文摘

创伤性脊髓损伤(SCI)紧随其后的是瞬间的增加表达microglial-derived促炎细胞因子肿瘤坏死因子(TNF)内进行。肿瘤坏死因子存在membrane-anchored肿瘤坏死因子(mTNF),裂解可溶性肿瘤坏死因子(solTNF)。我们之前表明硬膜外管理的显性负solTNF抑制剂,XPro1595,脊髓挫伤导致的变化Iba1蛋白表达在小胶质细胞/巨噬细胞,减少损伤体积,改善运动功能。在这里,我们使用老鼠表达mTNF扩展我们的研究,但没有solTNF (),研究基因消融的solTNF SCI的效果。我们证明损伤脊髓内肿瘤坏死因子水平显著减少SCI后3天老鼠相比,同窝出生的。这减少了,然而,不转化为重大变化在其他职业——和抗炎细胞因子(il - 10、il - 1β,IL-5白介素- 2、处于CCL2,或CCL5),尽管倾向增加il - 10和降低il - 1β,TNFR1 TNFR2水平老鼠。此外,小胶质和白细胞浸润、激活状态(Iba1, CD11b, CD11c、CD45和MHCII),病变大小和功能结果温和SCI后基因型之间的可比性。总的来说,我们的数据表明,基因消融solTNF并不显著调节postlesion SCI后的结果。

1。介绍

创伤性脊髓损伤(SCI)通常是突然挫伤引起的脊髓,在最初的组织损伤是紧随其后的是细胞死亡的第二个阶段,炎症、变性发生几周、几个月后最初的创伤。

microglial-derived细胞因子肿瘤坏死因子(TNF)增加病变部位在啮齿动物(SCI后第一个1 - 2小时内1- - - - - -4)和脊髓受伤的个体显示升高血清TNF浓度(5,6),这表明TNF戏剧发展的一个主要部分二级组织损伤(7]。

肿瘤坏死因子存在于两种生物活性形式,一种membrane-anchored (mTNF)和可溶性形式(solTNF),从膜脱落的金属蛋白酶TNF -α转换酶(TACE / ADAM17)。solTNF的生物效应和mTNF通过绑定介导肿瘤坏死因子受体1 (TNFR1)和TNFR2在表达不同,配体的亲和力,胞质尾结构,和下游信号通路(了普罗伯特[8])。

在实验局灶性脑缺血、急性中枢神经系统损伤,microglial-derived mTNF已被证明是神经通过绑定TNFR1 (9- - - - - -12]。然而,在科学数据是相互矛盾的。金和他的同事们发现TNFR1^−−/老鼠增加了病变的大小和功能结果相比对照组差(13),暗示TNFR1保护者的角色,而热那亚et al。14]证明减少组织损伤和改善运动机能与非选择性治疗的小鼠肿瘤坏死因子抑制剂以及TNFR1英夫利昔单抗^−−/老鼠,表示TNFR1的有害作用。令人惊讶的是,细胞消融肿瘤坏死因子TNF^−−/老鼠没有导致任何病变大小和功能的差异结果SCI后相比,控制(15]。我们最近表明硬膜外显性负管理solTNF抑制剂XPro1595减少病变大小和改善功能结果SCI后,而道,抑制剂mTNF和solTNF,没有影响(16]。重要的是,系统管理的复合是无效的16),与其他的研究显示,服用依那西普SCI后小鼠系统性管理并不减少炎症和组织损伤或中性粒细胞的浸润,也不会改善功能结果17]。年底堵塞的外围用依那西普进行肿瘤坏死因子也在改善小鼠运动功能无效SCI (18),而在老鼠减少组织损伤,改善下肢功能,促进髓鞘再生(19]。还应该提到的病例报告脊髓受伤的病人用依那西普进行长期治疗强直性脊柱炎证明减少炎症,降低perilesional区域,和提高电机恢复(20.]。

