文摘

ephrinB2-EphB4信号通路的重要作用在骨重塑。然而,目前尚不清楚这是否双向信号对骨的再生过程的缺陷也影响炎症微环境中创建。在这项研究中,实验动物模型骨缺陷处理慢病毒制备和炎症微环境。骨标记基因的表达水平在新形成的骨组织监控使用定量逆转录酶聚合酶链反应和免疫印迹。(包含IHC)免疫组织化学染色和histomorphometric分析也执行评估骨愈合过程。与pLenti6.3-ctrl组相比,pLenti6.3-ephb4siRNA组表现出更低的骨形成标记基因的表达水平和更高水平的NFATc1新的骨组织。此外,新形成的骨薄和巨大的破骨细胞的数量是pLenti6.3-ephb4siRNA组高于pLenti6.3-ctrl组。相比之下,没有显著区别pLenti6.3-efnb2siRNA组和pLenti6.3-ctrl组。总之,EphB4在炎症中扮演不可替代的作用在骨再生微环境,而功能丧失ephrinB2可以有效地补偿,最可能通过其他ephrins相似的化学结构。

1。介绍

不断发生在现有骨表面,骨重塑从旧的破骨细胞骨吸收,其次是新骨再生吸收缺损的成骨细胞(1]。必须保持一定的骨吸收和骨形成之间的平衡来维持骨骼的结构完整性和机械功能的一生中,特别是在骨修复受伤后(2,3]。为此,一个复杂而微妙的成骨细胞和破骨细胞之间的沟通应该建立4]。这种紧密耦合的沟通是前提保证微观骨骼损伤修复和老年人骨骼替换保持功能骨骼系统(5]。

骨重建过程中,巨噬细胞集落刺激因子(csf)和核因子kappa-B配体受体激活剂(RANKL)由成骨细胞刺激破骨细胞前体受体,激活下游分子途径,促进破骨细胞的分化6]。另一方面,tartrate-resistant酸性磷酸酶(陷阱)发布的破骨细胞刺激骨形成报道(7]。2006年,赵和他的同事报道,Eph-ephrin双向信号调节破骨细胞和成骨细胞种群之间的相互作用(8]。弗是一个大家庭的酪氨酸激酶受体可分为EphAs和EphBs基于基因序列和亲和力ephrin配体(9]。作为contact-dependent排斥的分子在产前和产后生物体,弗边界形成中扮演不同的角色,轴突引导,血管生成,骨形成和骨内稳态10,11]。暂时维持体内平衡的骨重塑,破骨细胞表达ephrinB2,跨膜配体,而成骨细胞表达EphB4受体。相反的信号通过ephrinB2破骨细胞前体抑制破骨细胞分化和增强信号通过EphB4成成骨细胞成骨分化。此外,体内超表达成骨细胞增加骨量的EphB4增强骨形成和骨吸收减少小鼠模型(8]。此外,据报道,EphB4是重要的在人类骨的成骨分化和迁移骨髓来源间充质干细胞(hBM-MSCs) [12],ephrinB2-EphB4信号成功地促进成骨细胞的体外矿化(13]。

正如上面所讨论的,ephrinB2-EphB4双向信号系统显示了重要的监管影响骨形成和骨重建在生理条件下,这是一个潜在的新疗法的发展目标提高骨再生。然而,绝大部分参观牙科诊所的病人患有局部慢性炎症如牙周炎、peri-implantitis,根尖周的牙周炎,目前尚不清楚是否EphB4受体和ephrinB2配体施加类似的效果检测不到发炎在炎症和骨缺损再生迹象微环境。在这项研究中,体内的表达ephrinB2或EphB4下颌骨缺损炎症小鼠模型中创建使用siRNAs撞倒了专门针对ephrinB2或EphB4,分别。骨形成和骨吸收的缺陷进行评估充分阐明ephrinB2-EphB4双向信号在炎症微环境的作用。

