文摘
荚膜组织胞浆菌是一个双晶的真菌,开发类酵母菌形态在宿主的组织,负责肺病组织胞浆菌病。最近组织胞浆菌病的发病率增加免疫功能低下的患者强调了需要理解免疫控制真菌感染。在这里,我们描述我们的发现内生的角色galectin-1 (Gal-1)的免疫病理生理学实验组织胞浆菌病。所有被感染的野生型小鼠(WT)只有1/3的Lgals1幸存下来−−/小鼠基因缺乏Gal-1幸存下来后30天的感染。虽然感染Lgals1−−/老鼠增加了促炎细胞因子、一氧化氮(NO),在中性粒细胞肺渗透和低海拔地区,他们提出了高等真菌负载在肺和脾。从Lgals1感染肺癌和被感染的巨噬细胞−−/老鼠表现出高浓度的前列腺素E2(铂族元素2巨噬细胞活化的前列腺素类监管机构)和前列腺素E合酶2 (Ptgs2)mRNA。Gal-1没有绑定的酵母细胞表面的阶段h . capsulatum,在体外,这表明Gal-1导致吞噬细胞而不是直接杀死酵母感染。数据提供了第一个示范的内生Gal-1保护性免疫反应h . capsulatum没有和铂族元素有关2作为一种重要的脂质中介组织胞浆菌病的发病机制。
1。介绍
组织胞浆菌病是一种世界已知的疾病由真菌引起的荚膜组织胞浆菌。真正的地理分布的霉菌病可能比以前想象的更广泛的(1,2]。这种真菌疾病的发病率较高的中期和东南部美国、拉丁美洲,中国和世界其他地区(2]。此外,据报道,无症状的情况下不断升级和主要影响免疫力低下的个人作为急性肺部感染类似轻微流感症状(1,3,4]。同样,最严重的症状的疾病,称为播散性组织胞浆菌病,免疫抑制患者的最常见。但是,与温和的形式,播散性组织胞浆菌病可以导致死亡4]。尽管抗真菌治疗已经用来对付真菌,目前没有替代疗法来治疗或预防h . capsulatum感染。
h . capsulatum是一个双晶的,兼性胞内病原体发现酵母相当在宿主组织(5]。在真菌感染的早期阶段,由居民肺泡巨噬细胞吞噬,树突细胞,中性粒细胞(6]。一旦吞噬,吞噬体真菌存活,因此转换成酵母。在免疫功能不全的个人或不及时治疗,水库吞噬细胞可以前往淋巴组织和传播感染。然而,诱导强烈的细胞免疫反应可以包含或吞噬细胞清除感染,因此预防感染的传播。一个有效的宿主防御h . capsulatum感染是依赖于足够的激活T细胞和吞噬细胞(6,7]。适当,Th1、Th2反应之间的平衡是基本解决h . capsulatum感染(6,7),Th1促炎细胞因子干扰素-γ(干扰素-γ),interleukin-12 (il - 12)、肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)和gm - csf(粒细胞巨噬细胞集落刺激)引起巨噬细胞的激活和间隙的关键h . capsulatum。此外,平衡生产脂质介质,如前列腺素E2(铂族元素2B)和白三烯4(LTB4),组织胞浆菌病的宿主防御是至关重要的,因为高水平的铂族元素2和低水平的LTB4影响酵母间隙和增加这种真菌疾病的严重程度8,9]。一氧化氮也参与宿主防御h . capsulatum(10,11];然而,生产过剩的中介会增加宿主酵母感染的易感性(8,12]。
除了细胞因子和脂质介质,galectin家族的一员,被称为galectin-3 (Gal-3),被认为是参与免疫反应h . capsulatum感染(13]。Galectins属于内源性凝集素家族承认聚糖存在于微生物和参与炎症反应的病理生理学,传染性疾病,自身免疫性和癌症14- - - - - -18]。
