文摘

CD4⁺T细胞起着重要的作用在调节silica-induced炎症和纤维化。最近的研究表明,Wnt /β连环蛋白途径可以调节功能和CD4细胞的分化⁺T细胞。因此,Wnt /β连环蛋白途径可能参与矽肺病的发展和进步。调查Wnt /的角色β连环蛋白通路,我们使用慢病毒表达β块Wnt /连环蛋白成分β连环蛋白通路通过气管内的滴剂矽肺病的小鼠模型。慢病毒的治疗可以显著加剧silica-induced肺部炎症和纤维化的减毒后期。通过分析CD4⁺T细胞,我们发现Wnt /的封锁β连环蛋白通路抑制调节性T细胞亚群)。相反地,增强Th17反应是负责进一步积累的中性粒细胞和促炎细胞因子的生产。此外,Wnt /的封锁β连环蛋白通路延迟Th1 / Th2极化通过抑制亚群和Th2反应。这些结果表明,Wnt /β连环蛋白途径可以调节treg调节Th免疫反应,最终改变硅肺病的病理特征。我们的研究表明,Wnt /β连环蛋白通路可能是一个潜在的目标治疗silica-induced炎症和纤维化。

1。介绍

矽肺病是一种破坏性的尘肺病由吸入二氧化硅矿物粉尘引起的。最基本的病理变化是弥漫性肺纤维化和silicotic结节1,2]。吸入二氧化硅粒子首先承认的清道夫受体肺泡巨噬细胞,从而激活肺泡巨噬细胞分泌细胞因子和趋化因子诱导大量炎症细胞包括巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞(3,4]。先天免疫的激活,矽肺代表急性炎症反应的早期阶段,它的特征是炎症细胞浸润,肺泡壁的破坏。伴随着组织修复的出现,硅肺病发展到弥漫性间质纤维化或最终形式silicotic结节以及细胞外基质的沉积2]。适应性免疫也参与矽肺病的发展。与此同时,CD4⁺T细胞被认为是作为一个关键参与者(5]。天真的CD4⁺T细胞开始分化成辅助T细胞激活的细胞信号和并发costimulatory分子之间的相互作用和特定的细胞因子,如Th1、Th2, Th17,亚6- - - - - -8]。这些区别Th子集针对硅开发复杂的监管网络。矽肺的进展与Th1 / Th2平衡的失调。Th1细胞典型的分泌干扰素-γ从事silica-induced炎症(9]。而Th2细胞引起纤维发生的反应通过分泌细胞因子il - 4和IL-13等,来调解,成纤维细胞分化成myofibroblasts [10]。亚群可以调节这种平衡Th2主导反应通过抑制Th1反应直接或间接的方式(11]。基于亚群在矽肺的监管作用,亚拥有profibrotic活动表示。Th17细胞CD4的是最近发现的子集⁺T细胞产生IL-17和自身免疫性疾病的主要是公认的一个重要的诱导物(7,12]。后续的研究也揭示了silica-induced Th17细胞肺部炎症和纤维化的作用(13- - - - - -17]。Th17细胞的分化取决于TGF -的联合行动β和il - 6。然而,IL-23是必不可少的促进增殖而不是代Th17细胞(18]。TGF -β就可以促进亚群的分化诱导Foxp3 [19,20.]。然而,TGF -β+ il - 6可以抑制亚群和诱导Th17细胞的分化,因此可能存在亚群和Th17细胞之间的相互关联,和il - 6可能是这种平衡的调节器18,21]。

