文摘

肠外补充谷氨酰胺在急性炎症条件是有争议的。我们评估了炎症反应和生存在钠肠外谷氨酰胺灌注后taurocholate-induced急性胰腺炎(AP)模型。刘易斯老鼠收到1克/公斤肠外谷氨酰胺()、盐(),或没有治疗(美联社感应之前)48 h。血、肺、肝脏样本收集2,美联社12,24小时后测量血清细胞因子水平和组织热休克蛋白(HSP)表达式。从每组20动物没有牺牲在美联社7天死亡率的研究。血清细胞因子水平在任何时间点没有组间差异,但随着时间的推移,社会团体内部的分析显示更高的干扰素-只在2 h:与生理盐水组(对12和24小时;这两个)。谷氨酰胺组表现出更大的肺和肝脏一半寿命表达式比2和12 h:小组,分别;更大的肝脏以及HSP70表达比生理盐水组12 h;一半寿命和更小的肺HSP70和肝脏表达比:集团在24 h(所有)。7天死亡率没有组间差异。在实验美联社,预处理与肠外谷氨酰胺是安全的和改进的早期炎性介质资料而不影响死亡率。

1。介绍

谷氨酰胺可以成为重要的在hypercatabolic压力和临界条件下,如严重创伤、脓毒症、炎症疾病,和烧伤(1]。谷氨酰胺是一种燃料来源淋巴细胞、肠上皮细胞谷胱甘肽底物和热休克蛋白(HSP)合成,和潜在的炎性细胞因子释放抑制剂(2,3]。这些生物属性可能有助于改善肠道屏障和淋巴细胞功能和减弱炎症反应(4]。

在危重患者中,补充谷氨酰胺一直建议适当支持细胞增殖率,增加肠道屏障的保护,和炎症功能障碍衰减(5,6]。谷氨酰胺静脉管理会导致其先前的细胞使用和可用性可能是有利的成就快速炎症调制和保护细胞免受损伤在临床急救护理条件。然而,意想不到的有害影响肠外谷氨酰胺的供应,主要在多器官功能衰竭的病人,最近报道(7- - - - - -9]。

这些观察挑战新指南的开发安全补充谷氨酰胺和取得了明显的新的实验研究需要更好地理解这营养的关键疾病中作用的机制。实验性急性胰腺炎(AP)是一种有效的模型研究的系统性反应,可用于测试免疫调节疗法(10]。本研究旨在评价前肠外谷氨酰胺的影响输液对炎性介质水平和死亡率在急性重病的情况下,利用实验AP作为系统性inflammation-reproducing模型。

2。方法

2.1。动物

成年男性同基因的老鼠刘易斯(300 - 350 g)购买的多学科研究中心动物实验室的生物科学(坎皮纳斯,圣保罗,巴西)。实验前,5天的动物适应代谢笼在控制房间温度(°C)与一个12 h光/暗周期和免费获取水和标准啮齿动物食物(Quimtia®;Nutrilav、协会、巴西)。所有实验程序研究伦理委员会批准的医学院大学圣保罗,巴西圣保罗。

2.2。静脉注射访问

动物麻醉的腹腔内注射氯胺酮(Ketamin-S®(+), 100毫克/公斤体重;Cristalia、Itapira、巴西)和甲苯噻嗪(Rompum®, 8毫克/公斤体重;拜耳,巴西圣保罗)。静脉访问是通过颈静脉中心静脉导管(CVC),根据标准技术,紧随其后的是连接到一个旋转装置,使动物有自由流动(11,12]。CVC后,所有的动物都收到0.9%生理盐水灌注24 h。这一时期后,动物被随机分配接受48小时静脉输液6毫升/天0.9%生理盐水(生理盐水组,)或1克/公斤体重二肽alanyl-glutamine (Dipeptiven®20%, Fresenius-Kabi,坏的小礼帽,德国;谷氨酰胺组,),或者没有注入(:集团)。所有的动物都有一个标准的口腔饮食(ain - 93 m)和水在此期间随意。