有趣的是,galectin-1 (Gal-1)已被证明参与一个先天和适应性免疫反应等不同实验感染模型鲁兹锥体(t . cruzi)[19),情况一个双重角色凝集素。这些作者表明,在低浓度,Gal-1能够减少促炎interleukin-12 (il - 12)和一氧化氮(NO),在高浓度时,感应感染巨噬细胞凋亡。Gal-1也发现促进人类免疫缺陷Virus-1(hiv - 1)传染性20.];登革病毒感染,它可能导致一个抑制影响病毒的复制(21]。因此,几个Gal-1外生属性相关CRD与细胞表面受体结合,调节免疫细胞功能、迁移、分化、活化和细胞生存22- - - - - -27]。然而,这种凝集素与细胞内的配体的相互作用也会发生独立的碳水化合物(28,29日]。
尽管Gal-1可以参与各种病理生理过程,几乎没有信息Gal-1在真菌感染的作用。因此,本研究评估的生物影响缺乏Gal-1组织胞浆菌病的小鼠模型。虽然老鼠基因缺乏Gal-3 (Lgals3−−/)能够清楚h . capsulatum感染更有效地比野生型小鼠(WT) (13),这是第一次报道,Gal-1 (Lgals1−−/)老鼠更容易h . capsulatum感染与WT组。这种独特的免疫表型对真菌抑制宿主反应,其次是高水平的嗜中性粒细胞浸润和促炎细胞因子在肺部,引起强烈的抗炎反应水平较高的铂族元素2也没有。这些发现表明小说的贡献内生Gal-1保护性免疫反应的发展h . capsulatum。
2。结果
2.1。Lgals1−−/来华的老鼠无法控制h . capsulatum感染
WT和Lgals1−−/老鼠注射5×105h . capsulatum酵母细胞直接进入肺部和生存是监控多达30天。在感染后14天,Lgals1−−/来华的老鼠开始死亡。33%的Lgals1−−/来华的小鼠存活感染后30天,而同期100%的感染了WT小鼠存活(图1)。
2.2。Lgals1−−/来华的老鼠有更高的酵母负载和中性粒细胞的浸润肺
以确定Lgals1的高死亡率−−/老鼠与受损的真菌间隙,h . capsulatum负载是肺和脾的量化。考虑到Lgals1−−/老鼠开始死后第14天感染,感染后15天一个临界点的进化实验使用突变小鼠组织胞浆菌病、真菌亚致死的剂量(9),感染后的15天,肺实质组织病理学分析和量化的真菌在肺和脾进行负担。Lgals1−−/来华的老鼠提出更多的酵母细胞在肺实质(数字2(一个)和2 (b)在肺(图)和高等真菌负载2 (c)(图)和脾脏2 (d))。尽管感染Lgals1−−/老鼠提出更高的肺部真菌负担,增加中性粒细胞涌入检测肺组织(数据3(一个)和3 (b))。众所周知,一个有效的免疫反应h . capsulatum与真菌的肺/抑制真菌的影响渗透到吞噬细胞(6,30.]。因此,这些发现表明,内生Gal-1需要开发一个保护性免疫反应h . capsulatum和Gal-1可能的控制作为一种有效的抗真菌复制- h。capsulatum活动效应器功能和监管组织中性粒细胞的积累。
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2.3。Lgals1−−/来华的老鼠显示增加了肺的促炎细胞因子
众所周知,增加的炎性细胞因子的表达,包括白介素、干扰素-γ,和肿瘤坏死因子-αimmune-protective反应,是至关重要的h . capsulatum来华的老鼠(31日- - - - - -34]。因此,分析的炎性细胞因子在WT和Lgals1模式−−/老鼠后15天h . capsulatum感染,IL-12p40的水平,TNF -α,il - 1α,il - 10、il - 4和il - 6在肺匀浆测定。有更高水平的IL-12p40(图4(一))和il - 1α(图4 (c))和类似的TNF浓度-α(图4 (b)Lgals1)均质肺−−/来华的老鼠,相比WT被感染的老鼠。此外,肿瘤坏死因子-没有明显的统计学差异α(图4 (b))观察,il - 10、il - 4和il - 6(数据未显示)不产生可检测水平。
