文摘

背景。氧化应激与不孕症有关。这个研究来确定谷氨酸和天冬氨酸的影响血清抗氧化酵素,性激素,生殖器炎症在公猪遭受氧化应激。方法。野猪被随机分为4组:nonchallenged控制(CON)和H₂O₂挑战控制(BD)基础饲料组与2%丙氨酸补充;美联储其他两组基底饮食补充2%的天冬氨酸谷氨酸(GLU)或2% (ASP)。GLU, BD和ASP组注射了过氧化氢(H₂O₂在15天)。CON组注射0.9%氯化钠溶液在同一天。结果。膳食天冬氨酸减少丙二醛(MDA)水平血清(与双相障碍组相比)。此外,天冬氨酸维持血清促黄体激素(LH)在一个相对稳定的水平。此外,谷氨酸和天冬氨酸转化生长因子-增加β1 (TGF -β1)和白细胞介素- 10”(il - 10)水平在附睾和睾丸(与双相障碍组相比)。结论。谷氨酸和天冬氨酸促进氧化应激后生殖器mRNA的表达抗炎因子。天冬氨酸更有效地降低血清MDA和阻止H后血清性激素的波动₂O₂挑战比谷氨酸。

1。介绍

人工授精已被证明是一个成功的繁殖管理方法来提高畜牧业生产效率。人工授精促进使用high-genetic-merit公猪对人工授精一群母猪(1]。因此,公猪繁殖能力可以提高效率高的重要遗传效应(2]。

然而,许多风险因素可能导致公猪生殖功能障碍,如恶劣的环境和精神压力和疾病(3- - - - - -6]。累积的证据表明,整个身体氧化应激(OS)是所有这些危险因素相关。氧化与抗氧化作用失衡,海拔活性氧(ROS)被认为导致性发育成熟的有缺陷的精子发生和精子功能障碍野猪(7]。大约25%的不育男性表现出高水平的精液活性氧,而肥沃的男人没有8]。在哺乳动物中,spermatozoal膜有许多多不饱和脂肪酸(欧米伽)和活性氧攻击敏感,它可以破坏细胞膜和形态的完整性,影响细胞功能,促进精子细胞凋亡和损害精子的运动性(7]。此外,大多数不育男性已被证明患有急性或慢性泌尿生殖系统的炎症(9]。细胞因子和活性氧可能在调节炎症的毒性作用(交互10]。之前的报告发现,精液活性氧生成之间的正相关和精浆促炎细胞因子,如interleukin-8(引发)、白细胞介素- 6 (il - 6)、肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)[11]。持续炎症/氧化环境会破坏健康的细胞,这可能会导致不孕,造成经济损失。根据这些因素,一个策略来减少氧化应激和生殖器炎症在野猪是必需的。

近年来,许多抗氧化疗法被用来提高生殖能力(12- - - - - -14]。这些化合物可以直接和间接地影响ROS浓度的调节过程(15- - - - - -17]。作为动物的营养补充剂,谷氨酸和天冬氨酸被发现具有抗氧化活性。膳食补充2%谷氨酸增强抗氧化系统和改善体重在小猪杀挑战[18),这意味着它可以改善急性氧化应激造成的损害。此外,谷氨酸调节体重(19),调节荷尔蒙的释放(20.和脂质代谢21],和改善胃肠道吸收[22]。与天冬氨酸盐膳食补充剂量的0.5 - -1%恢复肠道屏障,改善肝脏的新陈代谢,增强能源地位与脂多糖(小猪的挑战23,24]。这些影响可能是由于其贡献三羧酸循环和ATP的产生25]。由于谷氨酸和天冬氨酸有益健康和抗氧化作用,他们可以保护野猪患有急性氧化应激。因此,我们评估的影响谷氨酸和天冬氨酸补充抗氧化的酶和生殖系统的公猪的条件下急性氧化应激。过氧化氢(H₂O₂)介绍了建立氧化应激模型26]。