尽管研究SCI后microglial-derived肿瘤坏死因子的作用是不确定的,他们显然证明TNF-TNFR信号级联组织炎症中扮演一个重要组成部分,尽管solTNF的贡献与mTNF组织损伤和功能恢复仍有待阐明。在这项研究中,我们调查的影响solTNF和mTNF SCI使用转基因老鼠只能表达mTNF [21]。我们表明,缺乏solTNF老鼠不影响病变大小和功能结果SCI后35天。然而损伤脊髓内肿瘤坏死因子水平显著减少SCI后3天相比,同窝出生仔畜控制老鼠()。这些发现表明,基因消融solTNF并不影响SCI后病变大小和功能的结果。

2。材料和方法

2.1。老鼠

纯合子的和同窝出生被交叉杂合的mTNF获得生物医学实验室的老鼠,南丹麦大学(香港特别任务连)12,21]。这些老鼠最初是由取代内生TNF与Δ1-9等位基因,K11E TNF等位基因(21]。这导致的损失TACE-mediated乳沟防止脱落solTNF [21,22),但维护正常的细胞表面表达mTNF [21]。所有实验进行盲目的同龄女性(8 - 12周)和同窝出生的。动物被安置在与1 - 3比较通风笼12 h光/暗周期,在控制的温度和湿度下,和免费的食物和水。

老鼠照顾依照批准的协议和指南丹麦动物检查员在食品和农业(j .数字2008-561-1523和2008-561-1523);实验报告按照到达的指导方针,和所有正在努力减少痛苦和悲伤。

2.2。基因分型

DNA提取使用NucleoSpin从3-4-week-old老鼠尾巴活检组织工具包(Macherey-Nagel)根据制造商的指示。DNA扩增的PCR在下列条件:50°C 2分钟和95°C 10分钟紧随其后的是39 95°C的周期为15秒,1分钟62°C,和72°C 1分钟以下每PCR反应:12.5µL掌握混合(热科学),1µL正向引物(5′-GCGTCCAGCTGACTAAA), 1µL反向引物(3′-ACCACTAGTTGGTTGCTTTGAGAT)和10µL dH₂o .引物都从DNA技术/ S和浓度的10 pmol /工作µl . PCR产品可视化使用FlashGel系统(Lonza)。Four-microliter PCR产品混合FlashGel加载缓冲区(Lonza)加载到FlashGel DNA盒式1.2%琼脂糖凝胶16 + 1双井(Lonza)和凝胶被允许运行25 - 30分钟70伏特。在所有凝胶,FlashGel系统DNA标记(Lonza)和样品与已知基因型(纯合子,合子和野生型)是包括在内。

2.3。行为分析

我们以前进行了彻底的行为评估天真的条件相比,并没有发现行为表型的差异同窝出生的(12]。

高+迷宫。进一步研究焦虑行为和运动,这可能影响运动功能SCI后,天真的老鼠受到高+迷宫(EPM)。高架+迷宫装置由两个张开双臂和两个封闭的武器(30厘米×5厘米)。整个迷宫升高大约40厘米从地板上。每个鼠标放置在迷宫的中心开着头朝向手臂。在5分钟的测试,所花费的时间在封闭和开放武器和总距离移动记录使用智能视频跟踪软件(Panlab)。

2.4。Contusive脊髓损伤

老鼠使用氯胺酮麻醉(100毫克/公斤,VEDCO Inc .) /甲苯噻嗪(10毫克/公斤,VEDCO Inc)鸡尾酒,椎骨之间laminectomized T8 T10和受伤的无限视界- 0400年SCI挫伤设计(精密系统和仪表,LLC)通过降低撞击器上的接触线的影响75 Kdynes导致大约500μ米位移(中度损伤)16]。老鼠然后缝合,注射生理盐水,以防止脱水,并给予盐酸丁丙诺啡(0.001毫克/ 20克体重Temgesic)四次每隔8个小时的手术后的镇痛效应。老鼠分别安置在恢复室和监控为24 - 48小时复苏时期。此后,老鼠每天两次观察活动水平,呼吸速率,一般身体状况。人工膀胱表达式进行一天两次,直到膀胱功能恢复。每周体重监测。此外,老鼠收到南卡罗来纳州预防性注射抗生素庆大霉素(40毫克/公斤)为7天,防止尿路感染。执行SCI的人参加科学研究训练计划在俄亥俄州立大学。总的来说,2老鼠死在手术过程中,1和1鼠标是安乐死在24天8天,分别由于一般健康状况不佳。

