文摘
干扰素-α(IFN -α)限制了反应率在治疗慢性乙型肝炎(慢乙肝)。微分响应IFN的底层机制仍然是难以捉摸的。最近报道,SART1介导的抗病毒干扰素——的影响α丙型肝炎病毒(HCV)细胞培养模型。在这项研究中,我们调查的角色SART1干扰素的抗病毒活性α对乙型肝炎病毒(HBV)使用血液和肝脏活检样本与聚乙二醇干扰素治疗慢性乙型肝炎患者α和HepG2细胞转染克隆HBV DNA。我们观察到,基底SART1表达式在肝脏和PBMCs干扰素治疗明显高于比nonresponders反应者。此外,基线SART1表达水平与程度呈正相关乙肝病毒DNA和e抗原干扰素治疗后下降。从力学上看,沉默SART1废除干扰素的抗病毒活性α,减少IFN-stimulated基因的表达(ISG) Mx,美洲国家组织,和PKR和减毒JAK-STAT HepG2细胞信号,表明SART1调节IFN-mediated抗病毒活性通过JAK-STAT信号,研究小组的表情。我们的研究论述了重要作用的SART1 IFN-mediated anti-HBV响应并提供新的视角理解变化的干扰素治疗慢性乙肝患者的反应。
1。介绍
乙型肝炎仍然是一个全球卫生问题350 - 400人长期全球感染乙型肝炎病毒(1,2]。这些病人容易威胁生命的并发症,如乙肝病毒acute-on-chronic肝功能衰竭(ACLF) [3)、肝硬化和肝细胞癌(HCC) (4]。目前有两类代理批准用于治疗慢性乙型肝炎(慢乙肝):干扰素有ide (t)类似物和标准或聚乙二醇干扰素α(Peg-IFN -α)[5]。干扰素-α先天免疫和适应是一个重要的细胞因子的免疫反应接受抗病毒和免疫调节活动(4- - - - - -6]。干扰素-α与受体结合后,激活JAK-STAT信号通路、转录诱导干扰素刺激基因(isg)包括“经典”isg myxious抵抗蛋白质(MxA) [7),2,5-oligoadencylate sythase (OAS)和依赖rna的蛋白激酶(PKR) [8,9),发现山对乙肝病毒和其他病毒(抗病毒作用10]。虽然已经取得了实质性的进展在治疗乙型肝炎在过去的十年中,只有不到30%的病人显示持续对干扰素治疗。
虽然IL-28B基因型HBV基因型,血清ALT和HBV DNA水平在治疗之前被发现影响干扰素治疗的反应(11- - - - - -14),宿主基因之间的关系和干扰素治疗乙肝病毒的反应尚不清楚。鳞状细胞癌抗原T细胞(SART1)是公认的作为一个报道tri-snRNP特定要素与特定的E3泛素连接酶活动,扮演重要角色在招聘tri-snRNP剪接体组装(15]。它调节细胞增殖,因此有潜力用作目标在癌症治疗16- - - - - -18]。最近的研究发现,SART1施加其抗病毒活性通过加强研究小组使用丙肝病毒细胞培养模型表达式(19,20.]。因为研究小组感应也限制了乙型肝炎病毒感染(21,22),我们假设SART1起着调节作用研究小组表达干扰素治疗后对乙肝病毒感染。
在这项研究中,我们找到了一个以前从未发现过的函数的SART1乙肝病毒治疗。我们报告首次SART1表达式与干扰素-慢性乙肝患者的治疗反应。此外,消声SART1废除干扰素的抗病毒效果乙肝病毒复制和干扰素的表达——下降下游isg HBV细胞模型。我们的研究揭示了在干扰素SART1——的角色治疗慢性乙肝和提供潜在生物标志物预测干扰素治疗乙型肝炎病毒感染的结果。
2。材料和方法
2.1。研究对象、临床样本和研究设计
这项研究是按照指南进行《赫尔辛基宣言》的前和接收机构审查委员会批准的南京医科大学第一附属医院,南京,中国。病人的书面知情同意前得到包容。33天真的慢性乙肝患者从2012年到2014年在南京医科大学第一附属医院。天真的慢性乙肝患者的入选标准研究> 10 e抗原阳性和HBV DNA水平4拷贝/毫升。所有接受治疗的病人注射Peg-IFN -α180年μg每周48周。血液样本以及PBMCs的IFN -治疗的患者收集在基线和干扰素-后12周治疗。肝活检样本收集24小时之前干扰素治疗。我们病毒学反应定义为HBV DNA水平< 1000拷贝/毫升,血清学反应e抗原丢失或血清转化,生化反应正常化ALT水平,和结合反应HBV DNA水平< 1000拷贝/毫升和e抗原或HBsAg的损失。剩下的病人被列为nonresponders不能满足标准。我们评估两个端点治疗结合Peg-IFN - 48周后的反应α持续治疗和联合治疗反应在24周后端点。表中给出的患者的特征1。
