文摘
激肽肽无所不在地发生在神经组织和参与炎症过程与不同的神经紊乱有关。这些物质也被证实能促进氧化应激。另一方面,氧化应激和炎症的重要性一直强调在神经退行性疾病涉及过程,如帕金森病(PD)。越来越多的报道证明了增加激肽受体的表达在神经退行性疾病。在这项研究中,缓激肽和des-Arg的效果10胰激肽,两个代表性的细胞分裂素肽,分析了炎症反应和氧化应激诱导的帕金森病细胞模型,获得与一种神经毒素,刺激细胞分化SK-N-SH后1-methyl-4-phenylpyridinium。激肽肽引起的增加细胞因子释放和增强活性氧的生产,没有细胞。这些变化是伴随着细胞生存能力的丧失,还存在一个更大的激活参与了细胞凋亡过程。此外,神经毒素和细胞分裂素肽改变了多巴胺受体2表达。激肽受体表达也改变了神经毒素。这些结果表明调解的作用,细胞分裂素肽发展的神经退化和可能提供新的可能性的监管通过使用特定的激肽受体拮抗剂。
1。介绍
神经退行性疾病是一个全球健康问题,是老年人群高死亡率的主要原因。最常见的一种神经系统退行性疾病是帕金森病(PD)。它与多巴胺神经元的死亡在大脑的基底神经节1]。不管这种疾病的病因,包括遗传或环境因素、炎症过程与神经退化的进程相关联2,3]。事实上,几行证据证实神经炎症和神经退行性疾病之间的相互依存关系,包括细胞因子释放和增加一个不平衡的分子参与氧化应激(2- - - - - -5]。这些物质,主要由小胶质和树突细胞,作用于星形胶质细胞和神经元,诱导二次反应可以导致神经组织不受控制炎症,导致细胞凋亡。此外,神经细胞的能力释放炎症介质和活性氧(ROS)在回应刺激也被报道(5]。因此,一个间接的自我毁灭的神经元在神经退行性疾病不能排除。目前的研究表明,细胞分裂素,有效的促炎的肽,可以由细胞的神经系统,即使是由神经细胞(6- - - - - -8[],他们的存在是与神经炎症9- - - - - -11]。分化和正γ刺激神经母细胞瘤细胞系IMR-32能够迅速产生大量的血管舒缓激肽及其代谢物,没有精氨酸残基的肽糖基,通过一个具体的激肽受体1型(B1R),促进炎症反应(6]。此外,越来越多的研究表明激肽受体参与神经障碍包括那些与细胞变性(11- - - - - -15]。这是证明了细胞分裂素不仅能激活nonneuronal细胞,如星形胶质细胞和小胶质细胞、神经元,导致促炎反应(16- - - - - -18]。最近,有趣的调查抗炎治疗帕金森病的报道(19]。尽管没有直接的证据激肽肽参与PD提出了到目前为止,考试这些肽在退化过程的影响似乎是有趣的。在目前的研究中,我们调查的影响缓激肽(BK)和des-Arg10胰激肽(DAKD)凋亡标记(如半胱天冬酶活动)或细胞的生存能力在帕金森病细胞模型。Neuron-like细胞,获得类维生素a acid-differentiated人类神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH,接受一种神经毒素,1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP +),显示增强的退行性反应。治疗与细胞分裂素肽增强这种效果,伴随着增加细胞因子释放和代氧化分子。
2。材料和方法
2.1。化学物质
兔多克隆抗体激肽受体1、鼠标单克隆抗体对细胞分裂素受体2 (B2R) FITC-conjugated山羊兔多克隆抗体,TRITC-conjugated兔多克隆抗体鼠标由Abcam(英格兰)。BK和DAKD获得Bachem(瑞士)。interleukin-1 ELISA试剂盒检测细胞因子β(il - 1β)、白细胞介素- 6 (il - 6)、肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)购买的BD生物科学(美国)。