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2.4。Lgals1−−/来华的老鼠证明前列腺素E2生产过剩和一氧化氮
根据上述结果,也是分析是否炎症介质,如没有和铂族元素2与增加的促炎细胞因子水平有关,因此免疫抑制在缺乏内源性Gal-1实验组织胞浆菌病。据报道,抑制cox - 2改善宿主防御h . capsulatum(8]。因此,铂族元素2从均质肺量化来自感染WT Lgals1−−/老鼠后15天h . capsulatum感染。Lgals1肺部的感染−−/老鼠表现出更高水平的铂族元素2(图5(一个))相比,感染WT老鼠。因此,与其他出版结果一致(8,35),这些发现表明,较高的铂族元素2可能导致感染的易感性Lgals1吗−−/老鼠。有趣的是,不仅铂族元素2也没有增加水平的肺组相比WT(图4 (d))。
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2.5。未感染Lgals1−−/巨噬细胞表达高水平的前列腺素E合酶2在真菌感染
的免疫反应h . capsulatum是由Th1细胞介导的,这需要巨噬细胞激活(6,7]。致病性真菌酵母复制在这些细胞,导致生产花生四烯酸的代谢产物,如前列腺素和白细胞三烯(35]。评估内生Gal-1在铂族元素的作用2生产、前列腺素E合酶2 (Ptges2) mRNA表达从Lgals1腹膜巨噬细胞−−/和WT小鼠感染或不是h . capsulatum体外被评估。有趣的是,24小时后h . capsulatum感染,Lgals1−−/巨噬细胞增加了Ptges2 mRNA表达相比,感染了WT巨噬细胞。此外,较高的铂族元素224小时后上层清液中检测到Lgals1的感染−−/巨噬细胞相比WT巨噬细胞(图5 (c))。因此,在体外结果与前列腺素的生产过剩在活的有机体内(图5(一个))。
2.6。Galectin-1不绑定并杀死酵母的形式h . capsulatum
最近,据报道,galectins可以绑定聚糖不仅在宿主细胞表面,而且在分子病原体,这被发现导致病原体杀死和调制对细菌感染的免疫反应36,37]。评估Gal-1的结合能力h . capsulatum表面,biotinylated-human重组Gal-1 (hrGal-1: 1μ米和4μ米)与酵母的孵化h . capsulatum。Gal-1没有绑定到酵母的真菌(图6(一))尽管hrGal-1活跃,因为那样绑定到聚糖HL-60细胞(图6 (b))。正如所料,不同浓度的hrGal-1(0.5, 1.0, 2.5, 4.0,和10.0μ米)没有改变的可行性h . capsulatum在24和48 h在体外孵化(图6 (c))。这一结果表明,相关的约束效果可以杀死斯托活动等。36)描述大肠杆菌Gal-4和Gal-8菌株。因此,酵母的形式h . capsulatum似乎不是表达Gal-1配体,表明Gal-1的保护机械的影响h . capsulatum酵母感染不涉及Gal-1绑定。
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3所示。讨论
