文摘
背景。血脂异常和糖尿病是两个最完善的风险因素的心血管疾病(CVD)的发展。他们通常激活一个复杂的一系列致病途径导致器官损伤。这里我们假设血脂异常和糖尿病会影响osteoprotegerin(功能)和TNF-related凋亡诱导配体(TRAIL)表达在血管和心脏。材料和方法。基因和蛋白质表达的功能、小径和功能/小道比率在主动脉和量化控制老鼠的心,dyslipidemic老鼠,老鼠和糖尿病。结果。糖尿病功能显著增加和主动脉的功能/跟踪比表达式,而血脂异常的主要决定因素是变化观察到心脏,它极大地增加功能,降低轨迹表达式,从而增加心脏功能/小道比率。结论。这项工作表明,血脂异常和糖尿病影响心血管系统的功能/小道比率。这可能导致的循环功能变化/跟踪观察患者的糖尿病和心血管疾病。最重要的是,这些变化可以调解/促进动脉粥样硬化发展和心脏重塑。
1。介绍
在工业化国家,心血管疾病(CVD)仍然是发病率和死亡率的主要原因。当前科学的观点是心血管疾病发生的一系列事件,形成一个连续体(1]。这个连续体的第一阶段对应于风险因素的存在,使组织损伤,如高血压、血脂异常、糖尿病(2]。通常这些危险因素激活一个复杂的各种致病途径导致动脉粥样硬化和缺血性心脏病的发展。未能有效地管理任何阶段的连续导致心室肥大,心脏衰竭,终末期心脏病和心血管死亡。
的分子途径之一可能被激活,以应对这些危险因素和参与心血管疾病发展是osteoprotegerin(功能)和TNF-related凋亡诱导配体(TRAIL),作为了(3]。功能和小路都是肿瘤坏死因子超家族的成员,他们广泛表达于不同的组织,包括心脏和血管健康和疾病状态(4,5]。尽管最初似乎局限于骨代谢功能操作(6)和宿主防御肿瘤的小道7),最近的研究表明,这两种分子可能参与心血管疾病发展和进展(3]。
流行病学研究表明,有一个循环功能之间的联系,跟踪和心血管疾病。功能被发现直接相关(5,8,9),而小径呈负相关,与心血管发病率和死亡率(10,11]。同样,功能与c反应蛋白水平显著相关(12),这是一个独立的预测急性血管事件和不良结果,而小径是负相关的10]。最近,Secchiero和他的同事们已经表明,冠状动脉疾病患者功能/小道比率增加,进而增加心力衰竭患者发展中(13]。符合这一流行病学数据,实验研究表明,功能和小道有相反的动作,随着功能的促炎(12)和proatherogenic效应(14,15),而小径似乎抗炎(16,17]和antiatherogenic [18- - - - - -20.]。
基于这些前提,我们假设血脂异常和糖尿病,这是两个著名的心血管疾病的危险因素,可以修改血管和心脏功能的表达和记录,导致增加功能/路比在一个组织的水平。本研究的目的是探索血管和心脏功能的变化和跟踪实验模型的血脂异常和糖尿病。
2。材料和方法
2.1。动物模型和实验协议
共有12个雄性C57BL / 6 j小鼠(问)和24男性零(ApoE载脂蛋白E−−/)在C57BL / 6 j小鼠背景,年龄6周,14周进行了研究。在6周的年龄,载脂蛋白e−−/小鼠随机分为生理盐水(ApoE)或链脲霉素(ApoE + DM),在五连续每日剂量腹腔内交付。《每日剂量链脲霉素(STZ) (Sigma-Aldrich) 55毫克/公斤的体重。一个星期后,血糖检查,只小鼠血糖水平大于15毫米包括载脂蛋白e + DM组。在研究期间,所有的老鼠与一个标准的饮食。动物被保存在一个温控室(221°C)在12 h光/ 12 h黑暗周期与免费的食物和水,他们随意喂食长度的研究。14周后,动物麻醉的腹腔内注射thiobutabarbital钠(Inactin Sigma-Aldrich)(60毫克/公斤体重)和牺牲通过心脏穿刺放血。收集血液和组织(主动脉、心)进行进一步分析。
本研究进行了动物屋的里雅斯特大学。所有的动物实验动物伦理委员会批准的里雅斯特大学(ID 28.0.2008)和意大利卫生部、符合指南的护理和使用实验动物。
2.2。一般参数
在研究结束时,我们测量体重和收缩压(SBP)。特别是,SBP是由一个电脑化的无创性评估在有意识的老鼠尾巴袖口系统。葡萄糖、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇和甘油三酯测定血清中自我分析仪技术(日立917年,东京,日本)。循环水平的功能和跟踪测定血清ELISA(研发系统DuoSet # DY459和# DY1121)。
2.3。主动脉和心脏结构变化