2-Mercaptomethyl-3-guanidinoethylthiopropanoic酸(MGTA)是由Calbiochem(美国)和荧光安装介质DAKO(丹麦)。引物都是来自基因组(波兰)。SYBR绿色装备实时PCR从Kapa购买生物系统公司(美国)。一套半胱天冬酶的测定3/7活动(CaspoGlo3)和M-MLV逆转录酶工具包是来自Promega(美国)。兔多克隆抗体D2受体(D2R)购买的圣克鲁斯生物技术(美国)。2,3-Diaminonaphthalene(丹),2,7-dichlorodihydrofluorescein二乙酸(DCFH2-DA) icatibant(锄)des-Arg10-icatibant (desHOE)、卡托普利、杆菌肽、蛋白酶抑制剂、类维生素a酸(RA)、1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP +)、刃天青钠盐,4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Tri-Reagent和标准物质由σ(美国)。抗生素、抗真菌的细胞培养基、胎牛血清的边后卫,不必要的氨基酸,丙酮酸钠购自热科学(美国)。
2.2。细胞培养、分化和帕金森病细胞模型
人类神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH写明ATCC(美国)是由在MEM培养基培养有1%不重要的氨基酸,补充丙酮酸钠1毫米,1 U /毫升青霉素,1μ2.5 g / mL链霉素和μg / mL两性霉素B, 10%的边后卫在湿润的气氛中含5%股份有限公司2在37°C。与5 SK-N-SH细胞分化μM RA neuronal-like细胞根据以前公布的方法(20.]。帕金森病细胞模型是通过刺激RA-differentiated细胞与2.5毫米MPP + 1%的边后卫MEM培养基为24小时。神经突的长度变化与倒置相差显微镜观察(Eclipse TS100尼康,日本)配备ToupCam工业数码相机(TP605100A,中国)之前和之后的刺激与神经毒素。
2.3。细胞生存能力测量
激肽肽在细胞生存的影响细胞PD模型评估利用AlamarBlue®化验。分化后的细胞在不同浓度和BK DAKD孵化(1纳米或1μ米)在1%的边后卫细胞培养基补充kininase抑制剂(10μM MGTA, 20μM卡托普利,500μ杆菌肽)为24小时。第二天,细胞治疗与2.5毫米MPP +包含激肽肽在新鲜培养基。进一步24小时孵化后,细胞生存能力进行了测试。短暂的刺激中丢弃和100年μ刃天青L(10%苯酚red-free介质被添加到每个。然后,细胞被孵化后4小时37°C和当时上层清液的荧光测量使用协同H1标仪(美国BioTek仪器)在560 nm励磁和590 nm发射波长。同时,样品没有MPP +或激肽治疗也被测量。
2.4。半胱天冬酶活性测定
半胱天冬酶活动3/7化验使用luminogenic衬底化学发光方法。RA-differentiated细胞(6×103与BK)孵化或DAKD 1 nM或1μM浓度为24小时。接下来,样本刺激在生存能力测试(见上图)和半胱天冬酶进一步后24小时3/7活动测量根据制造商的指示。化学发光测定使用协同H1标仪(美国BioTek仪器)。一些样品第一次preincubated对激肽受体拮抗剂,icatibant(锄)和des-Arg10-icatibant (desHOE) 1μM浓度为2小时前激肽和拮抗剂治疗还在进一步与细胞分裂素和MPP +孵化。
2.5。基因表达分析
