文摘

新生儿小肠是容易受到氧化应激造成的损害。本研究的目的是评估抗氧化剂防治作用的保护作用(NAC)在肠上皮细胞氧化损伤引起的H₂O₂。IPEC-J2细胞培养与南汽DMEM-H和H₂O₂。为期两天的潜伏期后,IPEC-J2收集细胞DNA合成的分析,抗氧化能力,线粒体呼吸、细胞凋亡。结果表明,H₂O₂显著降低()增殖率、线粒体的呼吸作用和抗氧化能力和增加细胞凋亡和相关的丰富的蛋白质,包括细胞色素C, Bcl-XL caspase-3裂解,和总caspase-3。NAC补充显著增加()增殖率、抗氧化能力和线粒体生物能学但减少细胞凋亡。这些发现表明,NAC可能拯救肠道损伤引起的H₂O₂。

1。介绍

新生儿小肠内毒素引起的特别容易受到伤害,这损伤可能参与血浆和细胞内活性氧(ROS)的生产,导致细胞凋亡,降低抗氧化能力和线粒体功能障碍(1- - - - - -3]。肠道上皮细胞,人体与环境之间的边界,是主要的运输养分。肠上皮细胞是有害因素的主要目标和压力,例如,毒素和活性氧(4]。此外,大量的证据表明,氧化剂衍生品和ROS产生超过粘膜发炎,可能在某些肠道疾病致病因素(5,6]。氧化应激产生的活性氧和抗氧化剂之间的不平衡导致关节炎的发病机制,癌症、心血管疾病、肝脏和呼吸道疾病(7]。ROS是通用的,包括各种各样的分子、自由基,或离子来源于分子氧,例如,单线态氧(O₂),超氧化物阴离子自由基()、过氧化氢(H₂O₂)和氢氧自由基()[8]。活性氧引发广泛的反应(9]。低剂量的ROS促有丝分裂的,促进细胞增殖,而中间剂量的活性氧诱导临时或永久增长被捕,和高剂量的活性氧导致细胞死亡9]。H₂O₂是一个丰富的稳定形式的ROS,应对炎症、细胞功能障碍,细胞凋亡,最终导致组织和器官损伤。线粒体是细胞内氧化应激的主要目标和被认为是内源性活性氧的主要来源。先前的研究表明,急性noncytotoxic剂量的H₂O₂造成延迟线粒体的分裂网和沮丧的线粒体膜电位和最大呼吸速率(10]。因此,H₂O₂全身的伤害是一种可再生的和简单的模型导致氧化应激。

防治(NAC),半胱氨酸的先驱,被认为是一种抗氧化剂,充当硫醇的来源和功能在谷胱甘肽合成,谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活动,解毒和直接作用于活性氧化剂自由基作为过氧化物等与ROS的清道夫和H₂O₂(7]。先前的研究表明,断奶没有和H的浓度增加₂O₂血清在断奶仔猪,喂养antioxidant-containing饮食可以防止ROS-induced损伤和抑制氧化应激(11]。越来越多的证据表明,NAC可能是一个有前途的代理改善肠道健康仔猪(12]。补充NAC可以减轻粘膜损伤和改善小肠的吸收功能在脂多糖(LPS)挑战小猪(13]。南汽调节抗氧化反应、细胞凋亡和表皮生长因子基因表达在醋酸挑战[6]。然而,南汽的机制在肠道损伤产生保护作用不完全理解。

我们假设NAC增强细胞生长和线粒体生物能疗法和减少细胞凋亡在H₂O₂全身在肠道细胞氧化损伤。本研究的目的是使用H模型来测试这个假说₂O₂全身损害肠道猪上皮细胞(IPEC-J2)。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

试剂和细胞培养指的是我们之前的研究(14]。High-glucose(25毫米)杜尔贝科的修改鹰(DMEM-H),胎牛血清(的边后卫)和抗生素从英杰公司采购(美国纽约大岛)。塑料生产的文化板块康宁公司(美国纽约康宁)。除非表示,所有其他化学品都购自Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)。