规范Wnt /β连环蛋白是一种进化保守控制胚胎发育的信号通路和细胞命运的决定22,23]。的数量β连环蛋白决定了激活规范Wnt /β连环蛋白通路。β连环蛋白被破坏退化的复杂组成的轴抑制蛋白质、腺瘤息肉病杆菌、酪蛋白激酶1,糖原合成酶激酶3β。在Wnt配体的存在,卷曲的跨膜蛋白及其coreceptor LRP5/6被激活来扰乱破坏复杂;因此β连环蛋白蛋白质积累然后把成核生成目标基因转录(24]。在免疫系统中,Wnt /的角色β连环蛋白通路在胸腺T细胞发展已经被完全研究[25]。然而,外周T淋巴细胞分化和Wnt /之间的联系β连环蛋白通路仍需要作进一步的探讨。它已经证明了这一点β连环蛋白结合TCF-1激活GATA3转录启动Th2细胞分化[26,27]。CD4⁺CD25⁺亚群表达稳定β连环蛋白更有效地抑制炎症由于优越的生存能力(28]。相反,另一项研究表明,激活Wnt /β连环蛋白途径与具体的功能,从而降低亚群的抑制能力(29日]。有研究还划定,抑制Wnt /β连环蛋白通路推广Th17细胞分化[30.,31日]。这些表明,Wnt /β在CD4连环蛋白通路可能发挥重要作用⁺T细胞介导的炎症或纤维化。

我们先前的研究表明,激活Wnt /β连环蛋白通路参与了实验性矽肺的发展(32]。所以我们建议Wnt /β连环蛋白途径可能参与调节silica-induced炎症和纤维化。在目前的研究中,我们使用一个慢病毒表达β连环蛋白成分减少目标mRNA,不断封锁Wnt /β连环蛋白通路的肺。我们发现的封锁Wnt /β连环蛋白通路抑制亚群和高架Th17响应。与此同时,silica-induced炎症明显加剧。阻塞Wnt /β连环蛋白通路也介导的延迟Th1 / Th2极化抑制亚群。这种效应阻碍肺部炎症和克制的决议Th2-mediated纤维化。

2。材料和方法

2.1。动物

女性C57BL / 6小鼠从线性购买实验动物有限公司有限公司(上海,中国),在6 - 8周的年龄。所有老鼠都保持在特定的无菌条件下,一个标准的鼠标chow的环境温度°C和12 h / 12 h光/暗周期与水可随意。动物研究是批准的中国医科大学动物保健和使用委员会(CMU62043018),这符合美国国立卫生研究院的指导实验室动物保健和使用的。

2.2。试剂

慢病毒的建设被描述在我们之前的研究32]。自然结晶二氧化硅粒子(Min-U-Sil 5地面二氧化硅;粒度分布:< 5 97%μ< 3米直径,80%μ米直径;中值直径1.4μ米)从美国获得硅公司(马里兰州弗雷德里克)。二氧化硅粒子被煮1 N HCl消除类毒素。在曝光之前,悬浮液热压处理过的,然后用10分钟。

2.3。硅接触和实验设计

所有的老鼠被随机分为四组,如下:(1)直接oral-tracheal滴剂0.1毫升无菌生理盐水(生理盐水组);(2)由直接暴露于二氧化硅oral-tracheal滴剂1毫克的石英晶体悬浮在总量为0.1毫升无菌生理盐水(石英组);(3)直接oral-tracheal滴剂1毫克的石英晶体和3×10⁷电转换单位(你)β连环蛋白成分悬浮在总量为0.1毫升无菌生理盐水(石英+β连环蛋白成分群);(4)直接oral-tracheal滴剂1毫克的石英晶体和3×10⁷电转换单位(TU)数控shRNA悬浮在总量为0.1毫升无菌生理盐水(石英+ NC shRNA集团)。暴露小鼠石英晶体的方法(Min-U-Sil 5)之前一直描述(13]。老鼠牺牲在7天、28和56后oral-tracheal滴注法。

2.4。支气管肺泡灌洗和微分细胞计数

老鼠的肺切除,洗后在寒冷的磷酸盐(PBS)牺牲的老鼠。支气管肺泡灌洗液(BALF)获得的筒状的气管,然后注入和检索1毫升整除的无菌生理盐水两次。BALF离心机在1500 rpm在4°C 8分钟。裂解后红细胞(红血球)、BALF细胞颗粒被resuspended PBS。总使用标准的血液细胞计数测定过程。cytospin准备后,BALF使用Wright-Giemsa染色方法。巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞在200年确定细胞使用标准形态的标准。

2.5。隔离肺门淋巴结

肺门淋巴结(HLNs)收获,解剖针,与0.25%胰蛋白酶消化5分钟在37°C。消化反应终止添加3%胎牛血清在PBS,样本在1500 rpm离心机和4°C 8分钟。HLN细胞颗粒清洗和resuspended PBS。