2.2。标记描述乙型肝炎病毒感染
乙肝病毒DNA测量使用实时PCR (Amplicor乙肝病毒监控测试,罗氏诊断,曼海姆,德国)。HBsAg和e抗原水平测量师HBsAg化验(美国雅培,森林湖,IL)和AxSYM HBe 2.0试验(Abbott),分别。Anti-HBs和anti-HBe由建筑师定性分析(Abbott)。血清生化标记和丙氨酸转氨酶(ALT)血清化验使用自动分析仪(日立747年,日本)。
2.3。质粒和试剂
phbv - 1.3生成从描述的乙肝病毒基因组22]。干扰素刺激响应元素荧光素酶报告质粒(pISRE-luc)请提供的林教授正为温榆(马萨诸塞州综合医院、哈佛医学院、波士顿)。特定的小核RNA) SART1 (siSART1) IFNAR (siIFNAR)和核控制买来RIBOBIO生物科技(广州)。
2.4。细胞培养
从美国获得了人类肝癌细胞株HepG2类型文化收藏。HepG2细胞生长在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)补充10%胎牛血清(Gibco BRL,马里兰州)37°C公司为5%2。细胞被镀在12-well或6-well板根据实验和-70%增长到60%转染前融合。
2.5。荧光素酶报告实验和转染
HepG2细胞与表示siRNA reverse-transfected 12-well板质粒转染前24小时使用Lipofectamine 2000(表达载体)。干扰素刺激响应元素(ISRE)介导的干扰素信号被dual-luciferase记者试验监控系统在cotransfecting pISRE-luc质粒表达萤火虫荧光素酶和pRL-TK质粒表达Renilla荧光素酶作为内部控制。p-ISRE转染48小时后,1000国际单位/毫升IFN -α添加和孵化别人描述的细胞为8小时(23- - - - - -26]。相对荧光素酶活性被Promega评估dual-luciferase记者分析系统(Pro-Omega,麦迪逊,WI)。相对荧光素酶单位(RLU)计算了萤火虫荧光素酶值除以Renilla荧光素酶值。
2.6。量化的HBV e-Ag Ag)和乙肝病毒表面
细胞转染表示,在DMEM培养了一个额外的24小时没有的边后卫和抗生素。收集的媒体,一个标准的酶联免疫试剂盒用于量化HBV e-Ag (e抗原)和乙肝病毒表面Ag (HBsAg)(上海KeHua生物科技、上海、中国)。
2.7。中存在
细胞培养PBMCs RNA, RNA的慢性乙肝患者提取试剂盒试剂(表达载体,卡尔斯巴德,CA)和reverse-transcribed cDNA kr - 103逆转录酶(Tiangen,北京)。表达水平的量化存在7500 HT存在系统上执行(应用生物系统公司,生活技术,达姆施塔特,德国)使用CT方法。相对mRNA水平的目标基因都是归一化辅助基因(GAPDH)水平。目标基因的引物序列如表所示2。
2.8。免疫印迹分析
目标基因的蛋白质是准备如前所述27]。每个样本的蛋白质浓度确定BCA蛋白质化验设备P0012S (Beyotime,中国)。蛋白质被叠加凝胶和sds - page分离三在100 V 90分钟和甘氨酸系统转移到聚偏二氟乙烯膜(美国微孔)。膜被封锁的脱脂奶粉3%磷酸盐与脱脂奶粉。被孵化主要抗体1 - 2小时后,膜清洗三次,孵化与辣根peroxidase-conjugated二级抗体。墨迹与发射极耦合逻辑开发免疫印迹基质(热刺穿,罗克福德,IL)。抗体对MxA (Abs),β肌动蛋白是购自圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯,CA), Abs对SART1 STAT1, p-STAT1, STAT2,和p-STAT2购买从SAB技术(美国Signalway-Antibody)和Abs PKR和美洲国家组织从PTG购买实验室(Rosemont, IL)。带强度被gel-pro量化软件。