2。材料和方法

2.1。实验设计

十六大的白野猪(6个月大的时候,公斤BW)被安置在个体代谢笼配备乳头饮酒者和给料机在房间里,和温度维持在25°C。野猪都是美联储基底的饮食(表1),这是制定满足6个月大的野猪的营养需求根据NRC(1998), 5天。然后,他们被分为4组进行不同的治疗方法:(1)nonchallenged控制(CON,基底饮食+ 2%丙氨酸,saline-challenged);(2)H₂O₂挑战控制(BD,基底饮食+ 2%丙氨酸,H₂O₂挑战);(3)H₂O₂治疗+ 2%谷氨酸(GLU、基底谷氨酸饮食+ 2%,H₂O₂挑战);和(4)H₂O₂天冬氨酸治疗+ 2%(天冬氨酸ASP,基底饮食+ 2%,H₂O₂挑战)。三个饮食准备由丙氨酸引入isonitrogenous基底的饮食。所有组与单个腹腔内注射治疗(i.p) 10%的H₂O₂(1毫升/公斤体重)15天,除了诈骗集团被注射同样体积的0.9%氯化钠溶液。H的用量₂O₂在这项研究中的应用是基于一项研究[26]。氨基酸(纯度> 99%)用于本研究从北京购买Chemclin生物技术有限公司有限公司(中国,北京)。其他化学物质是化学试剂购自国药控股有限公司有限公司(中国,北京)。

2.2。样品收集

野猪都使用戊巴比妥钠麻醉,然后在22天死于颈静脉穿刺。血液、睾丸和附睾样本收集。本研究根据赫尔辛基宣言和批准执行的实验动物保健中科院亚热带农业研究所的顾问委员会,中国科学院(31日]。颈静脉的血液收集公猪。血清样本的血液样本由离心2000 rpm(或500×g)在4°C为10分钟,然后储存在−80°C到使用。屠宰后睾丸和附睾重量,和器官系数计算如下32]:器官系数(%)=器官重量/体重的野猪×100%。一小部分的睾丸和附睾立即被冻结在液氮和维护−80°C的后续分析基因的表达。

2.3。测量血清中特定的酶和激素

浓度血清超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(氧化酶)和丙二醛(MDA)分析确定血清抗氧化能力。他们用的包从南京建成生物工程研究所(南京,中国)33]。包从北京北方生物技术研究所(中国,北京)被用来确定血清生殖激素的浓度,如促卵泡激素(FSH),促黄体激素(LH)、睾酮(T2) [34]。

2.4。RNA提取和互补脱氧核糖核酸的合成

总从液体mRNA nitrogen-pulverized睾丸和附睾使用试剂盒提取试剂(美国英杰公司)根据制造商的建议(35]。琼脂糖凝胶电泳证实了RNA完整性。RNA浓度测定通过测量吸光度在分光光度计(260海里36]。进行反转录RNA样本使用PrimeScript 2毫克™RT试剂盒(豆类)根据制造商的指示。互补脱氧核糖核酸合成的PrimeScript 1 st-strand互补脱氧核糖核酸合成装备(豆类、日本)37]。

2.5。信使rna的量化实时PCR分析

引物与引物设计5.0基于cDNA序列的公猪放大目标DNA(表2)。GADPH作为参考基因规范化目标基因转录水平。实时PCR进行总量25μL包含12.5μL SYBR®预混料Taq交货(Tli核糖核酸酶H+),2μL模板(< 100 ng), 1μL的正向和反向引物(10μ米)。PCR协议10分钟在95°C,紧随其后的是40 95°C的周期15秒,60°C 30年代,30年代的72°C。为每个目标基因扩增效率取决于策划的阈值周期(Ct)和日志(初始cDNA)。目标基因表达的相对量化评估方法(36]。