IPEC-J2细胞被播种和培养DMEM-H中含有10%的边后卫,5毫米谷酰胺,100 U /毫升青霉素,100μ在37°C g / mL链霉素5%的股份有限公司₂孵化器。一夜孵化后,细胞被更改为文化基础培养基含有0或800μ米南汽。第二天,0或100μM H₂O₂添加了4个小时,然后媒介被改变了。为期两天的孵化后收集细胞的进一步的研究。

2.2。细胞生存能力分析

约1×10⁴细胞每好IPEC-J2细胞被播种在96孔板和像往常一样增长。在孵化后0,500,650,800,或1000μM NAC介质24 h,然后100年μM H₂O₂添加4 h。井洗和新鲜的基础培养基所取代。细胞计数Kit-8 (CCK-8)被添加到每个,孵化2 h,和阅读在450 nm的分光光度计;测量吸光度与可行的细胞的数量成正比。

2.3。DNA合成测量

IPEC-J2细胞(1×10⁴)在96年被播种,盘子和培养的为期两天的时间。DNA合成在所有治疗组细胞增殖是量化使用5-ethynyl-2′脱氧尿苷(EdU;英杰公司)合并使用Cell-Light EdU工具包(瑞博生物技术有限公司,广州,中国),描述在我们先前的研究[1]。短暂,IPEC-J2细胞培养在DMEM-H包含50个媒介μM EdU 1 h。一个奥林巴斯BX51显微镜(日本奥林巴斯)被用来观察EdU-positive细胞。的图像Apoll®567赫斯特33342被抓获。EdU-positive细胞的百分比表示的配给红核细胞蓝核细胞在至少五个不同的微观领域为计算随机选择200倍放大。

2.4。抗氧化能力的检测

IPEC-J2细胞(50×10⁴)被播种在10厘米菜总抗氧化能力的测定(T-AOC)和乳酸脱氢酶(LDH)使用相应的分析工具(南京,南京建成,中国)根据制造商的指示2]。所有样品都是通过测量紫外/可见分光光度计(UV - 2450(日本岛津公司,日本京都)的结果。

2.5。流式细胞术分析

IPEC-J2细胞(10×10⁴)被播种在6-well流式细胞术分析细胞培养板。在为期两天的时间的文化DMEM-H中包含0或800μ南汽和0或100μM H₂O₂、中、分别收集细胞。约1×10⁶在16 000×g细胞颗粒状5分钟。上层清液被除去,1毫升70%冷乙醇在慢慢添加在激烈的混合。样本储存在4°C。细胞被洗一次冰冷的PBS和resuspended 1毫升的染色试剂含有50毫克/毫升π和100毫克/毫升核糖核酸酶在黑暗中30分钟。评估细胞凋亡,收获细胞被沾染了π/ Annexin-V-FITC(南京凯基生物,中国)根据制造商的指示。细胞周期阻滞和细胞凋亡分析流式细胞仪(美国BD FACSCalibur)。荧光π和Annexin-V-FITC监控在630 nm和525 nm,分别。

2.6。代谢分析

XF-24细胞外磁分析器从海马生物科学和细胞水压力测试工具被用来检查NAC治疗线粒体呼吸的影响在H₂O₂全身的细胞被谭et al。15]。在为期两天的时间的文化,改变了基础培养基前生物能量学测量无血清无缓冲的(没有碳酸氢钠)DMEM培养基基础上补充2毫米谷酰胺,25毫米葡萄糖、丙酮酸钠和1毫米,在pH值在37°C。线粒体功能的测量指标,寡霉素,羰基cyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP),按顺序注射鱼藤酮和抗霉素A 0.5的最终浓度,1,1μM,分别。这允许一个估计的贡献non-ATP-linked耗氧量(质子漏)和ATP-linked线粒体耗氧量(ATP生产)。最大呼吸能力决定使用FCCP-stimulated率。备用呼吸能力是由最大呼吸能力减去基线的耗氧速率(OCR)。残留的氧气消耗发生在鱼藤酮和抗霉素A是归因于nonmitochondrial呼吸,减去所有测量值的分析(1]。由于NAC对IPEC-J2扩散的影响,确定细胞总蛋白和使用规范化的线粒体呼吸率。