2.9。免疫组织化学
肝脏部分(> 4毫米)从石蜡块,然后用3% H2O2特里同,permeabilized 0.5%,孵化3%牛血清白蛋白(BSA)。样本沾兔子反SART1多克隆抗体(1:100)在37°C 45分钟,其次是孵化与HRP-conjugated山羊anti-rabbit马伯(Boshide,武汉,中国)37°C 30分钟根据免疫组织化学的教学工具(SP9001;北京中山生物技术,中国)。
2.10。统计分析
统计分析是由学生的测试或Mann-Whitney以及,如适当。目标基因的表达及其与临床指标的相关性是由皮尔森相关处理。所有与SPSS统计分析进行了v。美国芝加哥11 (SPSS)。被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。预处理SART1表达水平与干扰素-α慢性乙肝患者的反应
使用immune-histochemical染色和存在,我们首先分析了SART1的表达在生活活组织检查和PBMCs慢乙肝患者干扰素-α治疗。有趣的是,肝SART1基线水平表达反应显著高于在nonresponders(图1(一))。PBMCs的SART1 mRNA表达干扰素反应也显著高于nonresponders(图1 (b))。此外,在所有的慢性乙肝患者接受干扰素治疗,预处理SART1表达PBMCs HBV DNA和e抗原下降呈正相关,从0到12周(图1 (c))。这些结果说明SART1表达式与病毒学应答的干扰素治疗慢乙肝病人,表明SART1起着关键作用的抗病毒干扰素对抗乙肝病毒的效果。
(一)
(b)
(c)
3.2。沉默SART1限制了干扰素的抗病毒活性α
进一步调查的角色在IFN-mediated SART1抗病毒活性,我们撞倒了SART1乙肝病毒复制使用核细胞培养系统。特定的核目标SART1 (si-SART1)转染连同phbv - 1.3成HepG2细胞转染效率(50 - 60%),其次是治疗1000国际单位/毫升外源性干扰素-α24小时posttransfection。转染后48小时,乙型肝炎病毒感染是由乙肝病毒DNA复制评估以及e抗原和HBsAg分泌。如数据所示2(一个)- - - - - -2 (c),乙肝病毒DNA复制、e抗原和表面分泌物检测乙肝病毒复制的细胞培养模型。干扰素-α显著抑制HBV DNA复制和e抗原HBsAg分泌。沉默SART1不仅增加了乙型肝炎病毒感染,也妥协干扰素的抗病毒活性,表明SART1施加IFN-associated抗病毒活性在乙肝病毒复制细胞模型。SART1-specific siRNA的效率是通过测量SART1信使rna和蛋白质在图所示2 (d)。值得注意的是,干扰素抗病毒效应SART1击倒后,仍对重大表明还有其他额外的因素/途径比SART1调节干扰素的抗病毒效果。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.3。沉默SART1抑制干扰素的表达α下游抗病毒效应物
Mx,美洲国家组织,PKR古典下游isg抗病毒活性。这些ISG-encoded蛋白质干扰病毒复制截然不同的步骤或触发病毒RNA和蛋白质的降解发挥抗病毒活性。探讨SART1的作用在调节这些干扰素下游效应器,之前我们与si-SART1转染HepG2细胞干扰素-α治疗。IFN-induced MxA,美洲国家组织和PKR表达水平测量中存在和免疫印迹。如图3,SART1击倒信使rna和蛋白质含量减少IFN-induced MxA,美洲国家组织,PKR。这些结果说明沉默SART1废除干扰素的抗病毒活性下调isg表达式。
