文摘
本研究旨在调查饮食的影响壳聚糖对小鼠胃肠道病原体耐药性(COS)模型。两周,对照组ICR小鼠获得基底的饮食而干预组基底因为饮食补充300毫克/公斤。两周后,白鼠补充饮食较低体重。然后产肠毒素的大肠杆菌(大肠杆菌)管理通过口服填喂法小鼠,与每个鼠标接收108CFU。在感染后的第七天,空肠和粪便中的细菌负荷因为组明显低于对照组。此外,信使rna和蛋白质水平的il - 1il - 6, IL-17、地震和TNF -在组显著降低小鼠接受因为饮食;toll样的空肠的生产receptor-4因为集团(地)被抑制。这些结果表明干预和控制炎症的影响大肠杆菌感染。
1。介绍
对大多数人来说,产肠毒素的大肠杆菌(ETEC)感染只是不愉快和不方便旅行者腹泻的原因在许多实例。ETEC负责大部分的腹泻病在发展中国家;根据那些声称每年大约380000人的生命1)5岁以下儿童是特别脆弱。ETEC也普遍在新生的农场动物,如小猪(2]。
ETEC感染病原体暴露后通常出现1 - 3天,表现为急性水样腹泻和发热、头痛和呕吐。这些症状通常持续3 - 4天虽然有些人可能感到腹泻一周或更长时间(3]。ETEC殖民小肠和释放肠毒素引起肠上皮细胞(IEC)分泌液体进入肠道内腔,导致腹泻(4]。在断奶仔猪ETEC的影响最小化,抗生素经常添加到他们的饮食,为了最小化传染病和促进经济增长。然而,这种做法可能会导致耐药性病原体耐药细菌通过创建一个水库。这些细菌可能抗性基因转移给其他动物和人类的肠道致病菌5]。同时,存在药物残留是许多消费者的关注;因此,牲畜饲料常规抗生素已经在许多国家禁止或限制。
壳聚糖是一种丰富的nitrogenated多糖;它是真菌细胞壁的组成部分和外骨骼的昆虫和多样的海洋生物,如甲壳类动物、鱿鱼、蛤蜊。壳聚糖是来自几丁质。猪的免疫反应6],老鼠[7),大鼠(8),和鱼(9由壳聚糖调制。T细胞和其他免疫细胞产生细胞因子,在免疫反应起着至关重要的作用。体外研究表明,脱乙酰作用的程度和分子量因为与抗炎作用的程度呈正相关(10]。虽然一些研究试图评估壳聚糖的影响在猪和鸡的肠道细菌(11)壳聚糖在炎症和细菌反应的影响和感染后仍然是有限的。一个可能的机制,壳聚糖可能操作破坏大肠杆菌粘附在空肠。
构成本研究的假设是,饮食补充壳聚糖可以直接清楚产肠毒素的大肠杆菌和减少促炎信号和/或增加抗炎反应期间感染。我们测试了产肠毒素的假说大肠杆菌感染模型;细菌数和促炎的分子的变化进行评估。
2。老鼠和饮食
这个实验使用20岁的ICR小鼠(癌症研究所)6周;他们培育和保持在湖南农业大学。批准所有实验程序的老鼠获得湖南农业大学动物保健和使用委员会。老鼠分别被安置在无菌住宿在适当的环境条件下(25°C;相对湿度53%;12小时光/暗周期)。他们有广告自由访问一个适当的啮齿动物的饮食(12)和水。老鼠被随机分配到两组(控制和壳聚糖干预)。内毒素免费壳聚糖(平均分子量< 1 kDa;脱乙酰作用度> 95%)捐赠了大连化学和物理研究所(中国科学院大连,中国)。两周,对照组收到了基底饮食和干预组给予基础饮食补充300毫克/公斤的壳聚糖。剂量和持续时间确定基于之前的研究(6]。在整个实验期间,饲料和水的摄入量,连同身体体重增加,是监测和记录。
3所示。产肠毒素的大肠杆菌感染和枚举
两周后的基底或补充饮食,然后老鼠感染108CFU ETEC SEC470 [13]。在感染后7天,所有的老鼠都被有限公司2窒息。空肠的组织被单一化,连续稀释,然后镀到MacConkey与抗生素庆大霉素琼脂(40μg / mL)和四环素(50μg / mL)。空肠的内容和粪便被加权,然后悬浮在PBS缓冲。然后连续稀释是放在MacConkey琼脂用庆大霉素治疗(40μg / mL)和四环素(50μg / mL)。24小时后,细菌菌落是统计。PCR验证的身份进行细菌分离。使用的引物(5′-CTGTATACGTGGCAG-3′)和(5′-ACTATGGTGAATGCTCAC-3′)是从ETEC获得的fedF基因(加入基因库Z26520)。其他空肠的组织、空肠的内容和粪便样本收集和储存在−直到需要80°C。
4所示。rt - pcr和ELISA分析细胞因子
信使rna提取后用试剂盒试剂(美国表达载体),互补脱氧核糖核酸是反向转录。据肖rt - pcr进行et al。14]。的mRNA水平il - 1 、il - 6、IL-17地震,和肿瘤坏死因子- 进行分析与参考GAPDH基因。的蛋白质含量il - 1 、il - 6、IL-17地震,和肿瘤坏死因子- 分析了根据任et al。15)的酶联免疫试剂盒eBioscience、钙、美国。
5。免疫印迹的地
测量水平的地,适当地分析工具使用(美国MI开曼化学公司)。相等数量的蛋白质从空肠组织收集使用sds - page分离。然后根据样本分析方法描述了一个以前的报告16]。使用肌动蛋白蛋白质作为参考,信号的强度是衡量数字。
6。统计分析