2。材料和方法

2.1。合成的小干扰rna (siRNAs)专门针对EphrinB2或EphB4

siRNAs专门针对ephrinB2或设计并合成EphB4 ThermoFisher科学,Inc .(上海,中国)。负控制核没有任何已知的鼠标或人类基因同源性也合成作为消极的控制。合成siRNAs和结扎双工入pcDNA6.2-GW / EmGFP-miR使用阻止波尔II米尔RNAi表达载体工具与EmGFP (ThermoFisher科学、中国上海)。根据公布的信使rna序列,鼠标Efnb2(基因访问人数:NM_010111.5)和Ephb4(基因访问人数:NM_001159571.1)基因合成使用DNA合成技术和重叠的PCR ThermoFisher科学,Inc .(上海,中国)。然后,基因测序和subcloned pcDNA3.1 (+) (ThermoFisher科学、中国上海)限制网站HindIII和BamHI之间。

验证siRNA-mediated击倒ephrinB2或EphB4 mRNA, pcDNA6.2-GW / EmGFP-miR包含核质粒插入是cotransfected连同pcDNA3.1 (+) -ephrinB2或pcDNA3.1 (+) -EphB4 hek - 293人类胚胎肾细胞(美式文化集合(写明ATCC),马纳萨斯,弗吉尼亚州)使用Lipofectamine 2000试剂(ThermoFisher科学、中国上海)根据制造商的指示。hek - 293细胞选择验证siRNA-mediated击倒目标mrna的转染效率高。转染后48小时,细胞使胰蛋白酶化和总RNA分离使用试剂盒试剂(ThermoFisher科学、中国上海)。的第一链cDNA生成使用上标三世逆转录酶(ThermoFisher科学、中国上海)。定量实时一(存在)试验是由ThermoFisher科学,Inc .(上海,中国)检测鼠标ephrinB2或EphB4的mRNA水平。PCR产物的相对差异量比较循环阈值(CT)进行评估的方法,与Glyceraldehyde-3-Phosphate脱氢酶(GAPDH)作为控制。核验证实验中使用的引物序列的5′-ATCAGCCAGGAATCACGGTC-3′, 5′-TGTGGAGAGTGTTTGCGGTGTC-3′ephrinB2;5′-AGCCTCACTATTCTGCTTTCGG-3′, 5′-GATTTTCTTCTGGTGTCCTGCC-3′EphB4;和5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′, 5′-CGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3 GAPDH′。

2.2。准备表达siRNAs针对鼠标EphrinB2或EphB4慢病毒颗粒

核验证后,选择siRNAs专门针对鼠标ephrinB2或EphB4引入pDONR221向量通过体外重组BP-clonase II酶混合(ThermoFisher科学、中国上海)。结果BP-recombination质粒被转入慢病毒表达载体pLenti6.3 / V5-DEST通过体外重组LR-clonase II酶混合(ThermoFisher科学、中国上海)。由此产生的慢病毒载体被命名为pLenti6.3-efnb2siRNA pLenti6.3-ephb4siRNA,分别。慢病毒载体编码上述消极控制核,pLenti6.3-ctrl,也创造了作为消极的控制。

pLenti6.3-efnb2siRNA pLenti6.3-ephb4siRNA,或pLenti6.3-ctrl慢病毒载体转染293 t细胞与人类ViraPower包装混合使用Lipofectamine 2000 (ThermoFisher科学、中国上海)。转染后48小时,上层的收集,在3000转离心10分钟去除细胞碎片,并与0.45过滤µm过滤器。慢病毒粒子被离心50000然后集中2小时,在opti-MEM resuspended,进行滴定。滴定后,慢病毒粒子被稀释1×10的浓度⁸电转换单位每毫升(图/毫升)和存储在−80°C。

2.3。建立一个体内炎性微环境通过腹腔内注射TNF -α到老鼠

24 6-8-week-old雄性C57BL / 6小鼠随机分为4组TNF -接受腹腔内注射α剂量的0µ0.5克/公斤µ克/公斤,3µ克/公斤,或5µ克/公斤。每隔一天进行注射。3、7、10、14天第一次注射后,内眦静脉血样采集的动物(图1(一)),血清TNF -的浓度α决心用鼠标tnf铂酶联免疫试剂盒(美国eBioscience,圣地亚哥,CA)根据协议由制造商提供。