从未经处理的细胞或细胞总RNA孵化与5毫米MPP + 1μM BK,或1μM DAKD数小时与Tri-Reagent孤立。B1R mRNA的表达,B2R D2R, il - 1β,il - 6,诱导没有合酶(间接宾语)和肿瘤坏死因子-α分析了实时PCR过程。延长因子2 (EF-2) mRNA的表达也决定在每个样本进行随后的定量分析。互补脱氧核糖核酸合成M-MLV逆转录酶设备根据制造商的指示。然后,放大的cDNA SYBR绿色装备和执行特定的引物,使用7500快速实时PCR系统thermocycler(生活技术,美国)。分析基因的一对引物序列中指定的表1。退火温度的实时PCR B1R 58°C, B2R, EF-2, 60°C D2R和il - 6和il - 1的62°Cβ,进气阀打开,TNF -α。PCR条件95°C 10分钟,其次是95°C 15秒,15秒的退火温度,30年代和72°C(40周期)。测量是基于比较分析基因表达相对于管家基因表达(EF-2)。基因表达的相对价值()与7500年计算的快速实时软件使用方程:,在那里是阈值循环。
2.6。ROS水平测量
细胞内ROS水平决定了荧光测定使用2,7-dichlorodihydrofluorescein二乙酸(DCFH2-DA)染料的氧化(21]。SK-N-SH细胞(1.3×105不透明的微型板块,明确底部)被播种在预镀1%明胶。分化后,细胞与细胞分裂素预处理如上所述下孵化与100年30分钟μM DCFH2-DA介质中含1%的边后卫。然后,细胞被洗了三次和刺激1μM DAKD或1μM BK在2.5毫米MPP +的存在或没有神经毒素。荧光信号的变化测量每30秒在20分钟37°C,使用微型板块协同H1读者在激发和发射波长485 nm和528 nm,分别。
2.7。测量没有释放
荧光测定(22)是用于分析的影响细胞分裂素肽生产的亚硝酸盐(最后没有代谢物)。支流RA-differentiated细胞细胞分裂素处理如上所述下孵化1μM BK, 1μM DAKD的存在或没有2.5毫米MPP + 15到30分钟。孵化期之后,亚硝酸盐浓度是浮在表面的测量。简单地说,100年μ10 L上层清液的混合μL 0.05毫克/毫升丹在不透明的微型板块和孵化在黑暗中30分钟。反应停在添加5μL 2.8 M氢氧化钠和荧光测量协同H1标在激发和发射波长的365和450海里,分别。亚硝酸盐浓度的基础上计算了两种不同的标准曲线(有或没有MPP +)。
2.8。ELISA测量细胞因子的释放
SK-N-SH细胞(4×105)被播种在12-well板、分化与RA 3天,然后刺激与1 6到24小时μM BK或1μ米DAKD 2.5毫米MPP +的存在或没有神经毒素。一些样品第一次preincubated激肽受体的拮抗剂如上所述。所有与介质实验进行补充与蛋白酶和kininase抑制剂。释放细胞因子(il - 1的评估β、il - 6和TNF -α)到媒介评估ELISA包根据制造商的指示。吸光度测量使用PowerWave标仪(美国BioTek仪器)在450海里。
2.9。细胞分裂素和多巴胺受体的免疫荧光分析
确定细胞表面受体,B1R、B2R D2R,使用与特定的标记抗体免疫荧光技术。细胞(5×104)被播种在盖玻片12-well RA-differentiation后板和刺激与5毫米MPP + 1, 2, 5个小时。额外的实验旨在分析激肽肽对D2R表达的影响也表现。分化细胞孵育1μM BK或1μM DAKD 30分钟、1小时、3小时。接下来,与冷甲醇和小时固定后阻塞以2%的边后卫,细胞被孵化一夜之间在4°C 50倍稀释主要抗体:兔多克隆anti-B1R,鼠标单克隆anti-B2R和兔多克隆anti-D2R。洗后,样品被孵化一小时(1:250)二级抗体稀释:山羊FITC-labeled anti-rabbit或兔子TRITC-labeled anti-mouse。然后,2μM DAPI添加10分钟,广泛的洗涤后,封面幻灯片被安装在使用荧光显微镜载玻片安装介质。负控制样本准备省略的孵化主要抗体。样本分析数字化DMIRE2显微镜(德国徕卡)和图像被油浸下40 x放大。荧光强度测量在至少三个随机选择使用ImageJ软件领域的每一个画面。亮度测量区域被选中“切片”过程中,与一个常数较低的阈值。负控制样本的值减去从正面贴上幻灯片。结果对照组为100%荧光强度。