2.3。实验性急性胰腺炎

72 h静脉访问后,所有的动物都被麻醉的腹腔内注射100毫克/公斤体重的克他命(Ketamin-S (+)®, Cristalia)和8毫克/公斤体重甲苯噻嗪(Rompum®,拜耳)。胰腺是形象化的通过一个腹部切口和胰管乳胶过敏使用24-gauge angicatheter。美联社随后引起逆行注入0.5毫升3%牛磺胆酸盐钠溶液(σ化学,圣路易斯,密苏里州,美国),根据标准技术(13- - - - - -15]。美联社感应后,71只动物被牺牲在适当的麻醉2 h(生理盐水组,;谷氨酰胺组,;:集团),12 h(生理盐水组,;谷氨酰胺组,;:集团)、24小时(生理盐水组,;谷氨酰胺组,;:集团血液和组织)通过心脏穿刺(肺和肝脏)集合,和60动物(死亡率分析/组)维持生存。

2.4。血清细胞因子测定

血样离心机在4°C 1000×g 10分钟获得血清。细胞因子的浓度(白介素- IL - 1, - 2, IL - 4、IL - 6、IL - 10,干扰素-(干扰素)γ,肿瘤坏死因子(TNF -]α500年)进行了评估μL血清的复合微球免疫测定,使用老鼠的商品化试剂盒(RECYTMAG®07 - 65 k;《创世纪》,密苏里州,美国)。盘子被读Luminex分析仪(MiraiBio、阿拉米达、钙、美国),根据制造商的指示16]。

2.5。热休克蛋白测定

大约100毫克肺组织和50毫克肝组织在液氮粉碎。•瑞帕裂解缓冲的材料均质(100毫米Tris-HCl (pH值7.5),1%钠脱氧胆酸盐,NP40 1%, 150毫米氯化钠,0.1%十二烷基硫酸钠(SDS))加蛋白酶抑制剂(1毫克/毫升抑肽素100毫米phenylmethylsulfonyl氟化物)。样本然后在14000×g离心10分钟在4°C。收集上清液和蛋白质浓度是量化使用布拉德福德方法(Bio-Rad实验室、大力神、钙、美国)。

蛋白质样本添加到示例缓冲区(2% SDS, 60毫米三羟甲基氨基甲烷(pH值6.8)液,巯基乙醇5%,0.01%溴酚蓝),进行电泳十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS - page)系统(bis-acrylamide SDS 1.5 Tris-HCl, 10%, 30%, 10%氨过硫酸盐和3,3,5,5-tetramethylethylenediamine)。蛋白质被转移到硝化纤维膜用半干的传输装置(包括从Bio-Rad实验室)。膜被孵化的屏蔽解决方案5%的脱脂牛奶TBST缓冲区(50毫米三羟甲基氨基甲烷缓冲液pH值8.0,100毫米氯化钠,和1%渐变20)在室温下1 h。然后,他们在TBST洗和孵化主要感兴趣的抗体蛋白质(HSP多克隆山羊anti-rat®;圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯、钙、美国)一夜之间在4°C。随后,膜被孵化的解决方案包含peroxidase-conjugated二级抗体(1:1000;圣克鲁斯生物技术)和超级信号检测(美国皮尔斯,罗克福德,IL)。蛋白表达是通过凝胶微使用ImageJ相比公共领域软件由韦恩Rasband美国国家精神健康研究院的,以前一直用于HSP70和一半的决心13]。

2.6。死亡率的观察

美联社感应后,每组20老鼠仍在观察最多7天,访问标准口服饮食(ain - 93 m)和水随意。单独的动物观察每8 h死亡登记。动物幸存下来直到7天后美联社牺牲的腹腔内注射80毫克/公斤盐酸氯胺酮(Ketamin-S®(+);Cristalia)和8.0毫克/公斤甲苯噻嗪盐酸盐(Rompum®2%;拜耳)。

2.7。统计分析

炎症的变量都是利用克鲁斯卡尔-沃利斯和Behrens-Fisher测试相比,Kolmogorov-Smirnov测试表明,他们没有正常分布。这些比较组间进行在每个时间点和内部组织。死亡和生存数据被费舍尔评估测试和kaplan meier分析,分别。所有的分析是基于5%水平的意义和使用SPSS软件(版本执行。Windows 18.0;美国SPSS、芝加哥、IL)。