2.6。统计分析

所有使用SigmaPlot 12软件进行统计分析。首先,测试正态分布(Shapiro-Wilk测试)和方差进行相等。如果两个测试是积极的,采用单向方差分析其次是事后图基的测试。值和不同字母明显不同(),而价值观相同的字母不明显不同()。

3所示。结果

3.1。器官系数

最后身体重量和睾丸系数如表所示3。H₂O₂挑战并不影响公猪的体重,但增加了睾丸系数CON组相比,治疗后7天()。然而,饮食和没有谷氨酸和天冬氨酸补充睾丸系数没有显著的影响()。

3.2。血清中MDA含量、SOD和氧化酶

图1表明,H₂O₂政府干扰公猪的氧化和抗氧化的平衡。H后血清中MDA浓度显著增加₂O₂挑战与诈骗集团()。饮食天冬氨酸显著降低血清MDA水平与双相障碍组(),价值是类似的诈骗集团()。饮食谷氨酸稍微降低血清MDA水平,但与双相障碍组(相比没有显著变化)。

腹腔内注射与H₂O₂不影响血清SOD水平,膳食补充剂与谷氨酸和天冬氨酸也几乎没有影响SOD浓度()。BD组的血清氧化酶浓度显著增加H后7天₂O₂挑战与诈骗集团()。膳食补充剂与谷氨酸和天冬氨酸氧化酶水平相比几乎没有影响双相障碍组()。

3.3。血清中性激素

的浓度FSH, LH, T2野猪血清测定,结果如图所示2。H₂O₂挑战对血清FSH几乎没有什么影响,但补充与谷氨酸和天冬氨酸显著降低血清FSH水平与诈骗集团()。与FSH, LH浓度明显高于,和T2水平显著低于BD组比CON组()。饮食天冬氨酸血清LH水平维持在一个稳定的氧化应激水平,和它的价值没有显著差异的诈骗集团()。然而,膳食补充剂与谷氨酸和天冬氨酸显著降低血清T2水平与双相障碍组()。

3.4。在睾丸和附睾炎症基因的表达

相对mRNA的表达(TGF -炎症因素β1、il - 10、il - 6、il - 1β和肿瘤坏死因子-α)在公猪睾丸和附睾后H₂O₂面临的挑战进行了分析。结果(图3)表明,炎症因子(il - 6、il - 1β和肿瘤坏死因子-α)显著调节后的睾丸H₂O₂挑战与诈骗集团。饮食谷氨酸未能降低il - 6和TNF -α表达式在睾丸和附睾与双相障碍组相比,但它明显调节TGF -β1在睾丸和TGF -β1和il - 10在附睾与双相障碍组()。天冬氨酸盐饮食调节TGF -β1的表达在睾丸和附睾中il - 10的表达与双相障碍组()。此外,饮食天冬氨酸盐降低il - 1β和肿瘤坏死因子-α表达式在睾丸与双相障碍组()。

4所示。讨论

ROS是正常的细胞代谢的产物。然而,一旦平衡ROS的生成和抗氧化剂清除活动受到干扰,发生氧化应激(38,39]。许多研究表明,最常见的活性氧,如H₂O₂,ROO^{- - - - - -},哦^{- - - - - -},最终会导致损伤和畸形精子和男性不育(7]。脂类生物分子被认为是最敏感和丰富的精子质膜和其他形式的细胞膜不饱和脂肪酸(欧米伽)40]。活性氧攻击这些欧米,导致脂质过氧化和代MDA升高,已用于监控过氧化损伤的程度(40]。H₂O₂是一个高度活性氧物种。它可以自由分散到线粒体,导致大规模的生成活性氧的水平。腹膜政府10%的H₂O₂(1毫升/公斤体重)导致氧化应激(26]。与先前的研究一致,从图的数据1表明,H₂O₂注射(BD组)血清MDA浓度增加与CON组相比,表明H₂O₂已经成功地诱导系统性氧化应激在公猪。值得注意的是,据报道饮食谷氨酸和天冬氨酸显著减轻氧化应激的小猪H后七天₂O₂或者杀的挑战18,26),长期使用可能会有更好的效果。因此,防止氧化应激,我们喂野猪2%谷氨酸或天冬氨酸H前2%₂O₂挑战。野猪被屠杀和采样H后七天₂O₂挑战确定谷氨酸和天冬氨酸迅速缓解氧化应激在公猪在小猪(26]。