2.6。流式细胞术

细胞HLNs resuspended在PBS和刺激细胞刺激鸡尾酒(包括phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA) ionomycin, brefeldin,和莫能菌素)(2μL /毫升)(eBioscience Inc .)、圣地亚哥、钙、美国)5 h完全rpmi - 1640。细胞培养与anti-mouse CD4 PerCP-Cy5.5克隆:RM4-5 20分钟在黑暗中在4°C。地窖后表面染色,细胞被固定和permeabilized使用标准试剂,根据制造商的协议(eBioscience Inc .)。细胞被染色的anti-mouse IL-17A PE克隆:eBio17B7;一个anti-mouse Foxp3 eFluor®660克隆:FJK-16s;以及一个anti-mouse IFN -γAlexa萤石®488克隆:XMG1.2 (eBioscience Inc .)。细胞随后分析使用FACSCanto二流式细胞分析仪(BD生物科学,富兰克林湖,新泽西)。死细胞和硅粒子被封闭的根据前方散射(FSC)和散射(SSC)。细胞与BD FACSDiva进行了分析™软件v6.1.2 (BD生物科学)。BALF中细胞因子测定采用BD CBA鼠标Th1 / Th2 Th17细胞因子工具包(BD生物科学,圣何塞、钙、美国)。操作根据制造商的说明进行。样本测量在FACSCanto二流式细胞分析仪(BD生物科学,富兰克林湖,新泽西),分析了FCAP数组™软件(BD生物科学,富兰克林湖,新泽西)。单个细胞因子浓度表示的荧光强度。荧光强度是成正比的一个给定的细胞因子在一个瓶,和蛋白质浓度测试的样本估计根据标准曲线后获得的分析标准稀释(33]。

2.7。RNA提取和实时rt - pcr

总RNA提取肺匀浆使用试剂盒试剂(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA),根据制造商的协议。肺总RNA (2μg)样本reverse-transcribed (RT)分别在20 -μL卷使用的37°C程序15分钟和85°C,持续5秒。使用ABI 2720(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)。引物和TaqMan探针序列如下:il - 1β感觉5′-TGACCTGGGCTGTCCTGATG-3′,反义5′-GGTGCTCATGTCCTCATCCTG-3′;IL-17A,感觉5′-GCAAAAGTGAGCTCCAGAAGG-3′,反义5′-TCTTCATTGCGGTGGAGAGTC-3′;il - 6,感觉5′-CAATTCCAGAAACCGCTATGAAG-3′, 5′反义-GTAGGGAAGGCCGTGGTTG-3′;干扰素-γ感觉5′-AAGCGTCATTGAATCACACCTG-3′,反义5′-TGACCTCAAACTTGGCAATACTC-3′;il - 10、5′-GGGGCCAGTACAGCCGGGAA-3′, 5′反义-CTGGCTGAAGGCAGTCCGCA-3′;Foxp3,感觉5′-AAGCCCCGGAGAGGCAGAGG-3′,反义5′-TGCAGGCTCAGGTTGTGGCG-3′;il - 4、5′-AAAATCACTTGAGAGAGATCATCGG-3′;反义5′-GTTGCTGTGAGGACGTTTGG-3′;IL-13,感觉5′-CCCCTGTGCAACGGCAGCAT-3′;反义5′-GAAGGGGCCGTGGCGAAACA-3′;和GAPDH,感觉5′-CAATGTGTCCGTCGTGGATCT-3′, 5′反义-GTCCTCAGTGTAGCCCAAGATG-3′。探针序列如下:il - 1β5′- (FAM) TCGCAGCAGCACATCAACAAGAGC (BHQ1) 3′;IL-17A 5′- (FAM) CCTCAGACTACCTCAACCGTTCCAC (BHQ1) 3′;il - 6、5′- (FAM) CACCAGCATCAGTCCCAAGAAGGCA (BHQ1) 3′;干扰素-γ5′- (FAM) CTTCTTCAGCAACAGCAAGGCGAA (BHQ1) 3′;il - 10、5′- (FAM) GCACCCACTTCCCAGTCGGCCAGAGCC (BHQ1) 3′;Foxp3 5′- (FAM) ACCACCCCGCCACCTGGAAGAATGCCA (BHQ1) 3′;il - 4、5′- (FAM) TGGCGTCCCTTCTCCTGTGACCTCG (BHQ1) 3′;IL-13 5′- (FAM) TGGACCTGGCCGCTGGCGGGT (BHQ1) 3′;和GAPDH 5′- (FAM) CGTGCCGCCTGGAGAAACCTGCC (BHQ1) 3′。T-bet, IL-23, GATA-3 reverse-transcribed cDNA被SYBR发现绿色ABI 7500系统(美国应用生物系统公司,卡尔斯巴德,CA),根据制造商的协议。他们的引物序列如下:T-bet,感觉5′-TCAACCAGCACCAGACAGAGA-3′, 5′反义-TCCACCAAGACCACATCCAC-3′;IL-23,感觉5′-ACATGCACCAGCGGGACATA-3′,反义5′-CTTTGAAGATGTCAGAGTCAAGCAG-3′;GATA-3,感觉5′-GAAACCGGAAGATGTCTAGCAAA-3′,反义5′-TGGAGTGGCTGAAGGGAGA-3′。 Real-time RT-polymerase chain reaction (PCR) was performed with a premix Ex Taq RT-PCR kit (DRR039A; Takara, Dalian, China) or a SYBR Premix Ex Taq II RT-PCR kit (DRR081A; Takara). A total of 2 μ在每个25 - L (cDNA使用μL PCR体积。每个样本重复化验。之间的差异放大效率目标和管家基因被确定通过比较标准曲线的斜坡。实时PCR进行ABI 7500(应用生物系统公司)按照下列程序:(i) TaqMan: 30秒95°C。40 95°C的周期,持续5秒。34秒,62°C。或(2)SYBR绿色:95°C,持续30秒。40 95°C的周期,持续5秒。,60°C 34秒。PCR分析ABI 7500系统软件。