2.7。并用gc - ms检测柠檬酸循环的中间体

IPEC-J2细胞(50×10⁴)被播种在10厘米菜肴的gc - ms分析所述盛田et al。16]。简单地说,细胞被洗PBS和0.25%胰蛋白酶处理。然后在1000×g细胞收集和颗粒状5分钟。淬火后使用500年μL prechilled 50% (v / v)甲醇,在1000×g细胞离心5分钟然后删除和增加了500μL prechilled 100% (v / v)甲醇。细胞被测量的安捷伦7890 b - 5977 a gc - ms配备HP-5ms (30 m×250μ米×0.25μ米)毛细管柱(美国安捷伦J&W,圣克拉拉,CA)。所有代谢物以前使用的标准(σ)进行验证。

2.8。免疫印迹分析

细胞用PBS冲洗两次,收获,通过离心分离颗粒状,细胞溶解在缓冲区里帕(Triton x - 100年150毫米氯化钠,1%,0.5%钠脱氧胆酸盐,0.1% SDS, 50毫米Tris-HCl PH值7.4),加上一个蛋白酶抑制剂鸡尾酒和磷酸酶抑制剂。蛋白质浓度的细胞匀浆测定采用BCA法和牛血清白蛋白标准,描述了我们先前的研究[1]。所有样品都调整到同等浓度。可溶性蛋白质受到sds - page和转移到PVDF膜,阻止在Tween-20 TBS-with 0.05%与5%脱脂牛奶1 h,和孵化一夜之间在4°C以下主要抗体隔夜温和摇摆:细胞色素C (1: 1000;细胞信号技术)、伯灵顿(1:1000;细胞信号技术)、caspase-3 (1: 1000;细胞信号技术)、Bcl-XL (1: 400;圣克鲁斯生物技术、达拉斯、TX)、裂解caspase-3 (1: 400;圣克鲁斯生物技术、达拉斯、TX),或β肌动蛋白(1:400;圣克鲁斯生物技术、达拉斯、TX),其次是辣根peroxidase-linked二级抗体。使用化学发光试剂蛋白质乐队是可视化。蛋白质乐队的密度是决定使用Alpha成像仪2200软件(αInnotech公司)与内部控制规范化的数据。

2.9。统计分析

结果表示为±SEM。统计分析是由单向方差分析使用SPSS 17.0(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。概率值< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。H的影响₂O₂和南汽IPEC-J2细胞的细胞生存能力

可行性分析IPEC-J2细胞是由首先治疗细胞与不同浓度的NAC(0、500、650、800和1000μM, resp)。一天,然后有100μM H₂O₂4 h。结果表明,100年μM H₂O₂IPEC-J2细胞生存能力下降,而添加NAC增强细胞的可行性₂O₂剂量依赖性的方式对待IPEC-J2细胞,800年和1000年μ米南汽之外显示最好的促销效果比0到500μM NAC治疗H₂O₂治疗细胞()(图1)。EdU合并的结果见图2表明,EdU-positive细胞的百分比明显降低针对H₂O₂治疗(),而添加NAC细胞表现出倾向于增加EdU-positive细胞的百分比与NC组。

3.2。线粒体生物能学

IPEC-J2细胞线粒体呼吸的结果如图所示3。除了100年的μM H₂O₂逐渐减少()个人参数基础呼吸、质子漏,最大呼吸,nonmitochondrial呼吸和细胞内ATP生产而增加NAC升高线粒体的呼吸速率在100年μM H₂O₂治疗细胞(),但不是在正常细胞。