3.4。沉默SART1废除干扰素Anti-HBV功效的衰减JAK-STAT信号
进一步调查SART1的机械作用在调节isg表达式,我们评估了SART1之间互动,isg、JAK-STAT信号使用荧光素酶报告系统由IFN-stimulated响应元素(ISRE)。ISRE-driven荧光素酶活性增加干扰素-三倍以上α刺激的不属预定目标的核(siCTRL NC)。击倒的SART1 si-SART1显著降低ISRE活动与控制细胞(图4(一)),这意味着SART1抑制isg表达式通过下调ISRE活动。获得洞察SART1的影响在IFN-induced JAK-STAT信号,我们下一个调查统计后磷酸化SART1击倒。如图4,击倒SART1显著降低STAT1磷酸化和略STAT2磷酸化(图有所下降4(b))。相比之下,沉默SART1没有影响总STAT1和STAT2 IFN-induced表达式。综上所述,这些结果表明沉默SART1变弱IFN-induced JAK-STAT信号isg的差别之后,对这些基因的表达。
4所示。讨论
虽然干扰素-α和聚乙二醇(Peg-IFN -形式α)作为一线治疗的慢性乙型肝炎20多年,干扰素治疗的持续反应率仍然远未满足(26- - - - - -28]。临床试验数据显示32% HBeAg-positive患者实现e抗原血清转化干扰素治疗后,14%的患者获得检测不到病毒载量(29日]。因此,多努力都对预测IFN治疗个性化治疗反应。底层干扰素反应机制仍然未知,导致困难改善预测干扰素治疗效果,使个性化的治疗建议。最近我们和其他报道,SART1转录调节干扰素的抗病毒活性α使用丙肝病毒对丙肝病毒细胞培养模式19,20.]。然而,SART1的功能研究只有在丙肝病毒细胞培养模型。进一步探索SART1在干扰素的作用α的抗病毒效果,在本研究中我们使用了肝脏和PBMCs样本慢乙肝患者和乙肝病毒复制细胞培养模型,以期阐明反应机理干扰素和识别潜在的生物标记物预测干扰素治疗乙型肝炎病毒感染的结果。
我们首先检查基础表达SART1的慢性乙肝患者肝活检样本和外围PBMCs之前干扰素-α治疗。有趣的是,SART1表达干扰素反应显著高于干扰素nonresponders。因此,更高的SART1基线水平强烈建议更好的应对干扰素-α在乙肝病毒治疗。重要的是,SART1基线的表达PBMCs显示正相关的趋势与HBV DNA和e抗原从0到12周下降,分别。这些数据表明,SART1 IFN-associated抗病毒基因对抗乙肝病毒的宿主。在这个场景中,它支持的假设SART1扮演着重要的角色,可能被用作生物标记对干扰素-α治疗。
调查SART1机制包括干扰素-α的抗病毒活性,重要的是关联和干扰素- SART1表达式αanti-HBV效果。我们撞倒SART1在乙肝病毒复制细胞培养模型,发现沉默SART1废除干扰素-α对乙肝病毒复制的抑制效果与HBV1.3 HepG2细胞转染质粒。结合我们的在活的有机体内研究协会和干扰素- SART1表达式αanti-HBV影响乙肝病毒的细胞模型和慢性乙肝患者是有说服力的。接下来,我们努力探索SART1监管的机制IFN-mediated anti-HBV效应,这是依赖于关键isg表达式包括抗病毒蛋白质MxA,美洲国家组织,PKR [30.]。MxA蛋白最初发现在小鼠抗甲型流感和被认为对许多病毒调解先天免疫。其anti-HBV机制已经研究的很透彻MxA overexpressing老鼠(31日]。美洲国家组织的蛋白质能够合成oligoadenylates激活潜在形式的RNaseL然后触发病毒RNA的降解32]。PKR属于蛋白质激酶,干扰素-α和dsRNA-dependent机制通过抑制翻译EIF2a的磷酸化9]。然后我们问SART1干扰素-介导的α通过调节isg上面提到的anti-HBV效果。有趣的是,我们发现了isg mRNA和蛋白表达降低HepG2细胞与干扰素治疗α在沉默SART1。这些结果与先前的报道是一致的丙肝病毒(19]。因此,我们的研究进一步的发现早期的研究,表明SART1监管干扰素-α抗病毒活性不仅在丙肝病毒感染,而且在乙型肝炎病毒感染。此外,我们的在体外研究表明,SART1介导干扰素抗病毒效应对乙肝病毒通过调节下游isg表达式。