Galectins已经被描述为监管者炎症模型和传染病的免疫反应和宿主病原体识别(14,25,27,36,38- - - - - -41]。Gal-1 Gal-3最研究galectin家族的成员,这些蛋白的表达增加或减少在不同的细胞类型不同的病原体引起的感染(42,43]。先前的报道表明,Gal-3参与酵母感染(13,39,44];然而,Gal-1真菌疾病的作用尚未研究。尽管Gal-3在树突细胞的表达不是调节在WT老鼠感染h . capsulatum、老鼠基因缺乏Gal-3清楚这真菌感染更有效地比WT老鼠13),表明高Gal-3表达WT老鼠并不需要参与免疫反应h . capsulatum和实际上可能导致发病机理(13]。
出乎意料,Gal-3基因敲除小鼠更容易白色念珠菌比WT感染小鼠和磁化率与高真菌大脑的负担。此外,Gal-3,但不是Gal-1,可以诱导酵母细胞死亡在绑定β1,2-linked oligomannosides表面上的致病真菌白色念珠菌(44]。因此,Gal-3和Gal-1似乎不同参与宿主防御机制对真菌感染,和这个特性可能出现特定的病原体。播散性念珠菌病模型,缺乏Gal-3负责增加易感性(39]。在目前的研究中,与Gal-3-deficient老鼠(13小说),观察到缺乏内生Gal-1易感性增加h . capsulatum伴随着高等真菌加载在肺和脾。最近,据报道,Lgals1−−/感染小鼠皮内与t . cruzi对这种寄生虫感染WT同行相比,这种耐药表型可以关联到一个障碍在监管属性Gal-1后跟高Th1促炎细胞因子的生产和改善Th1和CD8+T细胞反应(25]。然而,另一个来自同一组报告Lgals1描述−−/小鼠腹腔内感染t . cruzi显示高架寄生虫血症,减少组织炎症,更高的死亡率比小鼠感染WT (45]。这些作者表明,这种差异可能与不同的吞噬细胞在感染的网站的存在和不同的局部免疫反应引起的t . cruzi。基于这些报告和现在的数据,建议Lgals1的感染−−/老鼠、气管内的h . capsulatum促进一个独特immunophenotype对真菌抑制宿主反应。这种特殊的免疫情况的特征是炎症不均衡与高水平的嗜中性粒细胞浸润和促炎细胞因子在肺部,引起强烈的抗炎反应引起的高水平的铂族元素2和一氧化氮的调节吞噬细胞和T细胞功能。
基于证据表明Gal-4 Gal-8可以绑定和杀死细菌,表达人类血型b抗原和常见的哺乳动物抗原α加[36,46),它是假设Gal-1可能对酵母的形式有相同的影响h . capsulatum。然而,相比之下Gal-4 Gal-8杀害活动对细菌,Gal-1既不肯定也不杀死了酵母表单(图6)。这些数据表明Gal-1贡献的能力适当控制真菌感染来自间接贡献,因为Gal-1显然是参与免疫反应的调制h . capsulatum。
接下来,这是评估缺乏Gal-1是否会干扰期间招募中性粒细胞肺感染,因为这凝集素可以调节炎症反应(24,47]。众所周知,中性粒细胞迁移到网站帮助清除病原体感染的48]。人类中性粒细胞能够影响的增长h . capsulatum酵母形式,这种microbiostatic效应主要由化合物中介导嗜苯胺蓝的颗粒(49]。此外,在实验组织胞浆菌病,GR-1损耗+真菌细胞,主要是中性粒细胞,促进增加负载在肺部、脾脏和降低动物的生存甚至在高水平的肿瘤坏死因子-的存在α和没有50]。先前的报道表明,老鼠基因缺乏Gal-1增强中性粒细胞移民对il - 1的回应β相对于野生型同行(51]。此外,zymosan-induced腹膜炎动物模型的外生Gal-1显示导致生产促炎细胞因子和粘附分子的表达降低中性粒细胞表面,从而减少他们的迁移率47]。目前的结果是一致的与他人,这表明h . capsulatum促进强烈的中性粒细胞招募Lgals1肺的−−/老鼠(图3);然而,这些吞噬细胞无法明确肺肺实质的真菌。其他作者已经证明upregulation促炎细胞因子/趋化因子导致更高的肺中性粒细胞数量也减少宿主防御的能力,消除真菌(9]。