2.5。SCI后功能的评估结果

低音部鼠标规模。SCI后功能恢复的后肢功能由得分的运动下肢表现在开放领域使用低音部鼠标规模(BMS)系统,专门为0到9评级系统鼠标(16,23]。在盲法的情况下,小鼠评估4分一段SCI和每周1和3天后。只老鼠得分低于2,代表一个成功的病变,在第一天被包括在研究。在手术之前,老鼠处理和pretrained开放领域,防止恐惧和/或压力偏差运动评估行为。

热痛觉过敏。热痛觉过敏(后爪退出通常无害的热源)测试了哈格里夫斯热源使用足底测试仪器(尤格Basile) [16]。每个爪子测试5次,其中至少要有2分钟打破。每个爪子的最低和最高反射延迟分数被丢弃,双边意味着计算和绘制。行为测试执行每周当老鼠BMS分数达到5和能够频繁或一致的步进,从而足底爪子的位置,通常SCI后3周左右。

踏步走。为了测试步进、interlimb协调和平衡,老鼠测试该阶梯上走也当他们到达BMS得分5。响走由两个板块的透明聚合物,大约110厘米×20厘米,一个2.5厘米的空间。装置被放置在两个笼子里,笼子的一端,使老鼠自动走那个方向。避免停止或将在试验期间,动物pretrained 5次手术前的最后测试作为基线。SCI后,合格的老鼠在3、4、5周使用还装有一个手持式高清摄像头和48帧/秒。使用QuickTime逐帧数据进行评估。左派和右派的分数计算如下:6,完整的小姐;5,触碰响但滑动,失去平衡;4、触摸,但没有小姐失去平衡; 3, replacement, mouse placed paw on rung but quickly moves it; 2, recorrection, aims for a rung but changes direction; 1, anterior or posterior placement; 0, perfect step. The total number of mistakes was plotted for analysis as previously described [16]。

开放的现场试验。开放的现场试验和非透明的执行方塑料盒(45××45厘米)在一段10分钟后35天SCI (16]。运动跟踪使用智能视频跟踪软件(Panlab)连接到一个摄像机(SSC-D378P Biosite)。路程(m)、速度(厘米/秒)和条目分为三个地区(墙、interperiphery和中心的框)自动记录。中心/周长比计算基于条目的数量。饲养,梳理、跳跃、挖掘,排尿,粪便手动记录并显示在数字()的事件24]。

2.6。组织处理

2.6.1。组织病理学和免疫组织化学

石蜡组织病理学和免疫组织化学分析,老鼠深麻醉使用过量戊巴比妥(200毫克/毫升)包含利多卡因(20毫克/毫升),通过左心室冰冷的4%多聚甲醛灌注(PFA)磷酸盐(PBS)。脊髓很快被删除并组织部分包含病变区域集中在病变(1厘米)石蜡包埋,切成10平行一系列15μ米厚的切片机部分。直到进一步的处理部分是储存在室温下。

2.6.2。Kluver-Barrera Luxol快速蓝染色有髓纤维

评估病变的病理学,1系列的部分从每个动物在Luxol快速染色蓝(局部反馈)在95%的乙醇(0.1%局部反馈(EtOH)和0.05%乙酸)60°C /晚上。第二天,部分在96% EtOH冲洗和蒸馏H₂O,沉浸在碳酸锂(0.05%₂有限公司₃在蒸馏水),分化EtOH 70%。接下来,部分在蒸馏H彻底冲洗₂O和沉浸在0.05%碳酸锂停止进一步分化。部分被放置在苏木精,在运行自来水冲洗,沉浸在曙红短暂的解决方案。最后,部分EtOH冲洗在70%,紧随其后的是3 x 99% EtOH,放置在3 x二甲苯与Depex之前安装。染色之前,石蜡包埋部分在二甲苯deparaffinized 3 x 3分钟,99% EtOH 3 x 2分钟,2 x 2分钟EtOH 96%。