3.3。三羧酸循环中间体

丙酮酸的相对含量,乳酸,柠檬酸循环中间体(柠檬酸、alpha-ketoglutarate、琥珀酸、反丁烯二酸和苹果酸)IPEC-J2细胞见图4。除了100年的μM H₂O₂显著降低乳酸,柠檬酸循环中间体与数控治疗()。数控治疗相比,增加800人μ米南汽显著降低丙酮酸和乳酸(的内容),而没有差异的内容丙酮酸、乳酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸、α酮戊二酸南京和南京之间+ H₂O₂治疗()。

3.4。抗氧化能力

T-AOC和LDH的浓度呈现在图5。与NC组相比,100年μM H₂O₂T-AOC浓度明显降低,但增加LDH浓度()。然而,在H₂O₂处理细胞,添加NAC明显增加T-AOC的浓度,减少LDH泄漏到培养基()。

3.5。细胞凋亡

细胞凋亡被Annexin-V-FITC / PI染色分析,结果表明,与NC组相比,100年μM H₂O₂显著增加的早期和晚期凋亡细胞的比例,和800年μ米南汽之外还增加了细胞凋亡率()。然而,在H₂O₂处理细胞,增加800人μM NAC显著降低早期和晚期凋亡的比例()(图6)。

3.6。细胞凋亡相关蛋白表达水平

伯灵顿的相对表达水平细胞色素C, b细胞淋巴瘤/ leukaemia-XL (Bcl-XL)裂解caspase-3,蛋白质和总caspase-3图所示7。除了100年的μM H₂O₂蛋白质含量明显增加,细胞色素C、Bcl-XL caspase-3裂解,和总caspase-3蛋白(),而另外800人μ100年M NAC显著减少上述参数μM H₂O₂治疗细胞()。

4所示。讨论

南京有有前途的影响在不同的疾病,包括癌症、肝毒性、心血管疾病,和金属毒性17),由于它在衰减病理生理过程中的作用包括氧化应激、细胞凋亡和线粒体功能障碍(18]。此外,NAC可以减弱LPS-treated老鼠的肝脏的炎症(19]。同样,南京的补充报道提高生长性能和能量状态,减少炎症,改善组织损伤(12]。最近,易等人发现,NAC可以刺激蛋白质合成,抑制蛋白质水解IPEC-1细胞(20.]。在目前的研究中,我们发现,南汽不仅可以改善H₂O₂全身的细胞生长抑制,但在H也减弱线粒体功能障碍₂O₂处理细胞。此外,NAC下调mitochondria-depended细胞凋亡在H₂O₂处理细胞。因此,我们的数据表明,NAC可能通过改善线粒体功能修复肠道损伤。

胃内的或腹腔内管理的H₂O₂可以减少引起的生长性能和氧化应激(21- - - - - -23]。此外,以往的研究表明,H₂O₂(300μ24 h M)对鸡肠道上皮细胞显著减少细胞生存和SOD活性(24]。同样,结果表明,H₂O₂在100μM 4 h IPEC-J2的增长下降。此外,EdU-positive细胞的百分比在100年有所下降μM H₂O₂治疗。此外,报告显示,过量可能导致氧化损伤脂质细胞内ROS水平,通过细胞凋亡DNA和蛋白质(25]。在目前的研究中,线粒体功能被毁在H₂O₂治疗,根据结果风扇et al。10]。这些数据表明,H₂O₂诱导线粒体ROS生产然后在IPEC-J2导致DNA损伤细胞。易等人的报告表明,NAC IPEC-1细胞的生长增加,表明南汽在低浓度(< 1毫米)可能会刺激细胞生长(20.]。根据这些结果,这个实验表明,添加在500 - 1000年南京μM - 100μM H₂O₂治疗增加了细胞的可行性。并添加NAC享年800岁μM - 100μM H₂O₂增加了细胞增殖,表明NAC可以提高H₂O₂全身的细胞生长的伤害。