因为Gal-1可以调节粘附分子表达以及释放介质的免疫反应(22- - - - - -24,47),这是评估是否增加中性粒细胞浸润肺与恶化密切相关的细胞因子在炎症反应h . capsulatum感染。强烈的中性粒细胞Lgals1肺的积累−−/老鼠可以解释为高水平的il - 1α(图4 (c)细胞因子),因为这是一个中性粒细胞化学引诱物(52,53]。此外,大量的中性粒细胞的存在可能是il - 12的主要来源从infected-Lgals1检测到肺−−/老鼠,中性粒细胞产生il - 12已报告(54]。奇怪的是,抑制dectin-1表达式,真菌葡聚糖的宿主受体,减少真菌感染的严重程度及其影响是减少促炎细胞因子,包括白介素和中性粒细胞浸润[55]。此外,众所周知,促炎细胞因子,包括白介素(32,34,56,57),对于宿主防御至关重要h . capsulatum。相反,目前的模型,il - 12的增加并没有促进Lgals1肺部真菌间隙−−/老鼠。基于这些结果,可以推测,IL-12p40和il - 1的过度生产α在Lgals1−−/来华的老鼠是有害的动物。有趣的是,Lgals1−−/老鼠更耐药鲁兹锥体感染比野生型小鼠的表型与upregulation干扰素-γ并没有显著的生产IL17A [25]。然而,在Lgals1 1型单纯疱疹病毒感染−−/老鼠促进一种严重的疾病,与野生型相比,与中性粒细胞入渗和干扰素-人数的增加γ第CD4 T细胞和无显著改变眼的IL-17-producing T细胞(58]。然后,考虑到(i)免疫调节Gal-1与监管相关联的属性1,17反应(59),(2)il - 12和IL-23份额p40亚基(60),(iii) IL-17 / IL-23-axis细胞因子参与免疫反应h . capsulatum感染(33),应该做进一步的调查,以阐明IL17 / IL23实验的影响缺乏内生Gal-1组织胞浆菌病。除了细胞因子的生产,它是分析是否杀菌剂的因素,如没有,可以调制Gal-1的不足,这可能是抑制宿主防御的基础h . capsulatum。发现的缺陷Gal-1促进肺部没有浓度的增加受感染的老鼠相比,感染WT老鼠。这些结果与其他研究表明Gal-1一致性负调节的生产通过激活巨噬细胞或microglia-like细胞(23,61年从Lgals1)和活化的小胶质细胞−−/小鼠产生高浓度的(62年]。此外,高水平的生产(图4 (d)在肺没有杀微生物的影响h . capsulatum因为肺Gal-1Lgals1−−/小鼠CFU较高(图2)。因此,没有似乎是重要的宿主防御的主要感染h . capsulatum(11];尽管如此,生产过剩的也已被证明能够抑制巨噬细胞的吞噬活动h . capsulatum感染和抑制CD4 T细胞增殖反应t . cruzi感染(12,34,50]。
肺泡巨噬细胞在宿主防御的第一行肺对呼吸道病原体,这噬菌细胞脂质介质的重要来源,如铂族元素2在感染肺(63年]。PGE2有一个重要的角色在抑制宿主防御调制不同肺部感染肺泡巨噬细胞功能的模型,如链球菌引起的肺炎(64年),肺炎克雷伯菌(65年),铜绿假单胞菌(66年),最近h . capsulatum(8]。从Lgals1肺癌和巨噬细胞−−/来华的老鼠产生更高水平的铂族元素2相比WT老鼠。然后,假设没有高水平的和铂族元素2在Lgals1肺部−−/来华的老鼠抑制巨噬细胞和中性粒细胞的效应功能h . capsulatum。缺乏内生Gal-1能否抑制中性粒细胞的效应函数h . capsulatum不过,仍是未知的。