2.10。统计分析
所有值都呈现意味着±标准差从至少三个实验;学生的统计显著性进行了分析以及。
3所示。结果
3.1。帕金森病细胞模型中细胞分裂素肽诱导凋亡过程
帕金森病的一个合适的细胞模型获得neuron-like刺激后细胞与神经毒素MPP +。的RA-differentiated SK-N-SH细胞显示增加神经突退化,伴随着减少的细胞生存能力和一个增强的活动还存在与2.5毫米MPP + 24小时孵化后(图1)。打破了发达的神经突净(见箭头在图1(一));细胞呈现改变形态更圆,甚至一些细胞脱离塑料的支持。神经毒素对这些细胞的细胞毒性效应与AlamarBlue化验测试,显示细胞生存能力明显降低(38%),与nonstimulated细胞(图1 (b))。细胞分裂素肽,BK以及DAKD浓度越高(1μ米)导致了轻微的,无关紧要的减少细胞的生存能力(10%),而在低浓度(1纳米)观察细胞没有毒性(结果未显示)。细胞治疗和BK DAKD在1μ米决赛浓度更容易MPP +行动。在这种情况下,细胞生存能力明显下降(ca。50%)后神经毒素刺激。同样的,有意义的半胱天冬酶活动的变化观察MPP +刺激后,没有和BK或DAKD治疗(数字1 (c)和1 (d)、职责)。激肽肽在1纳米浓度的影响较小(结果未显示);因此,在接下来的实验只使用浓度越高。Neuron-like细胞,刺激神经毒素,表明酶活性增加了100%,相比控制细胞(细胞没有刺激被认为存在100%的基本酶活性)。BK和DAKD造成半胱天冬酶活动只有微不足道的增加(20%和32%,分别地)。然而,这些肽显著影响细胞对MPP +的回应。BK-treated细胞增加了132%而DAKD-treated细胞提供了一个更高的半胱天冬酶活性在MPP + coincubation (156%)。此外,激肽受体拮抗剂的使用,锄头和desHOE产生逆效应,表明激肽受体的直接参与。孵化的细胞与这些物质引起的抑制BK - DAKD-induced半胱天冬酶活动,但并不影响显著MPP +行动。
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3.2。影响细胞分裂素肽和MPP + Neuron-Like细胞的氧化应激
氧化过程的变化,细胞分裂素肽与荧光技术进行评估。细胞内活性氧的生产取决于激活时间与细胞分裂素肽和神经毒素刺激。所有实验研究同时显示时间的影响在神经细胞模型和在帕金森病细胞模型。肽引起的结果给出百分比变化值相比与MPP +细胞没有或刺激,治疗与细胞分裂素肽(数字2(一个)和2 (b)、职责)。令人惊讶的是,细胞与细胞分裂素治疗的反应和MPP +比这更大的(高达8倍)的细胞只有激肽肽治疗。Neuron-like细胞显示快速反应,特别是BK。BK的ROS水平略有增加(40%)后30秒观察而DAKD效应(增强ROS生产50%)出现后(2分钟后)。进一步孵化显示趋势的ROS水平降低甚至低于控制细胞中发现的基础水平。然而,10分钟后孵化细胞实现类似于未经处理的细胞,观察到的水平。在细胞的情况下PD模型(此外,孵化了细胞与MPP +)细胞分裂素肽对活性氧的影响生产强和延迟。最大活性氧释放肽5分钟后观察和增加会于长滩举行8倍,相比之下,只与MPP +细胞治疗。增加ROS水平在很大程度上保留了特别是在DAKD激活,实现价值观类似于控制细胞从刺激开始15分钟后。
(一)
(b)