在每组动物的一半,aortae neutral-buffered收集并放置在10%福尔马林对动脉粥样硬化量化,在加工前对免疫组织化学分析。在另一半,aortae snap-frozen在液氮和存储−80°C的RNA提取和基因表达分析。斑块面积是量化如前所述15]。短暂,aortae清理多余的脂肪和染色与苏丹IV-Herxheimer的解决方案。然后,他们被纵向解剖和压平到蜡。获得的图像解剖显微镜(奥林巴斯BX-50)配备高分辨率相机(索尼xc - 77 - ce)。数字化图像然后评估图像分析系统(Image-Pro + 6.3软件,媒体控制论)。量化斑块总面积是主动脉染成红色的面积百分比。
心,他们分裂的一半放在福尔马林一半放在液氮。在福尔马林固定的一部分嵌入在石蜡,切成4μ米厚的部分,和苏木精和伊红染色())来评估心肌细胞肥大。心肌细胞肥大是评估通过测量最短的直径200个细胞,被选中时显示,包括椭圆核纺锤形横截面。最短的横向直径测量3乘以每个细胞,和值是平均,据21]。另一半在液氮snap-frozen基因表达分析或用于免疫组织化学染色。
2.4。实时定量rt - pcr
基因表达功能和记录由实时定量rt - pcr(逆转录-聚合酶链反应)在主动脉和心脏组织。为了隔离信使rna从主动脉和心脏,组织是均质和加工之前报道(22]。然后,信使rna治疗与DNase失活试剂(已经没有dna Ambion细胞产品# - 1906),和3μ克mRNA随后被用于治疗与上标第一链合成系统合成cDNA rt - pcr (Gibco BRL)。基因表达的功能,分析了轨迹实时定量rt - pcr使用TaqMan系统功能(技术)和SYBR绿色系统(技术)。荧光定量分析了每个周期ABI棱镜7900 ht序列检测系统(应用生物系统公司)。功能基因表达的规范化18岁信使rna,而小径是Rps9规范化。结果报告为比例与未经处理的表达水平控制相比,这是一个任意的值为1。
2.5。免疫组织化学
功能的存在和小道aortae被4日疣状评估μ米厚的石蜡部分。特别是在柠檬酸缓冲(pH6)抗原检索后内源性过氧化物酶使用3% H就熄了10分钟2O2在PBS。本地化功能中,我们使用一个生物素化的山羊anti-OPG抗体(研发系统,1:10稀释),后跟一个催化信号放大系统(Dako)。定位跟踪中,我们使用一个鼠标anti-TRAIL单克隆抗体(研发系统,1:50稀释),应用在一夜之间在4°C。生物素化的山羊anti-mouse免疫球蛋白(向量实验室、稀释1:200)被用作二次抗体,随后streptavidin-HRP (Dako)。
功能的存在和小道的心被5日疣状评估μ米厚的部分冻结。内源性过氧化物酶中和后,一夜之间,部分被孵化的山羊anti-OPG抗体(研发系统,1:10稀释)和鼠标anti-TRAIL单克隆抗体(研发系统,1:50稀释)。生物素化的免疫球蛋白,稀释1:200年,然后应用二次抗体,随后streptavidin-HRP (Dako)。在这两种组织,染色的可视化是反应与3、3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride (Sigma-Aldrich)。与苏木精复染色后,所有的部分都由光学显微镜检查(奥林巴斯BX50WI)和数字化使用高分辨率的摄像机(Q-Imaging快1394)。棕色染色的面积比例是衡量图像分析系统(Image-Pro + 6.3软件,媒体控制论)为了量化功能和表达在aortae和心脏。
2.6。统计分析
结果表示为意味着±标准错误的意思。组间均值的差异进行了分析使用双向方差分析。成对多个使用Bonferroni测验后的分析进行了比较。被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。一般参数
老鼠被发表在表的一般参数1。ApoE−−/小鼠高总胆固醇和甘油三酯的水平比问老鼠。协议,符合研究载脂蛋白e + DM组的小鼠高血糖的。此外,糖尿病与显著减少体重和显著增加的总胆固醇与非糖尿病患者相比,载脂蛋白e−−/老鼠。
3.2。动脉和心脏结构变化
ApoE−−/老鼠总斑块面积显著增加,增加了进一步诱导后糖尿病(数字1(一)和1 (b))。至于心脏改变,血脂异常与显著增加心肌细胞大小(数字1 (c)和1 (d)),表明心肌细胞肥大,没有糖尿病的感应后进一步增加。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.3。功能和基因表达在主动脉和心脏