铂族元素2能够抑制白介素生产由巨噬细胞和树突细胞(67年从感染Lgals1],尽管肺实质−−/老鼠可以包含更高水平的il - 12比感染WT老鼠甚至在高水平的铂族元素的存在2。这一发现是在协议与其他研究报告,抑制前列腺素对il - 12的生产没有影响h . capsulatum来华的老鼠(8]。此外,目前的数据类似于别人,证明Gal-1的免疫调节效应(内源性或外源性)与抑制Th1细胞因子相关,包括白介素的负面调制生产通过激活巨噬细胞或耐受性树突状细胞(19,68年- - - - - -71年]。
由于低收益率的小鼠肺泡巨噬细胞,从Lgals1腹膜巨噬细胞−−/老鼠用于检查能力的内生Gal-1调节mRNA的表达Ptges2和铂族元素2后h . capsulatum感染(图5 (b))。高等真菌在肺和脾感染Lgals1负担−−/老鼠的影响差别可能与对这些铂族元素2抗菌功能的吞噬细胞(8,72年]。
夸张的炎症反应可能负责高铂族元素的生产2肺的h . capsulatumLgals1来华的−−/老鼠抑制真菌间隙,因为铂族元素2在炎症条件下生物合成增加,前列腺素类描述损害吞噬并杀死了肺泡巨噬细胞(73年]。此外,从Lgals1吞噬细胞的效应函数−−/可以被改变,因为Gal-1多功能分子内部和细胞外的影响(28,29日]。这种免疫抑制效应符合当前的结果,展示了对信使rna产生积极影响Ptgs2表达和铂族元素2从Lgals1 Gal-1缺陷的巨噬细胞分泌−−/真菌感染后的老鼠。这个数据是同意由拉比诺维奇和他的同事所描述的结果,因为这凝集素可以降低花生四烯酸释放和铂族元素2从激活的巨噬细胞分泌27]。除此之外,塞来昔布治疗,选择性环氧合酶2抑制剂,改善了免疫反应h . capsulatum通过抑制前列腺素的生产(感染8]。奇怪的是,塞来昔布的诱导表达Gal-1激活巨噬细胞和Gal-1可能参与这种药物的抗炎机制(74年]。此外,Gal-1抑制激活转录因子的表达,消极的mRNA的监管机构Ptgs2在巨噬细胞75年]。尽管如此,进一步的研究需要阐明Gal-1抑制的机制Ptgs2表达式。它已经表明,铂族元素2是一个潮湿(有关分子模式)和诱导,公布的死亡细胞,导致抑制与炎症相关的基因的表达,从而限制了免疫刺激性活动(76年]。同时,铂族元素2是人类系统性表达下调炎性疾病和减少铂族元素和老鼠吗2表现出系统性炎症(77年]。总之,目前的结果表明,内生Gal-1在宿主防御中起着重要的作用荚膜组织胞浆菌调制的铂族元素2,白介素,没有生产,以及肺中性粒细胞积聚。未来的研究需要更好地理解内生galectin-1的细胞和分子机制可能参与宿主防御真菌感染。
4所示。材料和方法
4.1。动物
Six-to-eight-week-old野生型(WT)雄性老鼠和老鼠基因缺乏Gal-1 (Lgals1−−/),在C57BL / 6 j背景,被安置和饲养在动物设施的医药科学学院小溪Preto(巴西圣保罗大学)。野生型老鼠最初从杰克逊实验室购买(美国我巴尔港)和Lgals1−−/理查德·d·卡明斯博士提供的老鼠(外科学系,贝斯以色列女执事医疗中心和哈佛医学院波士顿,MA,美国)。实验协议批准和按照指南进行机构的动物保健委员会。检查Lgals1的损耗,Gal-1表达式(mRNA和蛋白)分析WT Lgals1−−/细胞进行如前所述[21分别使用常规rt - pcr)和免疫印迹(数据没有显示)。我们使用C57BL / 6 j小鼠作为野生型同行在我们的实验。
4.2。h . capsulatum应变和感染的老鼠