激肽肽的影响在neuron-like细胞氧化应激也估计通过测量伊诺mRNA表达和释放的细胞。伊诺mRNA表达明显升高DAKD和MPP +(图3(一个))。DAKD效应最高,显示mRNA的表达会增加2倍,而MPP +和BK造成mRNA表达的增加75%和40%,分别。应该指出,这种影响是时间;激肽肽增强mRNA的表达伊诺迅速(30分钟),而最大响应4小时孵化后出现神经毒素。没有释放neuron-like细胞与BK刺激后,DAKD和MPP +提出了数字3 (b)和3 (c)。BK检测效果不显著而DAKD导致显著增加(60%)30分钟后孵化。MPP +引起更高的没有发布,80%和100%,15分钟和30分钟的孵化后,这个效果是显著增强的DAKD但不是BK。同时激活与MPP + DAKD导致没有代谢物增加了50%,相比与MPP +单独治疗。
(一)
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(c)
3.3。炎症反应的PD激肽肽细胞模型
BK的能力和DAKD neuron-like细胞诱导细胞因子表达式分析了实时PCR和ELISA技术(图4)。增加了TNF - mRNA的表达α,il - 1β30分钟后,il - 6是注册与肽孵化。TNF -均获得最高的价值α信使rna表达与BK和DAKD 30分钟的刺激后,显示在25倍增加相比nonstimulated细胞(图4(一))。MPP +诱导的肿瘤坏死因子的影响α信使rna在细胞更温和,但意义重大,显示增加了14倍。此外,神经毒素的最大反应4小时孵化后注册。对肿瘤坏死因子的影响α蛋白质释放细胞与肽和MPP +孵化后很快,6小时后蛋白质产量提高了25%,38%,和23%,分别为BK, DAKD, MPP +,而未经处理的细胞(数字4 (b)和4 (c))。此外,TNF -略有增加α观察蛋白质在细胞治疗与细胞分裂素肽刺激神经毒素;这种蛋白质的数量是20%大于单独与MPP +细胞的刺激。在il - 1的情况下β激肽肽(BK DAKD)和MPP +引起相当大的mRNA表达增加,4 - 7 -,和2倍(图4 (d))。最大mRNA表达观察后30分钟的刺激和BK DAKD 4小时后神经毒素孵化。然而,il - 1β引起的蛋白质释放24小时后仅略激肽肽(1.5倍和2倍BK, DAKD resp)。而明显高于神经毒素影响,大约三倍(数字4 (e)和4 (f))。尽管如此,BK的协同效应或DAKD MPP + il - 1β释放被观察到。上层清液中蛋白质的数量高于单从细胞与神经毒素孵化(54%和72% BK / MPP +和DAKD / MPP +,职责)。此外,il - 6 mRNA的表达,诱导BK和DAKD相对较低(三倍和2倍,resp),尽管这些变化是重要的相比nonstimulated细胞(图4 (g))。MPP +引起轻微但显著增强il - 6的增量mRNA(1.7倍)。激肽肽引起的蛋白质释放也显著(160%和190%和BK DAKD治疗,resp)和MPP +(超过3.5倍)(数据4 (h)和4(我))。类似的其他细胞因子,同时细胞治疗与细胞分裂素肽和MPP +也导致一种改进蛋白质生产(约420%,而未经处理的细胞)。样品处理拮抗剂抑制细胞因子的生产蛋白质,证明增量通过BK和DAKD MPP +的存在是由于激肽受体的激活。
(一)
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(我)
3.4。神经毒素MPP +的影响多巴胺受体2和激肽受体的表达
MPP +的影响受体的表达neuron-like细胞在基因和蛋白质含量进行了分析。MPP + D2R mRNA表达的明确降低(图5)。重大变化时4小时后观察孵化D2R mRNA的数量下降了40%(图5(一个))。这些观察结果是符合这种受体的蛋白表达(图5小时后下降到37%5 (b)和5 (c))。另一方面,激肽受体的表达也受到毒素的影响。信使rna表达的诱导B1R无可置否的MPP +(图6(一))。显著增加mRNA表达与控制细胞(200%)观察到后一个小时。这些变化进一步的3个小时,后被保存在一个较低的但仍显著水平。同样,B1R蛋白在细胞膜增强,导致以上2倍增加五个小时后(数字6 (b)和6 (c))。相反,B2受体的表达在神经元细胞毒素治疗后(图显示下降趋势7)。略微减少4小时后观察B2R mRNA(20%),但它并没有显著比控制细胞(图7(一))。然而,减少B2R neuron-like细胞蛋白质MPP +刺激后观察到的(5小时后达到最大减少25%)是重要的未经处理的细胞(数据相比7 (b)和7 (c))。