数据提出了意味着±标准平均误差(SEM)。所有的统计分析都使用SPSS 22.0软件进行(美国芝加哥,IL)。学生的t以及用于分析数据差异的控制和干预组。不同水平被认为是重要的。
7所示。结果
在两周的时间内,平均摄入量较高的饲料和水chitosan-supplemented老鼠比控制老鼠()(数据1(一)和1 (b))。尽管如此,老鼠的体重得到壳聚糖补充显著低于对照组()(图1 (c))。在实验中,没有观察到腹泻。在感染后7天,因为组ETEC加载在空肠的内容、粪便和空肠组织显著降低(比在对照组(图)2)。
(一)
(b)
(c)
感染后,七天的表达il - 1 il - 6, IL-17,地震,和肿瘤坏死因子- 信使rna显著低于COS-fed老鼠相比的空肠控制(图3)。ELISA结果证实il - 1的趋势il - 6, IL-17、地震和TNF -因为老鼠(表中被大大降低1)。
如图4表示因为组空肠的TLR4蛋白质水平显著降低()比对照组。
8。讨论
众多研究表明,膳食补充剂的壳聚糖可以减少体重和体重管理和肥胖可能申请(7,17]。在实验期间,老鼠接受108CFU ETEC SEC470没有遭受任何腹泻。许多研究表明,老鼠受到ETEC不会患有腹泻;然而,ETEC可能在肠道,促进炎症反应(18]。因此我们进一步研究了老鼠的体重。结果表明,老鼠chitosan-supplemented饮食经验的减少体重。这其中的一个机制,提出了壳聚糖降低餐后的载脂蛋白B亚型(飞机观测),低密度脂蛋白胆固醇和高密度脂蛋白。这是基于研究的结果对脂质代谢的影响在glucose-tolerant老鼠接受高蔗糖的饮食(19]。壳聚糖粒子与胆固醇和脂肪酸结合形成集群在胃肠道,从而减少脂类的吸收(20.]。除了影响脂质吸收,壳聚糖被描述为降低血糖水平,能够抑制碳水化合物水解酶麦芽糖酶、蔗糖,sucrose-isomaltase在肠道21,22]。
本研究的结果显示,与对照组相比,因为小鼠显著降低负载ETEC的细菌。Tayel报告称,壳聚糖可以抑制细菌的生长等大肠杆菌,肠杆菌科,和金黄色葡萄球菌(23]。因为是D-glucosamine低聚物,它是抵抗消化酶降解。因为可能生存消化酶进入空肠,干扰ETEC肠道上皮细胞的粘附。
在这项研究中空肠的信使rna和蛋白质水平的il - 1、il - 6、TNF -,并观察地在回答chitosan-supplemented饮食在老鼠身上。肠上皮细胞表达细胞因子和趋化因子受体以及toll样受体,如地(16]。TLR4新兵适配器蛋白质、MyD88 TIRAP激活NF -κB,进而诱发信号基因的表达,如肿瘤坏死因子-、il - 1和il - 6 (18]。提出地表达在肠道上皮细胞与一个增强粘膜炎症反应和随后的肠上皮屏障的功能障碍(18]。我们的研究显示抑制地因此mRNA和蛋白的表达水平的il - 1、il - 6和TNF -相应降低。因为对小鼠抗炎作用的提出源于COS抑制肠道ETEC感染。有趣的是在我们之前的研究中,il - 1的mRNA水平,il - 6在ETEC-challenged仔猪摄入300毫克/公斤因为饮食均明显高于对照组(6]。这种差异可能是由于两个原因:首先,它可能需要更多的时间在小猪应对复杂的细胞因子网络因为饮食;因此,il - 1空肠粘膜和il - 6 mRNA水平仍然高采样期间;其次,样品用于mRNA分析不同,仔猪空肠粘膜被用于分析模型和空肠的组织被用于小鼠模型。
这里的结果也表明,IL-17空肠的表达式和减少了地震-壳聚糖补充。IL-17,制造的反应诱导(iTh17)和自然(nTh17)辅助T细胞,是一个新兵的促炎细胞因子单核细胞和中性粒细胞炎症区域;它还能刺激当地的趋化因子的合成。它已经涉及许多自身免疫性疾病(24]。另一方面,强烈地震,另一个促炎细胞因子,参与抗肿瘤和宿主防御反应。基因治疗研究,增加的地震已被证明为实验动物提供保护,以防止感染,肿瘤生长和转移。然而,过度的地震已被证明导致小鼠肺气肿的病变(25]。壳聚糖降低空肠的细菌负荷,降低ETEC负载可能会减少肠道细胞因子的表达。
总结,壳聚糖补充剂降低小鼠的体重,是一种有效的预防对体内感染产肠毒素的大肠杆菌。这里给出的结果表明,因为细菌负荷减少,地和细胞因子的生物合成。因为可能的进一步发展提供了一个有效的方法来促进肠道健康和防止产肠毒素的大肠杆菌感染。
相互竞争的利益
作者宣称没有利益冲突有关的出版这篇文章。
确认
这个项目是由中国科学院国际合作项目的支持(161343 kysb20160008),中国国家重点研发项目(2016 yfd0500504),中国国家自然科学基金(31672457和31672457号),中国农业中华人民共和国(2015 - z64和2016 -开发)x47和湖南省科学技术厅(2016年2016 nk2101 2016 wk2008, tp2005)。这个项目也是部分财政支持沙特国王大学,通过研究副院长职椅子。