值得指出的是,有多种因素调节干扰素的抗病毒效应如前所报道,如载脂蛋白B信使rna编辑酶催化polypeptide-like 3 (APOBEC3)、表皮生长因子受体和核转录因子κB (26,33,34]。这是由我们的数据支持,表明击倒SART1只是部分减弱干扰素的抗病毒效果。
进一步研究的详细机制SART1-mediated干扰素anti-HBV效果,我们专注于干扰素信号通路。干扰素-的绑定αI型干扰素受体激活JAK-STAT信号通路,导致二聚STAT1和STAT2协会干扰素调节因子9形成IFN-stimulated基因因素3复杂,把原子核和结合ISRE促进转录的isg [35,36]。因此,我们试图确定交叉口的SART1干扰素信号通路通过荧光素酶报告系统由ISRE。正如所料,SART1比不属预定目标的siRNA ISRE活动有影响。重要的是,沉默SART1没有影响总STAT1和STAT2的IFN-induced表达式,但显著降低STAT1磷酸化和略STAT2磷酸化有所下降。因此,我们表明,确实SART1干扰素-中扮演一个重要的角色α信号。
不可否认,在我们的研究有一定的局限性。首先,患者样本的数量相对较小,可以通过扩大研究对象在将来的研究中解决。其次,还需要进一步的研究来探索不同的机制SART1表达在慢性乙肝患者。IL28B单核苷酸多态性,rs12979860 T / C和rs8099917 T / G,已报告与自发和treatment-induced病毒清除丙肝病毒感染37- - - - - -39]。SART1 SART1转录启动子多态性及其影响,结合转录因子的多态区域,等等是值得研究40]。
总之,我们的研究提供了新的见解SART1-mediated isg的监管和响应在慢性乙肝患者干扰素治疗。干扰素的变化α的抗病毒反应与微分SART1 PBMCs和肝脏基因表达水平。然而,背后的生物机制SART1干扰素的反应——的影响α治疗需要进一步调查。调查对isg SART1-mediated监管机制和干扰素-α的抗病毒效果,两者兼而有之在活的有机体内和在体外,可能提供一个更好的理解的角色SART1在先天免疫应对病毒感染乙肝病毒,小说可能被用来开发抗病毒治疗策略。
5。结论
总之,我们发现SART1表达式与干扰素治疗反应慢乙肝患者和乙肝病毒复制细胞培养模型。从力学上看,SART1调节IFN-mediated抗病毒活性通过JAK-STAT信号和研究小组归纳。我们的发现可能有助于提供一个潜在生物标志物的干扰素治疗反应在慢性乙肝疾病管理。
缩写
| ALT: | 丙氨酸转氨酶 |
| 慢性乙肝: | 慢性乙型肝炎 |
| e抗原: | 乙肝病毒e-Ag |
| 表面: | 乙肝病毒表面Ag) |
| 乙肝病毒: | 乙型肝炎病毒 |
| MxA: | Myxovirus抗性蛋白 |
| 美洲国家组织: | 2,5-Oligoadenylate合成酶 |
| PKR: | 蛋白激酶R |
| 存在: | 定量rt - pcr |
| SART1: | 鳞状细胞癌抗原被T细胞 |
| si-IFNAR: | 对干扰素-核受体 |
| si-SART1: | 核与SART1 |
| 核: | 小干扰RNA。 |
相互竞争的利益
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
作者的贡献
范小开始,设计和监督的研究。勇,Chuanlong竺Faxi王朱田田,小君,Shufeng Liu和范小进行了研究。勇,Chuanlong朱,范小分析数据。勇李和范小写道。
确认
这个项目一直与教育拨款支持通过基在肝脏Disease-Asia科学研究学者项目和国家自然科学基金资助(没有。81271713也没有。81600472)。