研究谷氨酸和天冬氨酸对公猪在氧化应激的影响,分析了它们对血清性激素的影响,血清抗氧化的酶,和生殖器炎症。激素信号分子。可以运送到遥远的器官通过循环系统调节生理和行为。的生物合成和分泌激素是由其他激素,等离子体的离子浓度或营养,神经元和心理活动,和环境变化41]。激素浓度的变化可以反映体内平衡的状态(42]。睾酮(T2)是一种雄性激素,主要是睾丸中产生。它有一个重要的角色在性和生殖发育43]。T2水平波动影响性欲,精子生产,脂肪分布(43,44),在野猪与整体健康。先前的研究显示,睾丸炎症与T2产量显著下降(45]。在这项研究中,H₂O₂挑战BD组血清T2水平下降的价格相比诈骗集团,和管理的谷氨酸和天冬氨酸未能增加T2水平。结合在睾丸炎症基因分析的结果,我们发现类似的结果表明H₂O₂引起睾丸炎症以及血清中表达下调T2水平。然而,饮食谷氨酸和天冬氨酸对睾丸炎症影响很小。

正常精子形成的过程不仅依赖于T2的睾丸分泌,但也依赖于正常垂体FSH和LH的分泌(46]。在男性,FSH刺激许多下游目标支持细胞影响精子发生。相反,支持细胞由FSH刺激,产生抑制素。这种化合物提供负面反馈的垂体前叶减少FSH的分泌。LH刺激睾丸间质细胞产生T2,提供负面反馈下丘脑垂体前叶和(47]。在这项研究中,一个轻微的波动后血清LH水平观察H₂O₂注入。然而,很难确定这些激素变化的生理意义,因为FSH和LH监管的机制在公猪氧化应激仍不清楚。然而,我们分析了影响谷氨酸或天冬氨酸预防激素紊乱在氧化应激通过比较不同治疗方法对野猪激素浓度的影响。结果表明,天冬氨酸有积极影响血清LH维持在一个相对稳定的水平。

谷氨酸管理可以减轻diquat-induced氧化应激通过增强SOD和T-AOC水平,抑制脂质氧化和MDA生成(18]。然而,几项研究表明,大脑中的谷氨酸积累增加氧化应激(48]。谷氨酸积累还没有报告生成和刺激环鸟苷酸的形成。因此,谷氨酸和ROS似乎复杂的关系(48]。据报道,添加天冬氨酸预防断奶猪的生长抑制LPS后挑战[24]。然而,我们先前的研究发现,天冬氨酸没有管理促进生长性能和显示小影响减轻氧化应激引起的[溴杀18]。在这项研究中,我们发现,天冬氨酸盐能够降低血清MDA水平野猪,而谷氨酸未能缓解H₂O₂全身的氧化应激在公猪。公猪BD组血清氧化酶水平甚至高于那些GLU组。这些差异对氧化应激的影响是否因不同性别和年龄的猪需要进一步调查。