2.6.3。免疫组织化学染色,CD45 F4/80, MBP

燥热引起抗原检索被沸腾的部分进行石蜡包埋部分在柠檬酸缓冲+ 0.05%的渐变,pH值6.0 (MBP) Tris-EGTA缓冲区,pH值9.0 (CD45),或TRS缓冲区(目标检索解决方案,Dako) (F4/80)第一次15分钟在440 W 900 W,然后9分钟。部分被允许冷却前的缓冲他们阻断内源性过氧化物酶和生物素活动。部分被孵化与anti-CD45免疫球蛋白(30-F11 (Ly 5);BD Pharmingen)稀释1:100年,anti-F4/80免疫球蛋白(AbD Serotec)稀释1:100年,或anti-MBP免疫球蛋白(Biolegend)稀释1:150年,发现使用biotin-labeled anti-rat (Dako),稀释1:200年,或anti-mouse稀释1:100年,抗体,紧随其后的是现成的anti-rabbit辣根perioxidase——(合)标记聚合物(想象+系统、Dako) diaminobenzidine(涂)发色体(Dako)。核复染色使用Mayer chloralhydrate haemalum w / 4.5%。消极的控制,染色特异性测试并行部分省略主脊髓组织的抗体或替换主要抗体相同浓度的鼠标IgG1同形像控制(Dako) (MBP),以检查任何非特定的探测系统的反应。作为抗体特异性,积极控制鼠标多次拉丝包含几个不同的组织,包括淋巴器官,是包括在内。激活模式研究了在第五部分(代表750人μ脊髓)集中在病变从每个动物中心。

2.6.4。Immunofluorescent染色为胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和电离钙绑定衔接分子(Iba1)

部分从每个动物的一个系列是deparaffinized和水化将二甲苯的部分3 x 3分钟,3 x 2分钟99% EtOH, 96% EtOH 2 x 2分钟,2分钟70% EtOH,最后5分钟运行自来水。的部分被放置的部分然后demasked TEG-buffer温暖TEG-buffer蒸15分钟,然后让他们在室温下冷却15分钟前冲洗15分钟在运行的自来水。的部分被冲洗3 x 15分钟在Tris-buffered盐水(TBS)在他们preincubated 10%胎牛血清的边后卫在TBS 0.5% Triton x - 100 30分钟。以下部分是潜伏在Alexa萤石®488 -共轭anti-GFAP免疫球蛋白(鼠标单克隆、克隆131 - 17719热费希尔科学)稀释1:400或anti-Iba1免疫球蛋白(兔子,Dako)稀释1:400 1小时在室温和以后晚上4°C。

在第二天,部分被放置在室温下30分钟之前他们在TBS冲洗10分钟,然后在TBS 0.1% Triton x - 100 10分钟。部分然后要么沾NeuroTrace®530/615红色荧光尼氏小污点(热费希尔科学)20分钟(GFAP)或潜伏在Alexa萤石488 -共轭鸡anti-rabbit免疫球蛋白(热费希尔科学)1:500 2小时然后冲洗2×10分钟前在TBS细胞核是沉浸在TBS方案包含10μM diamidino-2-phenylindole (DAPI) 10分钟。部分是在蒸馏水冲洗不久之前他们安装与延长钻石。激活模式研究了在第五部分(代表750人μ脊髓)集中在病变从每个动物中心。控制反应是由省略主要抗体或用Alexa萤石取代主要抗体488共轭鼠标(热费希尔科学)或替换主与兔血清抗体(Dako)稀释至相同的浓度主要抗体。部分是没有染色的FITC成像过滤器。

2.7。病灶体积估算

病变的体积决定从该地区每10局部反馈——或GFAP-stained部分采样系统的统一的随机抽样。病变部位的面积估计在LFB-stained部分如前所述16使用VisioMorph软件(Visiopharm)和体积估计Cavalieri原则。GFAP-stained估计病变区域的部分,显微照片是使用一个奥林巴斯BX51显微镜与奥林巴斯DP73相机连接到电脑设置了奥林巴斯CellSens软件。病变大小被估计使用ImageJ分析软件(NIH)按ImageJ开发者的方向(http://rsb.info.nih.gov/ij/)。分析进行数字图像进行unmanipulated图片。在图片的对比,提出曲线调整允许读者欣赏细节小规模的数据。