2.8。病理检查

肺组织固定在4%多聚甲醛在PBS。组织是嵌入在石蜡,切成6 -μ米厚的部分,和苏木精和伊红染色())和马森的三色的染色病理评价炎症和纤维化。肺形态学BX51可视化使用奥林巴斯显微镜放大200倍。

2.9。统计数据

使用SPSS 19.0软件进行统计分析。值之间的差异进行评估通过单向方差分析(方差分析)与Student-Newman-Keuls其次是成对比较测试。被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。封锁Wnt /β连环蛋白通路加剧Silica-Induced肺部炎症

气管内的二氧化硅粒子的滴剂,可能诱发急性牙槽炎为特征的炎症细胞的浸润,肺泡壁结构破坏。调查Wnt /的角色β连环蛋白在silica-induced炎症通路,我们观察到的部分肺组织染色)。生理盐水对照组显示正常的肺泡结构和没有炎症细胞的浸润时间点(数据1(a1),1(b1),1(c1))。相比之下,石英组和石英+ NC shRNA组开发严重肺小泡炎在第七天由于硅的治疗。急性炎症被破坏的内在肺泡结构和积累大量的炎症细胞在肺泡间隔(数字1(a2)和1(a4))。在28天,炎症减毒与第七天(数字1(b2)和1(b4))。基本上在56天,炎症消失和肺泡壁增厚的组织修复过程(数据1(c2)和1(c4))。然而,硅+β连环蛋白成分组硅相比表现出显著加剧炎症组和石英+ NC shRNA小组第七天(图1(a3))。在28天,分泌和渗透是缓解与第七天相比,而炎症显然又比其他两组(图1(b3))。在56天,石英+的病理特征β连环蛋白成分群仍炎症(图1(c3))。因此,他走时染色的结果显示,封锁的Wnt /β在早期阶段连环蛋白通路silica-induced炎症加剧。此外,炎症持续时间与石英组和石英+ NC shRNA组。最后,矽肺的发展被阻塞Wnt /延迟β连环蛋白通路。