(一)
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3.5。细胞分裂素肽的影响多巴胺受体2的表达
D2R mRNA和蛋白表达水平进行了分析与细胞分裂素肽刺激后在不同的时间间隔。主要细胞孵化和BK DAKD减少D2R mRNA(图引起的8)。然而,这种效果是明显越来越重要在DAKD刺激(图8 (b))。BK诱导减少mRNA(超过60%),但只有在3小时孵化(图8(一个)),而DAKD取得类似的效果更快,刚过30分钟的孵化。在蛋白质水平,细胞反应激肽肽可比(数字8 (c)- - - - - -8 (e))。immunofluorescent技术获得的定量分析的图片显示D2R表达细胞的显著减少。D2R蛋白量的变化观察3小时后BK刺激(20%)和后1 - 3小时DAKD刺激(20%和32%,分别地)。
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(e)
4所示。讨论
有组织的中枢神经系统,通过炎症介质的产生,可能导致神经退行性流程的规定(23)煽动这些流程的复议的知名与炎症相关的细胞过程。细胞分裂素和其生产所需的组件是大量存在于神经组织(11,12,24]。这些物质与炎症反应的增强作用有关神经组织(25]。因此,很可能这些肽增强炎症反应可能导致神经元变性。因此,在这项研究中,我们分析了影响的主要激肽肽,BK DAKD,颁布的神经退行性PD的过程在细胞模型。为了这个目的,一个受欢迎的细胞模型与人类神经母细胞瘤细胞系(SK-N-SH)分化成neuron-like细胞与RA (20.]。这些细胞的凋亡状态与MPP +神经毒素治疗后取得。使用这种物质作为proapoptotic因子在细胞和动物PD模型经常被报道(26,27]。这一研究获得的PD模型显示显著减少细胞生存能力,神经突的损失和(图的半胱天冬酶活性增加1)。在这个模型的帮助下可以欣赏激肽肽对细胞凋亡的影响。无论是BK,或者只靠DAKD并影响显著neuron-like细胞的可行性。然而,细胞死亡时显著增强细胞治疗与这些肽在MPP +孵化之前,建议更好的倾向在组织丰富的细胞分裂素肽神经退化。此外,细胞分裂素肽也能够通过激活触发凋亡过程还存在的帕金森病细胞模型。尽管略有微不足道的增加细胞凋亡蛋白酶活化BK和DAKD 3/7,这些肽有助于增强全身的MPP +酶活性。半胱天冬酶3和半胱天冬酶7,刽子手酶,一旦激活,可以加速一个反馈回路的半胱天冬酶激活导致细胞死亡(28]。这一研究获得的结果认为赞成proapoptotic影响肽,BK和活性代谢物DAKD PD的细胞模型。然而,不同的角色B2R B1R已经提出了有机磷(引起的神经细胞凋亡29日]。作者表明,B1R能促进细胞损伤而B2R neurotoxin-induced毒性期间可能产生一种保护作用。BK的神经保护作用对NMDA-mediated会也建议(30.]。然而,在我们的研究中,BK-induced影响半胱天冬酶活动的增加在MPP +治疗细胞表达下调了B2R特定拮抗剂(锄),显示(图BK-induced的反演效果1 (c))。应该强调,使用缓激肽的浓度非常高,通常视为病理(31日]。因此,观察到的影响可能发生在活的有机体内只有在神经激肽肽都有大量的组织。