2.8。白质的估计

完整的白质的面积,MBP染色的基础上,估计是脊髓组织总面积的百分比。估计是基于5部分集中在震中300和5部分μm吻侧病变(部分2 - 3动物/组)。

2.9。流式细胞术

2.9.1。孤立的细胞进行流式细胞术

小鼠灌注与PBS如上所述,脊髓很快被删除,组织部分包含病变区域(2.5厘米集中在病变)和perilesion区(0.5厘米和0.5厘米近端栓塞病灶集中代表perilesion组织)被放置在寒冷的汉克的缓冲盐溶液(哈佛商学院)。组织从单个小鼠分别处理。单细胞悬浮体使用70年在哈佛商学院获得的同质化µm细胞尼龙过滤器(BD猎鹰)。细胞悬浮液在300×g离心10分钟4°C。颗粒在PBS resuspended包含0.5%的边后卫,除髓珠二世(Miltenyi研究)和悬浮液加入孵化15分钟在4°C。此后PBS含有0.5%的边后卫添加和悬浮液离心300×g 10分钟4°C,然后颗粒在PBS resuspended包含0.5%的边后卫。LS列(Miltenyi研究)放置在磁场的mac分离器(Miltenyi研究)和列由洗涤与PBS包含0.5%的边后卫。接下来,添加细胞悬液是和材料收集和离心机在300 g×10分钟4°C。的颗粒被resuspending PBS和离心机300 g×10分钟4°C。溶解的红细胞颗粒在0.83%氯化铵resuspended 10分钟之后,悬挂在300×g离心10分钟4°C。的颗粒被resuspending PBS和离心机300 g×10分钟4°C。最后颗粒在PBS resuspended和细胞悬液是生活/死细胞染色使用可以解决的可行性染料eFlouro 506 (eBioscience) 20分钟在4°C在黑暗中。 The pellet was washed by resuspending in PBS and centrifuged at 300 ×g for 10 minutes at 4°C. Cells were fixed in Cytofix/Cytoperm (BD Pharmingen) for 15 minutes at 4°C and centrifuged at 300 ×g for 10 minutes at 4°C. The pellet was washed twice in FACS staining buffer (HBSS containing 2% FBS and 0.1% sodium azide) and centrifuged at 300 ×g for 10 minutes at 4°C in between. Finally the pellet was resuspended in FACS staining buffer and kept in the dark at 4°C until staining for flow cytometry.

2.9.2。流式细胞术

10%的大鼠血清的细胞被封锁在冰前30分钟洗PBS和离心机在600 g×5分钟在4°C。流式细胞仪的细胞被resuspended染色和染色的缓冲区的组合PE-CD11b (BD生物科学,克隆M1/70) PerCPCy5.5-CD45 (BD生物科学,克隆30-F11) APC-CD3 (BD生物科学,克隆145 - 2 - c11), PE-Cy7-Gr1 (Biolegend克隆RB6-8C5) PE-Cy7-CD11c (BD生物科学,克隆HL3)和647 - mhc II级(BD生物科学,克隆M5/114.15.2)抗体在冰上30分钟。最后,细胞被洗在PBS,离心机在600 g×5分钟在4°C,和resuspended流式细胞仪缓冲区之前他们运行在FACSverse流式细胞分析仪,和10⁶事件是获得每个示例使用向前散射(FSC)和散射(SSC)。分析了使用FACSuite软件(25]。阳性染色确定基于各自的同形像控制和相应的荧光- 1 (FMO)控制。平均荧光强度(MFI)计算每个人口的几何平均数CD45和CD11b盖茨,分别为(25]。

2.10。多路复用和免疫印迹分析

蛋白质纯化。整个脊髓蛋白质样本和老鼠暴露在SCI和允许为期3天的生存除了天真和老鼠和蛋白质提取获得准备如前所述[11,12]。

多元分析。测量细胞因子、趋化因子和TNFR MSD鼠标蛋白质含量的促炎V-Plex +工具包(干扰素γ,il - 1β2、il - 4 IL-5, il - 6、il - 10, IL-12p70,处于受控,和肿瘤坏死因子;K15012C中尺度)和鼠标TNF-RI TNF-RII,咆哮,和MCP-1敏感工具包(中尺度),我们使用部门成像仪6000(中尺度发现)板读者根据制造商的指示。样品在稀释剂稀释双重的测量和样本运行前41一式两份(11]。数据分析使用MSD发现工作台软件。