本研究中使用的所有动物维护和使用按照准则建立的山东大学动物保健和使用委员会制度在济南,山东,中国。

2.4。动物手术

被麻醉后通过腹腔注射氯胺酮的混合物(80毫克/公斤)和甲苯噻嗪(10毫克/公斤),牙槽骨上覆的中央的根低第一mol / l的雄性C57BL / 6小鼠暴露出来。骨缺陷,直径1.5毫米,然后创建在这个区域(14)使用一个牙科钻下连续灌溉与磷酸盐(PBS)(图1 (b))。随机分成三组,骨缺损治疗与pLenti6.3-efnb2siRNA pLenti6.3-ephb4siRNA,或pLenti6.3-ctrl慢病毒粒子,分别和每个骨缺陷被注射5μL使用微量调节注射器的慢病毒颗粒(Asone、日本)。组织与4 - 0肠道缝合随后关闭。从手术的日子,所有的动物都收到腹腔内注射TNF -α剂量的5µ克/公斤,注入每隔一天进行。在7天、14和21个手术后,老鼠牺牲和下颚孤立进行进一步分析。

2.5。实时rt - pcr分析

上覆软组织切除很仔细,骨骼组织缺陷区接壤(约1.5×1.5毫米)从下颌骨解剖,snap-frozen液氮。从骨骼组织总RNA提取试剂盒试剂(美国ThermoFisher科学,卡尔斯巴德,CA)和使用PrimerScript RT reverse-transcribed试剂盒gDNA橡皮擦(豆类,Shijodori日本京都)。使用光周期计实时PCR进行快速启动DNA主人SYBR绿色我(罗氏应用科学,潘茨堡,德国)。鼠标Runx2的序列的引物扩增,OC, Osx, BSP,高山,NFATc1, ephrinB2, EphB4, GAPDH是列在表中1。信使rna表达规范化的GAPDH管家基因方法。每个实验评估三个PCR反应和每个实验重复三次。

2.6。免疫印迹分析

总蛋白质分离和确定使用BCA蛋白质分析工具包(Beyotime,北京)。免疫印迹分析然后使用NuPAGE执行4 - 12% Bis-Tris梯度凝胶和0.45µm Invitrolon聚偏二氟乙烯膜(ThermoFisher科学、卡尔斯巴德、钙、美国)。Abcam Runx2抗体(1:1000年,剑桥,MA), BSP(1: 500年,圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA),和β肌动蛋白(1:500年,圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA)。二次抗体是辣根过氧化物酶——(合)与goat-anti-rabbit免疫球蛋白(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA)。能够从皮尔斯使用ECL化学发光试剂的可视化生物技术(美国罗克福德,IL)。图像的印迹分析使用图像4.11 (Dahui生物科技、广州、中国)。

2.7。Histomorphometric分析

下颌骨与4%多聚甲醛固定(PFA, Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州),在10% EDTA脱钙,嵌在石蜡中。组织部分,5µ米厚度,减少冠状方向和编号。组织部分定位在中部地区收集骨缺陷的定量分析和苏木精和伊红染色(他)。图像是用一个奥林巴斯显微镜(日本奥林巴斯)和普洛古莱CapturePro软件(德国耶拿光学系统,德国)。新形成的骨区域表示为一个百分比(新形成的骨/地区原始伤口)和测量Image-Pro + 6.0软件(美国马里兰州银泉的媒体控制论)使用双盲方法,防止观察者偏见。

2.8。免疫组织化学染色(包含IHC染色)

主要抗体Runx2(1: 1000)和OC(1: 500)从Abcam购买(美国Cambridge, MA)。控制部分与正常兔血清没有孵化的主要抗体。与自来水冲洗5分钟后,部分与苏木精复染色30秒。图片与奥林巴斯显微镜拍摄(奥林巴斯、日本)和集成光学密度(IOD) Runx2和OC的所有三组测量使用Image-Pro + 6.0软件(美国马里兰州银泉的媒体控制论)。对于每一个样本,选择三个不同的部分在中央的部分骨缺损IOD测量。对于每个部分,IOD测量4个随机领域与同一地区(40 x放大)在骨缺损区域。