3所示。结果

3.1。血清细胞因子浓度

血清细胞因子水平没有组间差异(表在任何时间点1)。血清干扰素-γ水平:与生理盐水组明显高于2 h后AP比12 h (和0.001,分别地。)和24小时(和0.050,分别地)后,美联社(图1(一))。此外,动物:组表现出更高的血清水平(图- 21 (b))和血清il - 10水平较低(图1 (c)),24小时后比2 h(美联社)和12 h (和resp)后,美联社。动物在盐水和谷氨酰胺组表现出只有降低il - 10水平在24 h后,美联社AP(后相对于2 h;图1 (c))。没有显著变化血清il - 1、il - 4、il - 6、TNF -α发生水平随着时间的推移,虽然略微无意义的TNF -高α水平:美联社(观察到24小时后与2和12 h后AP)和生理盐水(而美联社)组(图12 h后1 (d))。

3.2。热休克蛋白表达

HSP表达展示在表的数据2。谷氨酰胺组的动物比那些表现出更大的肺和肝一半寿命表达式:小组2 h (;图2(一个))和12 h (;图2 (b)美联社)后,分别一半寿命和更大的肝和HSP70表达比生理盐水组在12 h在美联社(和分别;数据2 (b)和2 (c))。略微无意义的大动物肺观察HSP70表达谷氨酰胺组与其他组相比在12 h后AP (;图2 (d))。生理盐水组肺一半寿命表达式是大于:小组2 h后AP (;图2(一个))。一半寿命:集团提出了增加肺HSP70和肝脏表达相对于其他组在24 h后,美联社(和0.004,分别;数据2 (e)和2 (f))。

3.3。死亡率

7天死亡率无显著差异中观察组(:,28%;生理盐水、47%;谷氨酰胺,27%)(图3)。此外,中位数区间的死亡率发生没有组间差异(:24 - 48小时之内;生理盐水,30-36 h;谷氨酰胺,48小时)。

4所示。讨论

我们的研究旨在有助于理解潜在的炎症机制,可能会影响肠胃外的风险收益平衡谷氨酰胺在重症监护输液。美联社被选为一个临界条件模型由于炎症介质的中心角色在生理病理学和多器官功能障碍综合征,这通常是其主要死亡原因(10]。此外,美联社的系统性效应中所观察到的类似其他重要条件,如败血症,严重烧伤和创伤17]。具体来说,钠taurocholate-induced美联社报道代表的疾病模型,与严重的和可衡量的全身炎症反应和多器官功能衰竭,就是明证肺、肝脏和肠道损伤大鼠(18- - - - - -21]。

在人类和实验模型,标志着促炎介质释放il - 1、il - 6和TNF -α是主要的有害的发现与美联社(15,22]。这个版本通常是紧随其后的是抗炎介质释放的增加(例如,il - 10),这可能引起免疫抑制在疾病的后期阶段15]。在我们的研究中,高剂量的注射用药物的谷氨酰胺注入前48小时实验美联社的感应并没有改变血清il - 1、il - 6和TNF -α在任何post-AP时间点。肿瘤坏死因子-略微无意义的增加α水平观察到后24 h:美联社和生理盐水组,但不是谷氨酰胺组。

谷氨酰胺组也没有显示显著降低干扰素-γ水平观察到:随着时间的推移,生理盐水组。此外,- 2水平保持加班谷氨酰胺和生理盐水组和降低il - 10水平,观察到在所有组24 h后,美联社,谷氨酰胺的发生更慢比:组和生理盐水组。可能与这些细胞因子相关的有害影响和利益必须解释的时机的释放在美联社的炎症阶段发展。例如,干扰素-γ和- 2可以激活炎症,但有关病原体清除这些细胞因子也有好处,可以在后期的努力来避免感染关键侵略(23,24]。