应该注意的是,在这些实验细胞治疗与BK长时间神经毒素刺激。病理的激肽肽可以刺激ROS生产和细胞因子的合成,甚至在神经组织(24,31日]。事实上,我们可以观察到不同的影响引起的活性氧的生产BK和DAKD PD细胞模型相比,诱导神经细胞(图的影响2)。在后一种情况下,ROS生产立即激肽和这种影响很快逆转而引起的PD模型中的这些缩氨酸引起更强烈和更长的效果。在这种背景下,我们的研究结果的区别和描述BK细胞凋亡的保护作用也可以归因于不同的细胞毒素刺激后反应。长时间曝光的神经组织病理的汉堡王可以使这些细胞更容易神经毒素。
没有在中枢神经系统的水平是由相关的酶,神经没有合酶,而表达的诱导形成(间接宾语)不是(32]。然而,在病理情况下的表达这种酶升高。事实上,氧化应激的中介,通过活性氧和活性氮物种如不,在细胞凋亡与线粒体损伤(33]。此外,急性和慢性氧化应激可能参与多种神经退行性疾病,包括帕金森病(32]。实验的PD模型显示增强伊诺表达增加没有释放。因此,我们使用MPP + PD模型也显示增加伊诺mRNA的表达明显没有生产(图3)。然而,我们的结果表明仅稍有增加伊诺信使rna诱导在neuron-like BK细胞,没有生产(图3)。此外,BK无法诱导帕金森病细胞模型中还没有释放。因此,观察到BK-induced减少细胞生存能力和半胱天冬酶活动增加不能明确分配给氧化压力的放松管制。也许,BK细胞可以激活不同的途径参与细胞凋亡,包括那些与炎症反应有关。
炎症反应在我们的帕金森病细胞模型的研究可以提供一个假设在汉堡王的行动。有新兴的证据表明,炎症过程涉及小胶质细胞和星形胶质细胞可以调节神经退化,包括在帕金森病2,3,23]。然而,在这项研究中我们证明了神经细胞也可能对外源性刺激与促炎的分子的重要生产。实际上,激肽肽以及神经毒素释放肿瘤坏死因子- MPP +引起的高α,il - 1β和il - 6(图4)。此外,同时治疗的细胞与MPP +肽增强细胞因子的生产。BK唤起高生产的TNF -α,il - 1β至关重要的细胞因子,il - 6,炎症反应在神经组织的发展34,35]。因此,我们可以认为BK-induced细胞因子,特别是TNF -α,由神经元可以促进炎症过程,导致细胞死亡在我们PD细胞模型。这种假设是在协议与获得的观测研究中使用转基因小鼠缺乏TNF -α受体;动物是完全防止MPP +的神经毒性36]。
DAKD其他肽,能够诱导增强伊诺mRNA表达neuron-like细胞ROS,还导致生产过剩和不,这可能导致非本征氧化应激通路开始,特别是在外生MPP +(图的存在3)。像汉堡王,这种肽也导致neuron-like释放大量细胞因子的细胞,以及帕金森病细胞模型(图4)。因此,我们的观察主张激肽肽的中介,特别是B1R受体激动剂,在变性过程中发生在帕金森病细胞模型通过增加氧化反应和长期的炎症过程。
多巴胺受体2 (D2R)在帕金森病中起着重要的作用。增加D2R表达报道治疗PD患者(37]。然而,受体激动剂受体密度和绑定潜力逐渐减少在疾病进展。两种类型的D2受体的存在已经报道(37,38]。长同种型不同于短类型的29个额外的氨基酸在第三胞内循环。这些受体具有不同的功能:与突触后受体作用的时间越长,在合作与多巴胺受体1型调节多巴胺反应产生运动激活。另一方面,较短的同种型存在,主要在presynapses充当自受体,调节多巴胺分泌的多巴胺能神经元(38]。在这里,我们报告D2R表达的减少MPP +和表明,这些受体的损失意味着神经退化。事实上,保护作用对MPP +的D2受体已经被报道果蝇主要神经细胞(39]。似乎在退化过程的早期阶段D2受体亚型对神经保护很重要。突触后D2R的缺乏可能导致神经组织退化由于多巴胺能通路的干扰。反过来,D2受体的损失也能导致细胞变性因为多巴胺生产和释放是摄动的规定,导致他们的单胺氧化酶氧化,可能触发增强细胞内氧化还原过程(40]。因此,观察到的低表达D2R MPP +引起的信使rna和蛋白质证实这些报告,证明我们的细胞模型能反映神经退行性PD中描述的特性。