2.9。Tartrate-Resistant酸性磷酸酶(TRACP)染色

TRACP使用酸性磷酸酶染色了,白细胞(陷阱)装备从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州)。短暂,幻灯片孵化在37°C 30分钟是双磷酸盐(0.4毫克/毫升)acetate-tartrate缓冲区(200毫米醋酸钠,酒石酸钾钠100毫米,pH值5.2)。幻灯片被转移到亚硝酸钠溶液(1:1 v / v) prewarmed tartrate-acetate缓冲区和孵化30到60分钟37°C到破骨细胞是明亮的红色。部分被复染色与甲基绿(Sigma-Aldrich、圣路易斯、钼)。彩色部分观察使用一个奥林巴斯显微镜(日本奥林巴斯)和TRACP-positive细胞三个或更多核数。

2.10。统计分析

使用SPSS 19.0统计软件进行统计分析(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。所有数据都表示为平均值±标准平均误差(SEM)。统计学意义被Independent-Samples测试以及。一个p值低于0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。慢病毒粒子编码siRNAs针对鼠标EphrinB2或EphB4被成功制备和滴定

四个siRNAs,专门针对鼠标ephrinB2和EphB4基因,设计、合成,和结扎pcDNA6.2-GW / EmGFP-miR向量。评估的效率siRNAs在表达下调目标基因的表达水平,pcDNA6.2-GW / EmGFP-miR包含核质粒插入是cotransfected连同pcDNA3.1 (+) -ephrinB2或pcDNA3.1 (+) -EphB4成hek - 293细胞。在四个siRNAs针对ephrinB2, siRNA # 1演示了抑制效率最高,成功地表达下调的mRNA水平ephrinB2 87%(图2(一个))。同样,在siRNAs针对EphB4, siRNA # 2显示抑制效率最高,EphB4的mRNA水平(图表达下调77%2 (b))。因此,核小干扰rna # 2 # 1针对ephrinB2和针对EphB4选择慢病毒的制备实验,用于下面的体内研究。

在一系列的体外重组化验,选择siRNAs被成功转移到慢病毒表达载体pLenti6.3 / V5-DEST和被命名为pLenti6.3-efnb2siRNA pLenti6.3-ephb4siRNA,分别。pLenti6.3-efnb2siRNA pLenti6.3-ephb4siRNA,然后消极控制pLenti6.3-ctrl pLP1准型,pLP2,分别和pLP / VSVG包膜糖蛋白。过滤后,离心,滴定,慢病毒粒子被稀释1×10⁸电转换单位每毫升(图/毫升)opti-MEM和储存在−80°C为进一步使用。

3.2。成立于小鼠体内炎性微环境通过腹腔内注射TNF -α剂量的5µ克/公斤

注射后TNF -α腹腔内,血液样本收集的C57BL / 6小鼠,测定血清TNF -α的水平。我们发现动物接受注射TNF -α剂量的0.5µ克/公斤只显示血清TNF -略有增加α的水平。在老鼠身上注射的TNF -α剂量的3µ克/公斤,血清TNF -α水平不断提高,3天,7天,10天之后第一次注射。然而在第一次注射后14天,增加血清TNF -α水平并不突出。相比之下,在TNF -动物接受注射α剂量的5µ克/公斤,血清TNF -α水平大幅增加从第一次注射后3天,之后达到一个稳定的高原州(图3)。因此腹腔内注射TNF -α剂量的5µ克/公斤被用来建立一个炎症微环境在接下来的体内实验。

3.3。不安的表情EphB4,但不是EphrinB2显著下调骨基因的表达水平和调节表达水平NFATc1炎症微环境中创建的老鼠

下颌骨缺损了雄性C57BL / 6小鼠接受腹腔内注射TNF -α剂量的5µ克/公斤每隔一天。骨缺损治疗与pLenti6.3-efnb2siRNA pLenti6.3-ephb4siRNA,分别或pLenti6.3-ctrl慢病毒颗粒。老鼠牺牲在7、14和21天手术后,新形成的骨是孤立的。我们发现ephrinB2 mRNA水平新形成的骨组织pLenti6.3-efnb2siRNA组显著下降,而EphB4 mRNA水平显著下调pLenti6.3-ephb4siRNA治疗的慢病毒粒子,与相应的基因的mRNA水平相比pLenti6.3-ctrl组(数字4(一)和4 (b))。相比之下,siRNAs专门针对ephrinB2 EphB4没有目标,反之亦然,基于核苷酸序列。此外,没有统计上的显著差异中发现EphB4 pLenti6.3-efnb2siRNA组和pLenti6.3-ctrl组之间的表达水平和ephrinB2 pLenti6.3-ephb4siRNA之间表达水平组和pLenti6.3-ctrl集团(数据未显示)。