因此,免疫疗法与干扰素γ似乎是有害的在美联社的早期阶段(当炎症有害影响),有利于疾病的后期(当传染性并发症和immunoparalysis死亡主要原因的)(25- - - - - -28]。同样,释放- 2和90%的非特异性死亡率下降后观察脂多糖腹腔内管理与美联社老鼠,和治疗用重组- 2减少lipopolysaccharide-induced死亡率在疾病的后期24]。此外,由于其强大的contraregulatory效果,il - 10被发现是有益的在钠taurocholate-induced AP模型(29日]。然而,大量释放的细胞因子可能hyperintensify其抗炎效应,有利于immunoparalysis [30.]。因此,干扰素-的动力γ- 2,随着时间的推移和il - 10释放谷氨酰胺组中观察到的动物在这项研究似乎保护,使维护病原体的免疫活性间隙在美联社的后期发展。

在我们的研究中,对HSP表达明显影响也观察谷氨酰胺组与其他组。这种效应包括肝脏HSP70表达增加,倾向于增加肺HSP70表达美联社12 h后,以及早期一半寿命显著增加肺和肝的表情。雪et al。31日]报告改善的表达热休克转录因子- 1 (HSP表达的主监管机构)在谷氨酰胺的肠外注入老鼠。HSP表达可能是至关重要的细胞和组织保护的压力或损伤、休克蛋白作为分子伴侣’,稳定,再折起受损细胞间蛋白质和防止细胞内蛋白质聚合(32]。的确,谷氨酰胺的主要代谢和stress-signaling效应发生在疾病和损伤似乎由于其诱导HSP表达能力(33]。

HSP70表达的增加引起谷氨酰胺与改善生存,组织损伤,炎症反应(32]。一半也有cytoprotective属性,但大多数的目标蛋白质激酶和转录因子可以作为细胞基因表达的监管机构,包括促炎的分子通过核转录因子k B (34,35]。然而,我们没有发现系统性有害的促炎细胞因子增加与增加谷氨酰胺组的一半。此外,与:组相比,增加肝脏一半寿命表达式谷氨酰胺组发生急性胰腺炎早期感应,24小时后显著降低。因为HSP表达增加了有害的刺激,这种观察是高度提示早期肝内稳态响应美联社受伤谷氨酰胺组(36]。

肠外补充谷氨酰胺最近与高死亡率在危重患者多器官功能衰竭(7,8]。考虑系统干扰,可以在多个器官衰竭,最终我们的AP模型没有证实这有害影响,尽管我们高谷氨酰胺的肠外注入剂量。最近的多中心试验表明,肠外谷氨酰胺注入并没有改变病人的死亡率在外科重症监护病房还没有改善临床结果(37]。在我们的研究中,死亡率较低和死亡发生在动物谷氨酰胺组与其他组相比,尽管这些差异并不显著。

我们的研究有一些局限性除了实验性质,这可能限制的适用性研究结果给人类。首先,谷氨酰胺是单独注入之前,临界压力。炎症介质的释放是短暂的,采用这种策略提供谷氨酰胺对细胞和组织,观察其对这些介质的调节影响在我们的模型中。然而,我们不知道同样的效果是否会观察到如果谷氨酰胺是充满其他营养和压力因素的存在。此外,谷氨酰胺的肠外供应在临界压力不能完全应用于临床实践。其次,盐被用作对谷氨酰胺的肠外控制。盐水水化能减弱美联社减轻胰腺微循环的变化和循环障碍的肠壁,促进细菌易位和延续炎症机制(38]。这些影响可以解释的更大的好处谷氨酰胺在系统性促炎介质档案和组织HSP表达相比,:组与生理盐水组相比。

在这些限制,我们的数据表明,高剂量的注射用药物的谷氨酰胺能抵抗应激器官损伤通过提高细胞因子资料一半寿命和增加HSP70表达AP模型。这些保护作用对治疗危重病人特别感兴趣。必须寻求进一步的研究来设计一个协议谷氨酰胺的肠外政府允许我们临床利用其潜在的好处。

相互竞争的利益

丹·l·Waitzberg收到Fresenius-Kabi说谢礼,肠外谷氨酸盐解决方案的制造商。

确认

这个研究是企业管理学院德基金会支持的“尽管做Estado de圣保罗(过程没有。2011/02071-7)。作者感谢Fresenius-Kabi请提供谷氨酰胺溶液(Dipeptiven),巴克斯特实验室贷款蠕动泵,Farmoterapica准备肠外的合作方案,和若昂Italo迪亚斯语言统计讨论。