3.2。封锁Wnt /β连环蛋白通路增加炎症细胞的积累和促炎细胞因子的生产

针对硅,肺泡巨噬细胞释放丰富的细胞因子和趋化因子。随后,更多的炎症细胞招募和放大炎症4]。我们一共分析了浸润的炎症细胞计数细胞,淋巴细胞,巨噬细胞和中性粒细胞在BALF中。在三个时间点,总细胞的数量在silica-treated组与生理盐水组相比明显增强。在第七天,积累更多的炎症细胞在石英+β连环蛋白成分比其他组(图组2(一个))。微分细胞计数显示中性粒细胞的数量增加明显在石英+ 7天、28天的评分β连环蛋白成分集团与硅和硅+ NC shRNA组(图2 (c))。更多的积累在石英+淋巴细胞也β连环蛋白成分组比其他组在第七天(图2 (b)),而巨噬细胞的数量没有显示出区别三个silica-treated组各时间点(图2 (d))。在silica-induced炎症的早期阶段,il - 1β肿瘤坏死因子-α,il - 6产生重要的促炎的功能。我们的研究结果表明,il - 1的表达β信使rna在肺癌和TNF -的浓度α和BALF中il - 6的分泌细胞因子明显增加硅+β连环蛋白成分小组第七天与石英组和石英+ NC shRNA组。之后,这些细胞因子显著下降到一个低水平silica-treated组28天56(数字3(一个)- - - - - -3 (c))。最重要的是,我们的研究显示,Wnt /的封锁β连环蛋白通路silica-induced加剧炎症通过增加炎症细胞的积累和促炎细胞因子的生产。

3.3。Th17响应被阻塞Wnt /增强β连环蛋白通路

已经证实CD4⁺在硅肺病T细胞发挥了重要的作用。然而,最近的研究发现Wnt /β连环蛋白通路参与了CD4的发展⁺T细胞(27,28]。探索的潜在机制,封锁Wnt /β连环蛋白通路silica-induced炎症加剧,我们调查通过分析不同子集的Th细胞反应。Th17细胞功能诱导炎症和自身免疫性疾病通过生产IL-17A [34]。二氧化硅粒子的滴剂,显然Th17细胞的分化和激活的分泌IL-17A矽肺病的早期阶段。在这项研究中,我们评估了Th17流式细胞术和实时rt - pcr反应。CD4细胞的百分比⁺IL-17A⁺在石英+ T细胞在HLN更高β连环蛋白成分在第七天(图组4(一))。相比与硅和硅+ NC shRNA集团IL-17A表达式,IL-21和RORγt mRNA在石英+显著增加β连环蛋白成分在第七天(图组4 (b)和图S1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/6235614)。然后,我们分析了细胞因子对Th17细胞的发展是至关重要的。il - 6水平的mRNA在石英+肺部组织显著增加β连环蛋白成分在7天、28天的评分(图组4 (c))。但IL-23 mRNA显示在三个时间点(图没有区别4 (d))。这些结果表明,Wnt /的封锁β连环蛋白通路可以加强Th17应答。

3.4。Th1反应被阻塞Wnt /增强β连环蛋白通路

Th1细胞和Th1-related细胞因子增加矽肺病的早期阶段。这个建议Th1反应的一个重要的角色在管理矽肺病的炎症9]。我们检测的信使rna干扰素-γ通过实时rt - pcr。在第七天,干扰素的表达γ信使rna在石英+高β连环蛋白成分集团与硅和硅+ NC shRNA组。其次是矽肺病的进步,干扰素-γ信使rna silica-treated下降到同等水平组在28天,56(图5(一个))。T-bet Th1-specific转录因子。激活T-bet发起的分化和促进干扰素的分泌,Th1子集γ(35]。T-bet mRNA水平相比IFN -表现出类似的趋势γ(图5 (b))。然后我们检查在HLN Th1细胞流式细胞术。CD4细胞的百分比⁺干扰素-γ⁺在石英+ T细胞β连环蛋白成分组较硅增加在7天组和石英+ NC shRNA组(图5 (c))。总的来说,Th1反应是由于封锁Wnt /升高β连环蛋白通路在silica-induced肺部炎症阶段。