为了调查ephrinB2-EphB4双向信号通路的影响骨形成和骨吸收体内炎症微环境,骨基因的表达水平,如Runx2 Osx,高山,OC、BSP,以及osteoclastogenic转录因子NFATc1,也被监控的孤立的新形成的骨组织。我们发现这些上述骨基因的mRNA水平pLenti6.3-ephb4siRNA组明显低于pLenti6.3-ctrl组。相比之下,在表达水平无显著差异之间的骨基因检测pLenti6.3-efnb2siRNA组和pLenti6.3-ctrl集团(数字4 (c)- - - - - -4 (g))。此外,NFATc1 mRNA水平显著增加pLenti6.3-ephb4siRNA组相比,那些pLenti6.3-ctrl小组7和手术后14天。然而,没有发现显著差异在NFATc1 mRNA水平之间pLenti6.3-efnb2siRNA组和pLenti6.3-ctrl组(图4 (h))。

我们还进行了免疫印迹分析确定Runx2的蛋白质含量和BSP新形成的骨组织。如数据所示5(一个)和5 (b)、Runx2的蛋白质含量显著降低pLenti6.3-ephb4siRNA组相比,那些pLenti6.3-ctrl小组7和手术后14天。同样,BSP的蛋白质水平是降低pLenti6.3-ephb4siRNA组相比,pLenti6.3-ctrl组在术后14天(数字5 (c)和5 (d))。有趣的是,没有统计上的显著差异Runx2的蛋白质含量和BSP检测pLenti6.3-efnb2siRNA集团和pLenti6.3-ctrl集团之间的数字5(一个)- - - - - -5 (d))。

3.4。不安的表情EphB4,但不是EphrinB2显著延迟骨再生炎症微环境中创建的老鼠

新的骨组织可以观察到所有的三组在手术后7天。此外,新形成的骨区域中没有统计上的显著差异是这些组织中检测到。在手术后14天,新形成的骨区域pLenti6.3-ephb4siRNA组显著低于pLenti6.3-ctrl组。相比之下,新形成的骨面积是一样的在pLenti6.3-efnb2siRNA组相比,pLenti6.3-ctrl组。在手术后21天,骨头几乎完全修复缺陷的新再生骨组织在所有团体,这些团体之间,发现无显著差异(图6)。

免疫组织化学染色也执行评估Runx2和OC的体内表达的蛋白质。在所有时间点,我们观察到强Runx2和OC信号pLenti6.3-ctrl组和pLenti6.3-efnb2siRNA组比pLenti6.3-ephb4siRNA集团(数字7(一)- - - - - -7(我)和8(一个)- - - - - -8(我))。定量分析进一步证实,IOD值pLenti6.3-ephb4siRNA组明显低于pLenti6.3-ctrl组。但是,没有统计上的显著差异之间的IOD值检测pLenti6.3-efnb2siRNA组和pLenti6.3-ctrl集团(数字7 (j)和8 (j))。

3.5。不安的EphB4的表达,但不是EphrinB2,显著提升Osteoclastogenesis炎症微环境中创建的老鼠

调查是否缺少EphB4 ephrinB2影响骨吸收炎症微环境的骨再生过程中,执行TRACP染色和TRACP-positive细胞三个或更多核被认为是成熟的破骨细胞(数字9(一个)- - - - - -9(我))。定量分析显示数量显著增加的TRACP +破骨细胞在骨缺损区域pLenti6.3-ephb4siRNA组相比pLenti6.3-ctrl组(图9 (j))。然而,无显著差异TRACP +多核破骨细胞的数量之间发现pLenti6.3-efnb2siRNA组和pLenti6.3-ctrl组(图9 (j))。

4所示。讨论

完全阐明,信息交互由ephrinB2破骨细胞和成骨细胞产生双向antiosteoclastogenic EphB4和proosteoblastogenic信号可能从骨吸收与骨形成促进过渡检测不到发炎的迹象微环境。这使它非常希望找出ephrinB2-EphB4信号的最终作用在成骨分化,骨形成,和组织再生,尤其是在骨科疾病的情况持续的炎症。在这项研究中我们发现EphB4受体,但不是ephrinB2配体,扮演更重要的角色在促进骨修复炎性微环境。