免疫印迹分析。免疫印迹分析Iba1和光)(1:500年,kouichi执行使用18μg蛋白提取分离在4 - 12% SDS - page凝胶(英杰公司)使用拖把SDS(表达载体)含0.25%抗氧化剂(表达载体)基本上如前所述11]。α肌动蛋白(1:100000,微孔)被用来加载控制。SeeBlue prestained标准(英杰公司)被用作分子量标记。乐队量化使用图像实验室软件(Bio-Rad)。分析与老鼠/组和数据被规范化α肌动蛋白和百分比相对老鼠。

控制,两个独立的凝胶是准备在主要的抗体在协议中被省略了。膜的发展显示没有17 kDa的乐队,对应Iba1的大小。

2.11。统计分析

比较是使用重复执行措施(RM)双向方差分析多个紧随其后以及分析(BMS,踏步走,哈格里夫斯测试,和体重变化)、Mann-Whitney或Wilcoxon配对签署等级测试。分析使用Prism 4.0 b软件Macintosh (GraphPad软件)。建立了统计意义。

3所示。结果

3.1。基因消融solTNF不改变运动功能或焦虑性行为

使用开放领域,rotarod Y-maze测试,我们先前证明老鼠显示没有明显的行为异常(12]。这是进一步验证本研究使用EPM测试。我们发现在封闭(图时间1(一)(图)和开放的武器1 (b)),按照项目的总路程之间的可比性和老鼠(图1 (c))。一起我们的研究结果表明,SCI后运动功能不会受先天影响行为表型的变化之间的天真和mTNF老鼠。

3.2。的基因消融solTNF并不影响SCI后病变大小和功能的结果

根据我们之前发现的神经保护作用mTNF [12,16),我们调查是否遗传solTNF的消融老鼠也可以提高功能恢复和减少创伤SCI后组织损伤。在这项研究中,和老鼠被SCI和运动性能在田野里被记录在天1和3,然后每周5周与BMS和得分。我们发现没有BMS分数两基因型间的差异在任何时间点在SCI(最终BMS±扫描电镜;:5.3±1.0;(图:5.3±1.5)2(a))。两种基因型改善随着时间的推移他们的BMS成绩显著。老鼠也评估使用踏步走分析当他们到达5的BMS分数和每周。尽管这两种基因型显示显著变化随着时间的推移,没有观察之间的差异和老鼠(图2(b))。使用哈格里夫斯测试热痛觉过敏测试。尽管发现的痛觉过敏都随着时间的显著变化和观察小鼠,基因型之间没有差别(图2(c))。最后为了研究基因消融的效果solTNF一般活动和焦虑性行为SCI后,和老鼠接受开放的现场试验SCI(补充图后35天网上,补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/2684098)。我们没有发现差异总路程(补充图在老鼠的速度),(补充图B),在饲养的数量(补充图C),或数量的区域变化(,:45.0±33.9;:37.5±31.2),证明mTNF足以维持运动功能。同时,梳理(补充图D)和排尿(补充图/周长比值(E)和中心比率::0.08±0.09%;:0.06%±0.10)之间的可比性和老鼠,只有粪便的数量两个基因型(补充图之间的差距显著F)。根据这些数据,我们观察到病灶大小(数据的病例中没有区别2(d) -2(f))或MBP的百分比⁺白质区(:48.6%±10.3%;:49.4%±12.0%)之间和老鼠SCI后35天。强烈的GFAP免疫反应性检测基因型的病变和周围的白色物质,表明胶质疤痕(图的形成2(g))。