主动脉,诱导糖尿病与显著增加相关功能基因的表达和功能/跟踪比率,而血脂异常功能没有影响(图/小道比率比控制2(一个))。相比之下,在心脏,血脂异常的主要决定因素是功能/跟踪组织变化,不仅增加功能,而且通过减少基因表达。所以血脂异常显著增加心脏功能/小道比率,没有进一步的差异后,诱导糖尿病(图2 (b))。
(一)
(b)
3.4。功能和蛋白表达在动脉和心脏
疣状显示,糖尿病显著增加主动脉功能表达式与其他组相比,在小道不变(图3)。另一方面,在心脏,血脂异常,功能显著增加蛋白表达,没有进一步修改后诱导糖尿病。至于心脏小道,小道蛋白表达降低载脂蛋白和载脂蛋白e + DM组(数据没有显示)。
(一)
(b)
(c)
3.5。循环功能和记录
循环功能的水平反映了血管的变化。循环功能是ng / mL的对照组,ng / mL的载脂蛋白e组,载脂蛋白e + DM组,功能显著提高糖尿病小鼠相比其他组(载脂蛋白e + DM与问,与载脂蛋白e组)。血脂异常孤独没有影响功能循环水平。至于小道,我们无法测量它的循环水平,低于检测水平的我们使用的ELISA。功能已经认为,循环水平远高于其配体(RANKL和小道),可能是一个更稳定的整体测量功能/跟踪活动的记录(23]。
4所示。讨论
流行病学研究报告功能之间的联系、跟踪和心血管疾病。冠状动脉疾病患者功能/小道比率增加,进而增加的心力衰竭患者(13]。血脂异常和糖尿病是两个最坚定的心血管疾病的危险因素(2]。这里,我们对血脂异常的影响,单独和结合糖尿病,在主动脉和心脏功能和TRAIL表达和发现,虽然糖尿病的主要决定因素是功能/跟踪组织血管的变化,血脂异常是心脏。
这些数据符合先前的实验工作表明,糖尿病增加功能表达和主动脉的功能/小道比率(24),糖尿病的发病与增加循环功能(25]。与这些观察结果相一致的是,在我们的研究中,我们发现主动脉和循环功能显著增加只有在患有糖尿病的老鼠。总的来说,这些发现似乎支持这一假说,血管功能可能的循环水平增加的来源在糖尿病患者和/或心血管疾病。
必须指出的是,增加循环功能和组织不仅风险标志,而且动脉粥样硬化和心血管疾病的危险因素的发展。首先,动物模型点葡萄糖代谢调节功能的作用,功能作为注射显著增加血糖水平(12,26),这是心血管疾病的危险因素之一。这种效应可能是由道路封锁,小道降低葡萄糖水平(16]。功能通过抵消跟踪效果,还可以促进身体体重增加和血脂异常(20.),以及动脉粥样硬化斑块发展(18,20.]。其次,多项研究表明,功能有促炎和profibrotic对血管的影响。与这些行动一致,我们小组已经表明,功能增加白细胞粘附内皮细胞(14),这增加了TGF-beta-mediated纤维发生和血管平滑肌细胞增殖27),它在糖尿病ApoE增加动脉粥样硬化的扩展−−/老鼠(15]。
相比之下,血脂异常孤独并不影响功能/小道比率的脉管系统。这个数据是一致的几个体外研究表明,氧化低密度脂蛋白功能没有改变表达在人类冠状动脉平滑肌细胞(28)和淋巴细胞(29日]。然而,在我们的研究中,我们发现血脂异常显著增加功能/比率在心脏,而糖尿病没有额外的影响。
它已经表明,血脂异常是独立与左心室(LV)肥大5,30.,31日]。这证实了实验研究载脂蛋白e−−/老鼠,血脂异常与LV质量没有增加血流动力学压力(32]。与先前的报道一致,我们发现血脂异常与心肌细胞肥大有关。这些数据表明,高脂血症可能是心脏重构的早期启动程序。已经证明,三酰甘油过载和可用性的增加其他脂质中间体,如天然保湿因子、甘油二酯,和氧化磷脂,都可以激活炎症和氧化应激反应,导致细胞凋亡,心肌瘢痕(33,34]。
可能增加心脏功能/小道比率与血脂异常相关代表lipid-induced心脏重塑的介质之一。至于功能,最近的一项研究表明,功能交付诱导LV肥大,同时,在体外,心肌细胞转染与AAV-OPG急剧增加hypertrophy-related蛋白质的表达,如ANP、αmhc,肌钙蛋白(35]。心脏成纤维细胞,功能过度导致fibrosis-related蛋白显著增加(35]。相比之下,我们发现跟踪管理与糖尿病心肌病小鼠心血管效应,降低心脏纤维化,细胞凋亡,这通常导致心脏重构(36]。
总之,我们发现血脂异常和糖尿病影响心血管系统的功能/小道比率。这可能导致的循环功能变化/跟踪观察患者的糖尿病和心血管疾病。最重要的是,这些变化可以调解/促进动脉粥样硬化发展和心脏重塑。
相互竞争的利益
作者宣称没有利益冲突。