解释激肽行动在帕金森病细胞模型中,其特定受体的表达进行了分析后MPP +刺激。没有c端精氨酸残基的细胞分裂素及其代谢产物(des-Arg激肽)是公认的两种受体,B1R和B2R13]。第一种受体最好结合des-Arg激肽肽,而B2R主要识别BK和胰激肽。B2R无处不在在许多类型的细胞,在许多生理过程中起着举足轻重的作用B1R主要是由特定的刺激在病理障碍。两种受体类型也可能参与炎症过程。B2受体在急性炎症中扮演一个重要的角色B1R相当与慢性炎症有关。这项研究显示了一个大幅增加B1R mRNA表达是翻译成蛋白质(图6)。因此,增强MPP +引起神经细胞的炎症过程也与功能相关的受体。激活后,它可以传播过程导致细胞变性。有趣的是,在MPP +的影响的情况下在B2R表达式,结果尚不清楚。信使rna表达的受体被MPP +(图没有改变7)。然而,稍微减少B2R蛋白质毒素刺激后观察。这些结果可以表明,在D2R, B2受体发挥重要作用在防止MPP +。事实上,中介通过B2R BK的神经保护最近提出(30.]。然而,B2R的表达不太容易改变;这种受体激动剂后绑定和内部化可以回收利用细胞表面(13]。另外,汉堡王可以转化成des-Arg代谢物羧肽酶,存在于不同的组织,包括大脑(6,41]。此外,汉堡王也能诱导细胞膜B1R表情(42]。因此,观察到BK细胞生存能力和半胱天冬酶活动的部分可以与他们相关的转换des-Arg代谢物,直接引发炎症和氧化还原反应导致神经退化。
最后,观察有关减少D2R表达的细胞分裂素肽(图8)可能证实一个假设这些肽在神经退化过程的中介与帕金森病有关。的主要影响是观察DAKD, B1R受体激动剂。这些观察,再加上那些从MPP +的影响获得B1R表达,允许我们属性发展的一个主要角色PD des-Arg肽。BK的影响也可以归因于des-Arg缓激肽的形成,因为在这些实验kininase抑制剂没有使用。然而,BK在神经退化的作用目前还不是很清楚,这需要额外的问题,更深刻的研究。
5。结论
在这项研究中,我们检测了细胞分裂素肽对炎症和氧化反应的影响帕金森病细胞模型。细胞分裂素及其代谢产物不精氨酸残基糖基能够诱导显著释放活性氧和促炎细胞因子的变化。这些变化都伴随着加剧凋亡过程。诱导表达的B1R MPP +也可能导致炎症反应的增强作用。反过来,这也会增强细胞死亡过程。更丰富的细胞分裂素肽神经组织,由神经元和星形胶质细胞和小胶质细胞,促进神经组织的变性神经炎症。激肽受体可能是关键的中介提供新的可能性的发展有效的通过他们的受体激动剂/拮抗剂疗法对神经退化。
缩写
| B1R: | 激肽受体1 |
| B2R: | 激肽受体2 |
| 汉堡王: | 缓激肽 |
| DAKD: | des-Arg10胰激肽 |
| 丹: | 2,3-Diaminonaphthalene |
| DCFH2-DA: | 2,7-Dichlorodihydrofluorescein二乙酸 |
| desHOE: | des-Arg10-Icatibant |
| D2R: | 多巴胺受体2 |
| EF-2: | 延长因子2 |
| 锄: | Icatibant |
| il - 1β: | Interleukin-1β |
| il - 6: | 白细胞介素- 6 |
| 伊诺: | 诱导没有合酶 |
| MGTA: | 2-Mercaptomethyl-3-guanidinoethylthiopropanoic酸 |
| MPP +: | 1-Methyl-4-phenylpyridinium |
| 帕金森病: | 帕金森病 |
| 类风湿性关节炎: | 视黄酸 |
| ROS: | 活性氧 |
| 肿瘤坏死因子-α: | 肿瘤坏死因子-α。 |
相互竞争的利益
作者宣称没有利益冲突有关这篇文章的内容。
确认
学院生物化学、生物物理学和生物技术大学的克拉科夫是一个领先的国家研究中心的合作伙伴(知道)科技部支持的高等教育,波兰。