由SCI体重的影响随着时间的推移,但基因型(补充图没有区别G)。

3.3。SCI后基因消融solTNF降低TNF水平

我们先前表明TNF却降低了小鼠相比控制实验中风后(12]。SCI后,基因消融solTNF还脊髓肿瘤坏死因子影响显著(图3(a))。肿瘤坏死因子显著增加老鼠相比,天真的条件相比显著增加老鼠SCI后3天,而TNF SCI后呆在基线水平老鼠(图3(a))。

TNFR1(图3(b)和TNFR2(图)3(c))也显著影响的脊髓和老鼠。我们发现,在两种和老鼠,TNFR1 TNFR2显著增加,脊髓损伤后3天SCI天真的条件相比,但基因型之间无显著差异(数字3(b)和3(c))。然而,TNFR1和TNFR2有倾向减少TNFR1 ()和TNFR2 ()水平相比老鼠SCI后3天。

3.4。基因消融mTNF并不影响神经炎症的损伤脊髓SCI后3天

il - 10(图3(d)), il - 1β(图3(e))和il - 6(图3(f))显著增加和老鼠SCI后3天而天真的条件,但由于基因型之间没有显著差异。然而,有一个倾向增加il - 10 ()和降低il - 1β()相比老鼠SCI后3天。IL-5(图3(g))显著增加,仅在3天而天真的条件老鼠(图3(h)),而只有- 2显著增加老鼠(图3(h))。干扰素γ和il - 4蛋白水平没有影响SCI后3天(没有显示)。

处于(图3(我))和CCL2(图3(j)是显著损伤脊髓的调节和老鼠SCI后3天而天真的条件,而CCL5的增加(图3(k)没有达到统计学意义。在处于没有差异,CCL2, CCL5观察之间和老鼠(图3(我)3(k))。

3.5。的基因消融solTNF并不影响单核细胞/巨噬细胞渗透到损伤脊髓SCI后3天

我们曾表明,单核细胞/巨噬细胞渗透到大脑缺血性却降低了小鼠局灶性脑缺血后24小时相比老鼠(12]。在此基础上,我们对小胶质细胞(CD11b⁺ 细胞,巨噬细胞(CD11b⁺ Gr1一起⁻)、粒细胞(CD11b⁺CD45Gr1一起⁺)和T细胞(CD45⁺CD3⁺SCI)人口3天后使用流式细胞仪(数字4(一)和4 (b)总数(图),没有发现差异4 (c))和百分比(图4 (d))之间的和老鼠。作为CD45 MFI值小胶质细胞已被证明是影响XPro1595和服用依那西普治疗实验性中风后,指示激活增加了这些细胞(25),我们也调查CD11b和CD45 MFI水平小胶质细胞,巨噬细胞和粒细胞SCI后3天(数字4 (e)和4 (f))。然而,基因型之间没有区别在MFI CD11b(图的水平4 (e))或CD45(图4 (f)在任何细胞的人口调查)。

3.6。的基因消融solTNF并不影响活化的小胶质细胞和白细胞3,SCI后35天

为了进一步调查是否基因消融solTNF小胶质细胞的激活状态和浸润细胞的影响,我们进行了流式细胞仪和寻找细胞数量的变化和MFI MHCII CD11c(图5)损伤和perilesion地区(近端和远端损伤)。这一发现的可比数字(图5(一))和百分比(图5CD11b (b))⁺ 小胶质细胞和CD11b⁺ 细胞的发现支持solTNF并不影响SCI后小胶质和白细胞招聘。为了调查基因影响的solTNF消融是否激活状态,CD11b⁺ 和CD11b⁺ 人口是subgated调查MHCII(数字5(d) -5(f))和CD11c(数字5(g) -5(我)表达式。无论是CD11c还是MHCII被发现在小胶质细胞人口在这个时间点(数据5(d)和5(g))。相比之下,MHCII(图5(d)和CD11c(图)5(g)) CD11b表达增加⁺ 细胞类似的数字(数字5(e)和5(h))和表达水平(数字5(f)和5(我)基因型之间。MHCII的数量⁺和CD11c⁺细胞和病变中的表达水平显著增加面积perilesion相比。CD11c只有在MHCII表达CD11b找到⁺ 细胞(图5(j))。在这些数据的支持,MHCII的百分比⁺,CD11c⁺,MHCII⁺CD11c⁺细胞病变区域的基因型(图之间的可比性5(k))。最后,Iba1蛋白表达了SCI后3天用免疫印迹分析(图5(左))。然而,我们没有发现差异之间的表达水平和老鼠支持流仪分析,证明遗传消融solTNF并不影响小胶质细胞的激活状态和浸润细胞SCI后3天。

