文摘
醛固酮(奥尔多)是极度参与肾脏损伤的发展通过活性氧的产生和炎症。内质网(ER)应力也是诱发Aldo-induced肾损伤。在目前的研究中,我们调查了ER应激的作用在Aldo-infused老鼠inflammation-mediated肾损伤。C57BL / 6 j小鼠被随机分配接受治疗4周如下:车辆注入,注入奥尔多,车辆注入+ tauroursodeoxycholic酸(TUDCA),阿尔多注入+ TUDCA。的影响TUDCA Aldo-infused炎症反应和肾损伤研究使用周期acid-Schiff染色,实时PCR,免疫印迹和ELISA。我们表明,奥尔多导致肾功能受损和抑制ER应激通过TUDCA变弱肾纤维化。这是我表示,减少胶原蛋白,胶原IV,纤连蛋白,TGF -β表达式,表达式的差别以及对这些Nlrp3 inflammasome标记,Nlrp3, ASC, il - 1β和地震。提出了一个重要的角色的ER应激肾脏炎症反应阿尔多。此外,抑制ER应激的TUDCA负调节这些炎症分子的水平在奥尔多的背景下。
1。介绍
醛固酮(奥尔多)会导致慢性管理生产活性氧(ROS),导致内皮功能障碍,肾小球滤过屏障的破坏,蛋白尿和管状损伤和再生,导致慢性肾脏疾病的进展1- - - - - -5]。奥尔多展览这些经典动作结合盐皮质激素受体(MR),蛋白质的核受体家族的成员。此外,先生拮抗剂可以减弱肾损伤通过减少活性氧的水平一代(6]。最近,ROS被确认为发起者和ER应激的主要因素7]。报告显示,内质网(ER)压力促进纤维化的重构通过促进炎症反应8]。通过激活CHOP-mediated ER应激过度可能导致纤维化细胞凋亡和随后的炎症反应和profibrotic细胞因子(9]。ER应激可以引起炎症反应通过感应ASC和Nlrp3 inflammasome [10,11]。这反过来又促进了成熟和促炎细胞因子的分泌,包括il - 1β先天免疫防御和地震,发起,随后导致细胞损伤(12]。的Nlrp3 inflammasome是一个至关重要的事件在肾脏疾病的进展13- - - - - -16),包括单侧输尿管梗阻(UUO) [13),缺血/再灌注损伤(17,18],proteinuric动物模型(19]。在这些模型中,Nlrp3−−/老鼠非常抗肾损伤,可能通过抑制炎症反应。Aldo-driven肾损伤也包括炎症组件涉及il - 1β和il - 6 upregulation。这些影响是由eplerenone减毒的,支持奥尔多封锁在肾脏疾病的保护作用通过抑制炎症因子(20.]。
我们先前的研究已经表明,TUDCA可以改善肾损伤和ER stress-mediated尿毒症心肌病(10]。蒋介石和同事也证明了抑制ER应激TUDCA,一个ER应激抑制剂,防止UUO-induced肾纤维化(21]。总的来说,这些研究表明,抑制ER应激可能是一个可能的治疗靶点对肾纤维化和伤害。然而,分子机制导致的肾脏炎症变化发生在ER应激反应没有详细报道。本研究探讨ER应激的潜在作用Aldo-infused肾脏炎症和纤维化。
2。材料和方法
2.1。动物模型
所有实验进行按照复旦大学医科大学实验动物指南。八周大C57BL / 6 j小鼠权重25和30 g之间购买动物保健复旦大学和研究所的接受了右uninephrectomy与戊巴比妥钠麻醉(50毫克/公斤,IP)。复苏的两周后,所有老鼠饮用水含1%氯化钠和随机治疗4周以下之一:组1,假+ V(0.5%乙醇皮下注射生理盐水车i.p。,);组2、假+ TUDCA(0.5%乙醇皮下注射,250毫克/公斤/ d TUDCA i.p。美国Sigma-Aldrich,);组3,奥尔多+ V(奥尔多0.75μ美国Sigma-Aldrich g / h皮下注射生理盐水,车辆i.p。,);和组4,奥尔多+ TUDCA(奥尔多0.75μg / h皮下注射,250毫克/公斤/ d TUDCA i.p。)[10]。在实验的最后,小鼠麻醉和身体和肾脏重量测定。24小时尿液样本收集后24小时代谢笼驯化期。尿蛋白排泄决心使用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(Exocell)。此外,等离子体是离心机测试肌酐、尿素氮、地震和il - 1β。肾脏样本立即在液态氮冷冻和储存在−80°C。