3.5。封锁Wnt /β连环蛋白通路受损的亚群

CD4细胞的亚群是一个截然不同的子集⁺T细胞维持免疫内稳态和发挥自我耐受性(36,37]。亚群的数量减少或功能导致严重的肺部炎症实验矽肺(11]。我们使用流式细胞仪确定CD4的百分比⁺Foxp3⁺在HLN T细胞。在第七天,亚相比,减少硅组和石英+ NC shRNA组。所有组没有区别在28天,56(图6(一))。具体的特定转录因子亚群。按照亚群,Foxp3明显降低在石英+ 7天β连环蛋白成分。Foxp3的减少变得不显著的silica-treated人群在28天,56(图6 (b))。在活的有机体内,亚负调节其他细胞通过产生细胞因子如TGF -β和il - 10。然后我们检查了TGF -的表达β和肺组织中il - 10的mRNA评估亚群的抑制能力。TGF -β减少在7天56与石英组和石英+ NC shRNA组。类似于TGF -β在第七天,il - 10减少(没有意义),在石英+ 56天β连环蛋白成分集团(数字6 (c)- - - - - -6 (d))。这些数据表明,Wnt /的封锁β连环蛋白通路抑制亚群和Treg-mediated抑制受损。

3.6。封锁Wnt /β连环蛋白途径缓解Silica-Induced纤维化

其次是炎症的恶化,胶原蛋白沉积在肺泡隔,间质性纤维化逐渐形成。为了研究纤维化的程度,马森的三色的蓝色染色应用于彩色化胶原蛋白在肺组织石蜡切片。在实验性矽肺的后期阶段,没有胶原蛋白沉积在生理盐水组。胶原蛋白的积累是显而易见的石英组和石英+ NC shRNA组。然而,硅+β连环蛋白成分显示显著减少胶原蛋白沉积(图组7(一))。Th1 / Th2极化驱动器实验性矽肺的进步从炎症阶段发展到纤维化阶段。在本课程中,Th2反应取代Th1反应并生成细胞因子,促进胶原蛋白的生产。删除TCF-1一项研究已经证明,下游转录因子Wnt /β连环蛋白通路,受损的Th2反应影响GATA3激活的(27]。我们的结果显示一个类似的现象,GATA3 mRNA在石英+下降β连环蛋白成分56(图组的一天7 (b))。此外,profibrogenic Th2细胞分泌细胞因子的进一步研究本研究;il - 4水平,IL-13 mRNA在天56低与石英组和石英+ NC shRNA组(数字7 (c)和7 (d))。这些数据表明,使用β块Wnt /连环蛋白成分β连环蛋白途径可以通过抑制Th2反应减弱silica-induced纤维化。

4所示。讨论

硅肺病是一种严重的职业性肺部疾病。现在它仍然是无法治愈的。吸入二氧化硅粒子首先引起炎症细胞和炎症导致肺部的积累。其次是炎症,适应性免疫驱动硅肺病的病理进展进入纤维化阶段(38]。矽肺病是弥漫性肺间质纤维化的结果甚至silicotic结节,这是对病人的呼吸功能严重破坏性。所以探索矽肺病的机制具有深远的意义为患者提供有效的治疗方法。许多研究已经证明,CD4细胞⁺T淋巴细胞参与矽肺的发病机制(39- - - - - -42]。我们先前的研究还划定,CD4的不同子集⁺T细胞调节矽肺病安排从炎症的病理阶段纤维化阶段(11,14- - - - - -17]。Wnt信号是一种进化保守的途径。广泛的证据已经证明了T淋巴细胞和Wnt /之间的紧密联系β连环蛋白通路。然而,研究主要集中在Wnt /的角色β连环蛋白通路在胸腺T细胞的发展。Wnt /功能β连环蛋白通路周边T细胞分化仍不清楚。在这项研究中,我们探讨了阻塞Wnt / Th免疫反应的变化β连环蛋白通路在实验矽肺模型。结合病理检查,我们发现Wnt /监管作用β在硅肺连环蛋白通路。我们的研究表明,silica-induced肺部炎症的严重程度被阻塞Wnt /显著增强β连环蛋白通路。然而,在晚期纤维化反应是改善。此外,被调查的监管作用阐明机制Wnt /β连环蛋白通路在CD4⁺T细胞(图8)。我们建议Wnt /β连环蛋白通路可能CD4行事⁺T细胞调节silica-induced炎症和纤维化。