以前在我们的体外研究中,我们发现,治疗与肿瘤坏死因子-α在低浓度主要激活MAPK家庭成员在成骨细胞,最终促进成骨分化,增强成骨的转录因子的表达水平和骨标记基因。相比之下,TNF -的浓度更高α导致NF -的激活κB信号通路,抑制成骨分化。此外,长期治疗与肿瘤坏死因子-α显示剂量依赖性抑制成骨分化[15]。因此,在这项研究中,我们第一次注射TNF -α腹腔内成雄性C57BL / 6小鼠不同剂量找到一个适当的TNF -α建立一个治疗体内炎性微环境。我们的研究结果显示,血清TNF -α老鼠接受注射TNF -水平α剂量的5µ克/公斤显示快速增加,达到一个稳定的高原州早在第一次注射后7天。因此,腹腔内注射TNF -α剂量的5µ克/公斤选出以下实验。

先前的研究已经表明,抑制EphB4信号能够减少一些成骨相关基因表达水平的成骨细胞分化[末16]。此外,减少EphB4水平减少人类msc的体外成矿能力(12)和鼠标骨细胞(17),被证明是抑制的结果骨基质与成矿相关的基因的表达水平。此外,老鼠overexpressing EphB4显示增加骨形成参数,显著降低监测活动,显著增加成骨细胞的活动(8]。这些数据有力地证明了EphB4信号中扮演一个重要的角色在促进成骨分化和骨形成检测不到发炎的迹象的生理条件。然而在牙科诊所,骨再生过程通常发生在炎症微环境,这是常见的病人患有牙周疾病。因此具有重要的临床意义,进一步探讨EphB4信号在炎症微环境的作用。在这项研究中,我们发现,在一个体内炎症微环境的表达水平下降EphB4基因表达下调表达骨大师Runx2 Osx,以及其他骨基因和高山,OC、BSP。同时,NFATc1 osteoclastogenic标记基因的表达水平明显增加。TRACP染色进一步证实TRACP +多核破骨细胞的数量明显增加了治疗siRNAs专门针对EphB4炎性微环境。此外,histomorphometric分析显示,小鼠的骨再生明显推迟接受腹腔内肿瘤坏死因子-α注射和慢病毒粒子编码siRNAs专门针对EphB4。连同之前的其他研究小组的调查结果,我们的结果强烈支持,EphB4不仅检测不到发炎的迹象微环境中扮演一个重要的角色,也积极参与骨再生过程中炎症微环境。

双向antiosteoclastogenic和proosteoblastogenic信号由ephrinB2破骨细胞和EphB4成骨细胞被认为是一个紧密耦合的过程检测不到发炎的迹象微环境(8]。例如,ephrinB2过度增强人类间充质干细胞成骨分化,促进矿化在polyethyleneimine-ephrinB2 gene-activated矩阵(18]。此外,抑制ephrinB2信号抑制矿化,会使一些骨基因的表达水平在成骨细胞(16,19),人类msc (12),和鼠标骨细胞(17]。然而,在我们的研究中,我们发现,不安的表情ephrinB2 siRNA治疗没有效果在骨再生的体内炎性微环境。虽然差异的确切分子机制仍需要进一步的调查,我们的数据表明,炎症微环境可能会唤起一些补偿信号通路来取代表达下调ephrinB2配体。例如,先前的报道表明,ephrinB1可以维持EphB4信号通路的功能没有ephrinB2 [8]。

总之,下调表达的EphB4 siRNAs显著抑制成骨的活动,增强osteoclastogenic分化和延迟骨再生的体内炎性微环境由腹腔内肿瘤坏死因子-α注射。然而,选择抑制siRNAs ephrinB2显示没有明显影响骨重塑和骨再生的体内炎症微环境,这表明炎症微环境可能唤起一些补偿信号通路ephrinB2配体的取代缺失的功能。炎症微环境的体内效应ephrinB2 / EphB4信号通路需要进一步调查。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

莉莉沈和Li-Xia张是平等的贡献者。

确认

这项工作得到了国家自然科学基金(批准号81271141)的建筑工程专项资金“泰山学者”。