2.2。肾脏组织病理学分析
肾组织在4%多聚甲醛固定,石蜡嵌入式,切片厚度的3μ米每一节。他们沾染了周期性acid-Schiff (PAS)根据标准协议(22]。从每个老鼠肾脏部分肾小球损伤的严重程度评估使用光学显微镜。然后,肾小球增生性病变的部分被评为等级从0到4如下:0等同于没有扩散,而1 + 2 + 3 + 4 + -25%与1%,26%,-50%,-75%,51%和76%每肾小球节段病变的-100%,分别。
2.3。活性氧的检测
我们发现肾硫代巴比土酸活性物质(TBARS)使用商业套装(开曼化学公司)。此外,我们测量血清丙二醛(MDA)和8-OHdG使用商业套装(建成生物工程研究所)根据制造商的协议。
2.4。定量实时聚合酶链反应
肾脏的总RNA提取使用工具包(Fermentas,格伦小溪,医学博士,美国)根据制造商的协议。实时PCR扩增都使用了SYBR绿色主人混合(美国ABI)和棱镜7300实时PCR检测系统(应用生物系统公司)。寡核苷酸序列提供了表达载体和引物对表1(10]。mRNA的表达水平被减去相应的规范化GAPDH作为控制和计算通过使用比较循环阈值方法。
2.5。西方墨点法和ELISA
肾组织均质,离心后的上层清液收集在4°C 12000×g 20分钟(23]。我们分离溶解产物10%聚丙烯酰胺凝胶之前使用anti-Nlrp3免疫印迹(AdipoGen公司,圣地亚哥,CA) anti-ASC (AdipoGen公司,圣地亚哥,CA) anti-CHOP(细胞信号技术,美国),anti-caspase-12(细胞信号技术,美国),anti-IL-1β美国生物科学(亲和力),anti-IL-18(美国亲和力生物科学)抗体的稀释1:500。切的表达水平,caspase-12, ASC Nlrp3, il - 1β,分析了地震-使用ECL推进系统(Amersham,小都,英国)。相关的蛋白表达水平取决于标准化β肌动蛋白。血清il - 1β和测量地震- ELISA试剂盒(RayBiotech诺GA)根据制造商的指示。
2.6。统计分析
结果表示为意味着±标准平均误差(SEM)。单向方差分析是用来比较平均值,和一个值决心是显著的。
3所示。结果
3.1。在小鼠Aldo-Infused TUDCA对肾功能的影响
肾损害评估PAS染色,血清肌酐、白蛋白/肌酐和面包。如图1Aldo-infused老鼠显示明显系膜区扩大和肾小球硬化症()相比假+ V组(肾小球损伤分数:)。然而,治疗TUDCA明显减轻肾损伤和减少了肾小球损伤评分()。符合这一发现PAS染色,包子和白蛋白/肌酐水平也显著增加小鼠阿尔多+ V (mg / dL和老鼠、职责)相比,假+ V (mg / dL和、职责)。包子和白蛋白/肌酐水平明显减少奥尔多+ TUDCA老鼠(mg / dL和、职责)相对于奥尔多+ V老鼠。Aldo-infused老鼠的肌酐浓度较高()相比,假+ V老鼠(),以及治疗与Aldo-treated TUDCA降低肌酐的水平组()(表2)。
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3.2。TUDCA对肾纤维化的影响
与假+ V老鼠相比,奥尔多+ V组表现出显著增加mRNA水平。纤连蛋白mRNA水平,转化生长因子-β(TGF -β),胶原蛋白,胶原IV奥尔多+ V组显著增加(2.7倍、3.0倍、2.3倍和3.2倍,分别地)相比,假+ V老鼠。此外,TUDCA治疗显著降低纤连蛋白的mRNA水平,TGF -β第四,胶原蛋白,胶原蛋白和奥尔多+ V相比,老鼠(图2)。