h . capsulatum应变隔离病人的临床医院、医学院的小溪Preto,圣保罗大学的特性和制备h . capsulatum酵母细胞进行如前所述[9,78年,79年]。酵母文化用于≥90%可行性根据荧光素二乙酸(Sigma-Aldrich、圣路易斯、钼)和溴化乙锭(Sigma-Aldrich)染色80年]。老鼠在气管内的包含100(信息技术)色散μL磷酸缓冲盐(PBS、车辆控制)或PBS(5×10次致死量5酵母/动物)。选择适当的培养液大小Sa-Nunes和他的同事描述基于过程(78年]。在15天之后感染,感染和感染小鼠安乐死在有限公司2室,肺脏和脾脏进行分析。
4.3。真菌负载和组织病理学
h . capsulatum来华的小鼠安乐死在感染和组织样本后15天收获。肺部分(5μ米)是嵌入在石蜡块和沾格罗克特methanamine银(GMS)和量化的酵母表达为酵母/毫米2(原放大:400 x)。同时,真菌负担决心从均质肺和脾(混合均质器;Labortechnik、Staufen、德国)如前所述7,9]。连续稀释这些组织匀浆被镀到BHI血液琼脂和孵化37°C 21天。结果表示为每克肺平均菌落(CFU)±SEM (CFU / g)或者CFU /整个脾脏±SEM (CFU /脾)。肺收集、固定在10%甲醛和嵌入在石蜡块。中性粒细胞分析、肺部分(5μm)与苏木精和伊红染色())和细胞被量化的接目镜包含10×10格(0.0624毫米2每个的放大:400 x)。结果表示为中性粒细胞/毫米2。
4.4。细胞因子的测量,铂族元素2和一氧化氮
肺部感染收集15天后,称重和均质(混合均质器;Labortechnik Staufen、德国)2毫升的RPMI1640(σ)和上层清液储存在−70°C,直到被化验。商用ELISA抗体被用来衡量TNF -α,il - 1αIL-12p40, il - 10、il - 4和il - 6 (BD OptEIA ELISA集;BD Pharmingen)根据制造商的指示。铂族元素2从肺匀浆和在体外试验(在体外分析下面描述)被Sep-Pak纯化C18墨盒根据制造商的指示(水域Corp .,米尔福德,MA)。量化的铂族元素2也评估了ELISA(开曼化工、安阿伯、MI)和细胞因子和铂族元素的结果吗2表达在ng / mL。的敏感性分析是< 10 pg / mL。亚硝酸盐()浓度(μ米)在肺匀浆测定格里斯反应与纳米系列稀释使用标准曲线2(Sigma-Aldrich)。格里斯试剂使用为了测量没有水平间接从亚硝酸盐如前所述10]。
4.5。基因表达的实时聚合酶链反应(存在)
4.5.1。在体外分析
WT或Lgals1−−/腹膜巨噬细胞(5×105细胞/)孵化了h . capsulatum(MOI 1: 1)在2和24小时。铂族元素2评估在上层清液感染后24小时,mRNA的表达是镀后巨噬细胞2和24小时吗h . capsulatum曝光。
4.5.2。基因表达
总mRNA孤立使用RNeasy迷你包(试剂盒Inc .,瓦伦西亚,CA),根据制造商的指示。互补脱氧核糖核酸(互补DNA)总RNA的合成从600 ng使用随机引物(高容量cDNA逆转录设备,应用生物系统公司,泰梅库拉,CA)。整除2μL总数的cDNA被存在放大(StepOne +、应用生物系统公司、新加坡)使用引物(IDT®、集成DNA技术,加利福尼亚,美国)Ptges2(前列腺素E合酶2基因编码,Mm.PT。58.7480753)和探测器(TaqMan®基因表达分析,应用生物系统公司,促进城市,美国)。Actb基因(Mm00607939)被用来作为参考。放大了在复制下列条件:变性在95°C 10分钟,其次是40 95°C的周期为1分钟15秒和60°C。相对量化使用ΔΔCt方法和策划执行折叠、折叠法规增加日志2。
4.6。人类重组Galectin-1 (hrGal-1)净化