炎症因子参与氧化应激(49]。之前的研究表明,炎症的表现增加氧化应激(49]。相反,炎症细胞也产生许多介质,如花生四烯酸的代谢产物,趋化因子和细胞因子,进一步招募炎症细胞的损伤和产生更多的活性氧(49]。在这种情况下,精浆中含有的抗氧化剂可以防止氧化应激(50]。然而,精浆抗氧化剂无法到达睾丸和精子必须依靠/睾丸附睾的抗氧化剂和保护自己的内在抗氧化能力在精子发生和附睾的存储(51]。谷氨酸和天冬氨酸属于精氨酸的氨基酸,以及脯氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、鸟氨酸、瓜氨酸和精氨酸。他们通过复杂的可互换的interorgan新陈代谢在大多数哺乳动物,包括猪。这两个氨基酸主要是在小肠吸收(52]。然而,肠道粘膜将优先使用其他氨基酸(谷氨酸饮食而不是53]。一旦被肠上皮细胞吸收谷氨酸和天冬氨酸,它们是利用燃料或参与其他氨基酸的合成,如丙氨酸,精氨酸,和其他人,然后进入体循环(26]。值得注意的是,精氨酸影响睾丸组织中的嘌呤代谢的激活腺苷生产、救助途径,ATP再生对男性代谢和生殖功能并显示保护作用[54]。因此,饮食谷氨酸和天冬氨酸盐被认为是有利于提高睾丸防御系统和减少/睾丸附睾的炎症引起的氧化应激。

评估膳食谷氨酸和天冬氨酸的影响在公猪的生殖器炎症,我们确定mRNA表达TGF -β1、il - 10、il - 6、il - 1β和肿瘤坏死因子-α在公猪睾丸和附睾样本。TGF -β1是一个男性生殖功能的关键调节器(55]。睾丸间质细胞的类固醇生成,管周肌肉的组织细胞,影响睾丸的发育和精子发生都是由睾丸TGF -调制β1,它也参与了紧平衡睾丸间质细胞的增殖和凋亡反应(55]。另一个抗炎细胞因子il - 10,在移植过程中发挥作用的单核细胞生产可溶性TNF -α和il - 1β受体拮抗剂(56]。它保护内皮功能急性炎症刺激后通过限制当地增加超氧化物阴离子(57]。在这项研究中,膳食补充剂与谷氨酸和天冬氨酸引起不同程度的upregulation TGF -β1和il - 10在睾丸和附睾mRNA的表达。这些发现表明,谷氨酸和天冬氨酸保护野猪睾丸和附睾炎症通过增加TGF -β1和il - 10的水平。然而,器官系数结果还显示,有轻微肿胀公猪睾丸后H₂O₂挑战,这表明睾丸受到慢性炎症。即使当野猪被喂以谷氨酸或天冬氨酸,肿胀没有被松了一口气。睾丸炎症表示,生产和释放大量的活性氧会引发的免疫反应和刺激分泌大量生物物质(如白细胞),导致增加炎症(9]。因为睾丸和附睾的抗氧化能力是非常重要的在防止氧化应激损伤(7)的数量和活动主要的抗氧化酶,特别是SOD、过氧化氢酶、谷胱甘肽/谷胱甘肽过氧化物酶(氧化酶),睾丸和附睾是非常重要的。睾丸炎症是否在这项研究中我们发现是由于睾丸未能提高抗氧化酶活动需要进一步的研究。

总之,本研究表明,膳食补充剂与谷氨酸和天冬氨酸氧化酶浓度增加SOD和几乎没有影响。他们还未能血清FSH和T2维持在一个稳定的水平。谷氨酸和天冬氨酸都无法减少炎症因子(il - 1的mRNA表达β、il - 10和TNF -α在睾丸和附睾后H₂O₂挑战。然而,谷氨酸和天冬氨酸促进生殖器mRNA的表达(TGF -抗炎的因素β氧化应激后1和il - 10)。天冬氨酸是更有效的比谷氨酸降低MDA水平,防止在野猪血清促黄体激素的波动。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有任何商业或关联利益代表着利益冲突与提交的工作。

作者的贡献

铁军和李Jiming姚明同样贡献了这项工作。

确认

这项工作是由中国国家自然科学基金(没有。31272463也没有。31501965)、国家973项目(2013 cb127301),国家关键技术研究与开发项目(2013 bad21b04)和关键项目(没有长沙科技项目。K1307007-21)。支持作者表达他们的感激之情。