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3.3。TUDCA对肾脏的影响ROS
ROS生产指标,包括MDA (),8-OHdG ()和TBARS (),显著增加在奥尔多+ V组相比,假+ V组(,,)。相比之下,治疗TUDCA显著减毒Aldo-induced MDA水平升高,8-OHdG和TBARS(图3)。
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3.4。TUDCA对ER应激的影响凋亡途径在小鼠肾脏
GRP 78和GRP 94 ER应激标记监管者ER功能至关重要。GRP78的表达(4.2倍)和GRP94(3.9倍)显著增加小鼠肾脏的奥尔多+ V老鼠相对于假+ V老鼠。然而,TUDCA治疗减少GRP 78年和94年GRP的水平显著(图4)。激活ER应激可以通过caspase-12无常启动细胞凋亡通路。切(3.4倍)和caspase-12水平(2.8倍)显著增加奥尔多+ V组相比,假+ V老鼠。此外,TUDCA治疗减少caspase-12无常的水平相当(图4)。这说明caspase-12无常信号的重要作用Aldo-driven肾损伤。
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3.5。影响的TUDCA Nlrp3 Inflammasome激活肾脏
实时PCR分析表明mRNA的表达Nlrp3 inflammasome-related基因,包括il - 1β(4.6倍)和地震(4.1倍),显著增加了肾脏的奥尔多+ V老鼠相对于假+ V老鼠。TUDCA治疗显著降低il - 1的水平β和地震(图5)。同样,血清il - 1的水平β()和地震(在奥尔多+ V)显著增加小鼠相比,假+ V老鼠(和、职责),而il - 1的水平β和奥尔多的地震明显减少+ TUDCA老鼠。自激活Nlrp3 ASC蛋白质引起促炎细胞因子的随后的成熟,成熟的il - 1的蛋白水平β和地震测量小鼠肾脏的免疫印迹。il - 1的蛋白水平β(4.5倍)和地震(5.6倍)高奥尔多+ V老鼠假+ V组相比,虽然TUDCA减少Aldo-infused小鼠细胞因子。同样,Nlrp3(3.4倍)和ASC(5.2倍)蛋白表达也增加了奥尔多+ V组较假+ V组。TUDCA治疗能够显著减少这些蛋白质含量在奥尔多+ V老鼠(图6)。
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4所示。讨论
本研究表明,活性氧、ER应激和肾Nlrp3 inflammasome Aldo-infused老鼠增加。此外,TUDCA治疗,一个ER应激抑制剂,以防止Nlrp3 inflammasome激活及其相关细胞因子。这表明TUDCA可能改善Aldo-infused通过抑制肾损伤的激活NLRP3 inflammasome。
ROS生产过剩一直与各种肾损伤模型,包括糖尿病肾病、局灶性节段性肾小球硬化症、膜性肾病(24]。一些报告表明,过度的奥尔多在动物模型与系膜细胞和足细胞损伤,由于活性氧激活(24,25]。以前的研究也表明,活性氧过剩导致氧化应激和触发器redox-sensitive细胞信号级联,引起炎症反应,线粒体功能障碍,纤维发生。此外,抗氧化剂和自由基食腐动物部分改善proapoptotic奥尔多的结果(26]。ROS也被确定为一个潜在的触发的Nlrp3 inflammasome在足细胞13]。因此,这些结果表明,活性氧可能参与激活的inflammasome Aldo-driven肾损伤(13,27- - - - - -30.]。目前的研究表明,ROS标记被激活后Aldo-infused肾损伤。氧化应激是已知的ER应激诱导物。氧化剂压力扰乱了体内平衡和激活内质网压力的肾脏和与Aldo-driven肾损伤有关。尽管ROS和ER应激之间的详细机制Aldo-induced炎症仍然未知,这些发现提供重要的见解奥尔多的肾损伤的反应。