hrGal-1准备如前所述[26,81年]。简单,提纯hrGal-1接受100毫米碘乙酰胺(Sigma-Aldrich) 100毫米乳糖/ PBS一夜之间在4°C (82年]。以确保hrGal-1样本endotoxin-free, Detoxi-Gel内毒素去除凝胶(皮尔斯生物技术,罗克福德,IL)是由血细胞凝集和hrGal-1活动评估使用(数据没有显示)。
4.7。绑定通过流式细胞术和刃天青细胞生存能力分析
测量的能力Gal-1酵母形式的结合h . capsulatum,1μ米和4μM biotinylated-hrGal-1孵化了1小时在4°C,在20毫米乳糖存在与否或蔗糖(Sigma-Aldrich)。洗后,酵母与streptavidin-FITC孵化(杰克逊IR) 30分钟在4°C,洗,formalin-fixed在PBS (1%)。标记细胞流式细胞仪上获得章(山景城,正欲、钙、美国)和分析在天后软件(正)。作为对照,我们使用从美国获得HL-60细胞类型文化集合(写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州)和维护RPMI中补充10%胎牛血清。测试h . capsulatum可行性Gal-1面前,我们孵化,在体外,几个hrGal-1浓度(10、4、2.4、1、0.5μ与1×10 M)6酵母细胞在24和48 h。相对荧光单位(RFU)使用一个盘子读者发现(560 - 590 nm)为了分析酵母细胞新陈代谢活跃的数量使用染料刃天青试剂(Sigma-Aldrich)。
4.8。统计分析
提出了数据均值±SEM。比较用方差分析后进行Bonferroni期末测验的棱镜4.0统计程序(GraphPad软件,圣地亚哥,CA)。生存分析使用Mantel-Cox log-rank (“卡方”)测试。生存率较生存的差异进行了分析。的值被认为是具有统计学意义。
缩写
| Gal-1: | Galectin-1 |
| Lgals1−−/: | Galectin-1不足的老鼠 |
| WT: | 野生型老鼠 |
| Th1、Th2: | 辅助T细胞反应 |
| 干扰素: | 干扰素 |
| IL: | 白介素 |
| 肿瘤坏死因子-α: | 肿瘤坏死因子-α |
| gm - csf: | 粒细胞巨噬细胞集落刺激 |
| 铂族元素2: | 前列腺素E2 |
| Ptgs2: | 前列腺素E合酶2 |
| : | 亚硝酸盐 |
| 没有: | 一氧化氮 |
| 艾滋病毒: | 人类免疫缺陷Virus-1 |
| htlv 1: | 人类T淋巴Virus-1 |
| BALF: | 支气管肺泡灌洗液。 |
相互竞争的利益
作者宣称没有利益冲突。
确认
作者感谢Seema r·帕特尔博士的评论手稿,康妮·m·亚瑟博士有用的讨论,和鲁本斯爱德华多·达·席尔瓦的援助与动物处理和技术支持。这项工作是由Fundacao德帕罗尽管做Estado de圣保罗(FAPESP,必须占州政府授予2007/02487-3号、2007/00840-8 2011/17611-7),慰问Nacional de Desenvolvimento Cientifico e学府(CNPq,格兰特nos, 557403/2008-1 467646/2014-7), Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de含量(斗篷,格兰特没有。咳嗽9320/13-0),国立卫生研究院(NIH AL101982,理查德·d·卡明斯)。此外,研究导致这些结果得到了支持和资金从而言de Apoio尽管em Doencas Inflamatorias (NAPDIN,格兰特没有。11.1.21625.01.0)。