规范化Wnt通路的关键蛋白,的数量β连环蛋白在细胞质中决定β连环蛋白可以把到细胞核,绑定到TCF /中位数,激活靶基因。我们用慢病毒表达成分降解β连环蛋白mRNA。因此,Wnt /β连环蛋白途径是不断被这个方法。我们之前的研究已经证实的慢病毒的效率在体外和在活的有机体内实验(32]。在这项研究中,慢病毒是通过气管内的注入阻止Wnt /管理β连环蛋白通路的肺。通过观察)染色的部分肺组织,我们发现治疗硅+β连环蛋白成分诱导显著比其他组在各个时间点上又加重炎症。这表明,Wnt /的封锁β肺部炎症加剧了silica-induced连环蛋白通路。此外,实验矽肺的进步也推迟由于持续的炎症反应。平行于圆)染色的结果,Wnt /的封锁β连环蛋白通路显示广泛的肺部炎症细胞的积累。其中,中性粒细胞和淋巴细胞显著增加的主要细胞类型。促炎细胞因子TNF -α、il - 6和il - 1β也大量分泌早期阶段的石英+β连环蛋白成分。这些建议阻塞Wnt /β连环蛋白通路在肺促进炎症细胞的积累和促炎细胞因子的分泌,这最终导致了放大silica-induced肺部炎症。

虽然先天免疫过程被证明是足够的驾驶矽肺病,Th反应仍然扮演一个重要的监管作用在矽肺的发病机制43]。Th17反应被证明参与实验性矽肺期间肺部炎症。Th17细胞和IL-17A水平治疗后肺组织明显提高小鼠二氧化硅粒子。因此,IL-17R^−−/老鼠和老鼠注射anti-IL-17A中和Abs显示明显炎症反应有限。这表明,Th17细胞具有明显的促炎作用silica-induced炎症(13- - - - - -15,44]。Th17细胞的促炎的性质主要是由IL-17A实现。IL-17RA IL-17A的受体。IL-17RA分布在多个组织,IL-17A有效促进炎症通过作用于各种细胞诱导细胞因子和趋化因子的产生如il - 6、TNF -α,il - 1β、处于受控和CXCL8 [45]。封锁Wnt /β连环蛋白通路显著增强Th17响应矽肺病的早期阶段。结果,增加IL-17A促进炎症细胞的浸润,增强促炎细胞因子的产生,引起严重的肺部炎症。调查Th17增强的机理,分析il - 6的表达和IL-23 Th17血统的承诺是至关重要的。il - 6是主要来源于先天免疫系统的多效细胞因子如巨噬细胞和DCs (46]。il - 6结合TGF -β可以持续激活STAT3信号启动Th17细胞的分化诱导的转录ROR吗γt (47,48]。IL-23不是Th17细胞的分化所必需的,但它是维持Th17细胞的增殖(49]。我们的研究显示,封锁的Wnt /β连环蛋白通路显著增加il - 6,而不是IL-23在早期阶段。这导致增强Th17响应,il - 6反过来促进了Th17细胞的分化。il - 6的相互刺激,Th17细胞放大silica-induced炎症通过阻断Wnt /β连环蛋白通路。更重要的是,Th1反应也受到阻塞Wnt /β连环蛋白通路。考虑到Th1细胞产生干扰素-γ激活巨噬细胞和维持巨噬细胞的浸润,这些表明,加重炎症是由增强Th17 / Th1反应。

亚是一个重要的T细胞谱系功能维持免疫内稳态和自我耐受性36]。在实验矽肺,treg镇压silica-induced炎症的负调节免疫应答。亚不足会引起强烈的炎症反应(11]。亚群的发展是由一系列的信号通路。最近的研究集中在Wnt /β连环蛋白通路,并演示了其参与调节亚群。一项研究,构建亚表达形式的稳定β连环蛋白证明激活Wnt /β连环蛋白途径增强亚群的生存在体外(28]。然而,另一个研究发现,抑制由亚被激活的Wnt /减少β连环蛋白通路(29日]。因此,这信号通路在亚群的作用仍有争议。在我们的研究中,亚群减少在早期通过阻断HLN Wnt /β连环蛋白通路。平行与亚群的变化,表达Foxp3 mRNA的肺也减少了。亚能分泌细胞因子如TGF -βil - 10和抑制免疫反应(50]。TGF -水平β在早期阶段和il - 10信使rna也减少了。综上所述,我们建议亚被阻塞Wnt /受损β连环蛋白通路。尽管Wnt /β连环蛋白信号通路被证明负调节的功能亚群(29日),Wnt /的封锁β连环蛋白应加强亚群的抑制能力。然而,暴露于二氧化硅引起CD4细胞的凋亡⁺T细胞(51];基因沉默的β连环蛋白在矽肺可能扑灭凋亡财产由Wnt通路。因此,亚群的生存是削弱,亚群的数量减少,这可能战胜亚群的增强功能。是显式存在亚群和Th17细胞之间的互反关系。抑制亚通过阻断Wnt /β连环蛋白通路可能促进Th17响应和诱发加重silica-induced炎症。