越来越多的证据表明,ER压力和Nlrp3 inflammasome激活多种肾脏疾病是重要的致病因素(2,16- - - - - -18]。先前的研究也报道,ER应激蛋白的水平在人类和实验动物模型有显著调节后,奥尔多治疗(31日,32]。切,一个ER应激激活标记,通常是在低水平表达,强劲激活各种器官的一部分自然的压力反应。目前的研究表明,奥尔多接触大大增加切表达式。然而,如何ER应激导致Aldo-evoked肾损伤仍是未知的。先前的报道表明,ER-induced肾损伤能诱导自噬(7,31日]。然而,这发生的确切机制并不确定。此外,激活自噬在动物实验中表现出局部ER应激性肾损伤,表明自噬不是纤维化的独特路径。
似乎是一个重要的炎症破坏性过程介导损伤肾脏。阻力指标炎症和纤维化也许可以适度已被证明是通过介导的Nlrp3 inflammasome激活的Nlrp3 mRNA和蛋白水平升高和ASC [33]。奥尔多能够促进炎症细胞的启动和维护进入血管壁促进平滑肌细胞增殖,减少内皮功能。这反过来加速动脉粥样硬化的发展和促进组织损伤的进展34- - - - - -36]。与先前的研究一致,本研究还表明,Nlrp3 inflammasome Aldo-infused模型中出现的肾损伤。类似于之前的发现,蛋白质含量的增加Nlrp3 ASC和成熟的地震和il - 1的激活β被观察到。综上所述,这些结果表明,Nlrp3 inflammasome可能导致Aldo-induced肾损伤。TUDCA明显减毒治疗肾脏疾病和降低Nlrp3 inflammasome激活,表明Nlrp3 inflammasome可能ER应激通路的下游Aldo-induced肾病。
通过增加长期ER应激导致纤维化炎症反应和profibrotic细胞因子的生成36]。此外,激活免疫细胞的ER应激诱导促炎细胞因子的生产。ER应激也识别中发挥重要作用诱导炎症和释放TGF -β细胞凋亡(CHOP-mediated激活的9]。
我们之前证明TUDCA显著改善肾功能和尿毒症心肌病通过抑制ER应激通路(10]。方等。37)表明,蛋白尿诱导inflammasome激活通过肾近端小管细胞ER应激信号。目前的研究表明,TUDCA缓解ER应激反应由奥尔多在肾损伤。治疗TUDCA降低ER应激蛋白GRP78、GRP94,排骨,caspase-12。此外,TUDCA通过下调ASC和NLRP3缓解炎症引起的损伤。挡住了ER应激通路可以抑制Aldo-driven地震和il - 1的生产β。上述结果表明,奥尔多可能激活Nlrp3 inflammasome通过ER应激反应,表明重要的ER应激通路之间的串扰和Nlrp3 inflammasome激活Aldo-induced肾损伤。这些数据提供了间接的证据支持的病理作用Nlrp3 inflammasome奥尔多引起的肾损伤。进一步在体外研究是必要的来识别可能的ER应激参与Aldo-driven Nlrp3 inflammasome。
在结论,本研究提出了一个重要的角色的ER应激肾脏炎症,奥尔多的反应,ER应激抑制剂在炎症改善肾纤维化的背景下。ER应激的抑制,以及Nlrp3 ASC,表明冗余炎症通路参与Aldo-induced慢性肾脏疾病。此外,治疗TUDCA明显变弱Nlrp3 inflammasome,表明ER应激通路可能调解Nlrp3 inflammasome激活Aldo-infused肾损伤。
相互竞争的利益
作者宣称没有利益冲突。
确认
这项工作是支持由中国国家自然科学基金(81300590,81300590,81570661)。