涉及Y685-VE-cadherin。

相关内皮屏障功能主要是内皮细胞凋亡和细胞骨架重排(25- - - - - -27]。在这项研究中,没有观察到明显的细胞凋亡PMVECs AngII刺激后3小时以内,但异常的变化被发现在细胞骨架与细胞收缩。这也许可以解释AngII内皮渗透性的增加在早期阶段,然而,在AngII PMVECs刺激,凋亡改变注意到12 h后刺激,这可能会负责后期AngII刺激后内皮通透性增加。

Y685-VE-cadherin的脱磷酸作用是证明有关PMVECs骨架重排。AngII可能引起脱磷酸化的Y685-VE-cadherin PMVECs,一起明显的f -肌动蛋白的形态和分布的变化,以及积累的应力纤维,然而,PP2治疗后,Y685-VE-cadherin脱磷酸作用的进一步增加,和异常的变化被发现在内皮细胞形态和高程PMVECs骨架重排,以及增加细胞的渗透性。

总之,AngII在Y685-VE-cadherin脱磷酸化的影响是一个重要的调节机制VE-cadherin生物功能。突出本文的发现是AngII可以通过诱导内皮屏障通透性增加内皮细胞骨架重排在早期阶段,在脱磷酸作用引起Y685-VE-cadherin AngII等生物过程中发挥了至关重要的作用。这些结果表明,脱磷酸化的Y685 VE-cadherin回应AngII可能是一个关键球员AngII引起的内皮屏障功能障碍。这些发现提供了新的战略管理与阿里油气地质复杂。除此之外,这些发现批准,Src激酶磷酸化的至关重要Y685-VE-cadherin Src Y685作为目标。然而,我们不能排除这种可能性,抑制Src激酶可能触发其他内源性保护机制PP2恶化的原因没有影响肺损伤小鼠AngII所致。

相互竞争的利益

所有作者宣称他们没有利益冲突。