有越来越多的证据支持,NAC改善氧化还原状态和直接反应氧化代谢物(12,26,27]。NAC保护细胞免受氧化应激与ROS交互通过减少谷胱甘肽(GSH)和(12]。在这项研究中,H₂O₂暴露诱导氧化应激,降低细胞生存能力,抑制T-AOC,和LDH泄漏增加,而NAC治疗显著改善抗氧化系统。线粒体是细胞的能量,产生相当大份额的细胞ATP和发挥核心作用在细胞功能和新陈代谢28]。我们以前的报告表明,线粒体功能障碍与减少观察基底呼吸、最大呼吸,nonmitochondrial有限合伙人治疗后呼吸(1]。目前的数据还表明,线粒体功能损伤引起的H₂O₂观察,显示减少基底呼吸、质子漏,最大呼吸,呼吸产能,nonmitochondrial呼吸,ATP生产。体内,NAC决心改善线粒体解偶联,呼吸在发炎的肠道26]。我们的研究结果表明,NAC可以改善线粒体生物能疗法在H₂O₂处理细胞。先前的研究已经报道,南汽改进氧气交付(29日和全身耗氧量30.)刺激和调节线粒体三羧酸循环代谢的碳通量通过丙酮酸脱氢酶、肝细胞线粒体能量代谢的关键酶,乙酰辅酶a供应(31日,32]。我们的结果与这些先前的想法。结果表明,南汽影响细胞代谢丙酮酸、乳酸、琥珀酸、苹果酸、柠檬酸,导致线粒体氧化还原平衡和运输到线粒体氧化磷酸化影响ATP生产的(33,34]。

报告表明,活性氧和线粒体功能障碍可以调节细胞凋亡,表明活性氧是重要的在细胞凋亡35]。基于各种细胞类型的研究,越来越清楚的是,NAC可以抑制细胞凋亡(12,36,37]。流式细胞仪分析显示100μM H₂O₂显著诱导细胞凋亡,而NAC可以减弱这种影响H₂O₂通过抑制细胞凋亡在早期和晚期阶段,这是符合Mayer和高贵和沈等的研究(38,39]。令人难以置信的是,南汽的抑制细胞凋亡只是观察到H₂O₂治疗细胞和南汽在正常细胞诱导细胞凋亡,这需要进一步的研究。从线粒体细胞色素c的释放由于形成一个通道,线粒体apoptosis-induced频道,在线粒体外膜,起到监管功能,它先于形态学改变与细胞凋亡有关。该报告显示,通过内在途径介导的细胞凋亡。线粒体膜电位的损失增加细胞色素C的释放在胞液和激活一些proapoptotic分子(伯灵顿,caspase-9裂解,caspase-3,等等)的差别,造成对这些基因bcl - 2发生在剂量依赖性的方式40]。先前的研究发现,补充与南汽减毒caspase-3蛋白表达LPS-challenged猪小肠的(13]。在目前的研究中,我们指出,细胞凋亡相关蛋白表达的升高在IPEC-J2细胞H₂O₂治疗,但当NAC IPEC-J2加入细胞减少使用H₂O₂。因此,南汽的有益的影响可能与衰减有关细胞凋亡。

总之,H₂O₂诱导线粒体功能异常和细胞凋亡,而NAC促进DNA合成,线粒体生物能疗法,mitochondria-depended在肠上皮细胞凋亡。南汽在H cytoprotective效应的可能机制₂O₂全身损害IPEC-J2细胞回收H₂O₂然后改善细胞增殖、三羧酸循环和线粒体功能和减少细胞凋亡和死亡。从这些研究结果有重要影响的使用NAC氧化损伤的新生儿临床管理的猪。

信息披露

郝肖和吴苗苗是共同第一作者。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

确认

这个项目由973个国家工程(2013 cb127302),中国国家自然科学基金(31330075,31330075,31330075,31301989,31560640),开放项目计划的食品科学与技术国家重点实验室,南昌大学(sklf - kf - 201416),农业生态过程的开放重点实验室的基础在亚热带地区,亚热带农业研究所,中国科学院(ISA2015303)和美国国家科学技术部(2014 bad08b11)。