实验性矽肺的发病机制包含从Th1反应转向Th2反应,这种极化是由亚群。Th1 / Th2平衡确定硅引起的肺纤维化的进展。推迟Th1 / Th2极化可能减缓肺部炎症的决议,和Th2反应介导的肺纤维化将推迟。一方面,我们的研究表明,Th1反应增强了治疗β连环蛋白成分在早期和晚期仍相对较高。另一方面,我们发现,Wnt /的封锁β连环蛋白通路抑制GATA-3, Th2细胞的特定的核转录因子,以及减少profibrogenic细胞因子il - 4和IL-13。这些结果符合的证据β连环蛋白绑定TCF-1促进Th2反应和抑制Th1反应启动GATA-3表达式(27]。所以阻塞Wnt /β连环蛋白通路延迟Th1 / Th2极化影响亚群和直接抑制Th2细胞的分化,基于这样一种观念,Th2反应明显profibrotic。形态学结果符合Th1 / Th2两极分化的趋势,这是表现出的减毒纤维化晚期和严重持续的炎症。除了Th2细胞,也就不足为奇了亚可能拥有高度分泌TGF - profibrotic属性β被确定为一个关键的纤维发生的中介,也是一种有效的抗炎细胞因子(52,53]。然而,无论是亚群的概念可以防止或恶化组织纤维化仍然是有争议的。淘汰赛的观察mdig改善silica-induced肺纤维化改变Th17 /亚群平衡支持亚群是antifibrogenic [54]。然而,一些其他的研究表明,亚加剧了silica-induced通过直接(生产PDGF-B和TGF -纤维化β)或间接(调制Th1 / Th2极化)机制(11,41]。在这项研究中,抑制亚群和Th2反应通过阻断Wnt /β连环蛋白通路可能减弱silica-induced纤维化。这表明亚/ Th2轴可能扮演profibrotic活动。

5。结论

我们的研究表明,Wnt /的封锁β连环蛋白通路可以抑制亚群,提高Th17相互地回应。这种效应促进了生产大量的促炎细胞因子,导致加重silica-induced炎症。另一方面,阻塞Wnt /β连环蛋白通路延迟Th1 / Th2极化通过抑制亚群和Th2反应。因此,炎症是持续的,而实验矽肺纤维化晚期的减毒。

缩写

成分:	短发卡RNA
BALF:	支气管肺泡灌洗液
HLN:	肺门淋巴结
GAPDH:	Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶
IL-17A:	Interleukin-17A
il - 6:	白细胞介素- 6
IL-23:	Interleukin-23
il - 1β:	Interleukin-1β
il - 4:	Interleukin-4
IL-13:	Interleukin-13
il - 10:	白细胞介素- 10”
肿瘤坏死因子-α:	肿瘤坏死因子-α
干扰素-γ:	移行细胞
亚群:	调节性T细胞
Th1:	1型辅助T细胞
Th2:	辅助T细胞2型
Th17:	辅助T类型17细胞
T-bet:	T-cell-specific T-box转录因子
GATA-3:	叫绑定蛋白质3
具体:	P3 Forkhead框
ROR -γ师:	RAR-related孤儿receptor-gamma
TGF -β:	转化生长因子
CD4:	集群的区别4受体。

相互竞争的利益

作者证实不存在利益冲突。

确认

这项工作得到了国家自然科学基金的资助中国没有。81273045);辽宁高校创新研究团队项目(LT2015028)。

补充材料