我们也评估小胶质细胞/巨噬细胞激活后35天SCI F4/80组织化学染色、CD45、Iba1。我们观察到F4/80的分销或数量的病例中没有区别⁺(图6(一))、CD45⁺(图6 (b)),或者Iba1⁺(图6 (c))细胞之间和老鼠。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们发现基因solTNF消融,但mTNF持续表达,并不影响功能结果和SCI后病灶大小。这些发现与以往发表论文证明基因消融肿瘤坏死因子(15)和系统性管理anti-TNF拮抗剂,如XPro1595 [16和道16,17),不影响损伤体积或改善SCI后的功能结果。然而,研究结果也与我们自己的最近的研究表明选择性中央solTNF神经,抑制小鼠治疗硬膜外,连续3天XPro1595显示改善功能结果,降低病变大小和温和的SCI后改变神经炎症(16]。损伤脊髓内肿瘤坏死因子达到峰值水平在第一SCI后1 - 2小时(1- - - - - -4)和海拔solTNF是(综述[急性神经炎症的标志26]),可能通过抑制solTNF,使用连续3天XPro1595神经,而抑制solTNF持续一段时间(每3天35天或TNF^−−/和mTNF老鼠)不是。这是由最近的假设,在正常生理条件下solTNF信号对突触缩放(综述[很重要26为本次]),因此也可能。在目前的研究中,我们观察到一个倾向减少TNFR1和TNFR2表达式的脊髓老鼠SCI后3天,可能由于solTNF水平降低。使用XPro1595 solTNF药理堵塞,导致持续TNFR2损伤线和TLR4的表达增加,当实施硬膜外16),它是可能的,为了获得改进的功能恢复和减少受伤SCI后,维持或增加本地TNFR2表达式是一个先决条件。这是由研究小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(运算单元),多发性硬化的动物模型,mTNF与维修和有关remyelination通过oligodendroglial TNFR2 [27),而solTNF的不利影响与TNFR1相关信号(8,28]。最后,也有可能,肿瘤坏死因子表达的基因改造,如肿瘤坏死因子^−−/和老鼠,导致未知的表型修改的老鼠乍一看可能不明显。尽管行为表型似乎并未改变肿瘤坏死因子的老鼠是这样^−−/老鼠(29日,30.)和转基因肿瘤坏死因子模型之间差异的研究结果和研究使用anti-TNF疗法中遇到其他中枢神经系统模型,包括为局灶性脑缺血模型和多发性硬化症(了8,31日])。解释这些差异到目前为止仍然是未知的,需要进一步研究不同的功能性角色solTNF mTNF和信号通过TNFR1与TNFR2的重要性。

我们还观察到一个倾向CCL2表达的减少老鼠SCI后3天。CCL2是一个单核细胞趋化蛋白和巨噬细胞反应的重要调节器(32]。其表达式是调节大鼠脊髓组织SCI后第一个24小时内(33),以及从SCI患者血清样本34]。尽管我们之前发现减少浸润的单核细胞/巨噬细胞缺血性脑在我们老鼠,我们没有观察到不同浸润的巨噬细胞之间的SCI后3天和mTNF老鼠。我们也没有观察到任何小胶质细胞的激活状态的差异或渗透细胞,作为CD11b MFI水平,CD45, MHCII, CD11c Iba1蛋白表达是基因型之间的可比性SCI后3天。巨噬细胞浸润和小胶质激活峰值SCI后第七天(35];因此在小胶质细胞/巨噬细胞可能改变被认为发生在SCI后以后,这或许可以解释为什么我们在目前的研究没有观察到任何浸润的巨噬细胞数量的变化。发现处于受控,中性粒细胞化学引诱物趋化因子,没有差异和老鼠是中性粒细胞与之前的数据显示,这是已知的渗透到早期(伤后1天达到顶峰)[35)之间的可比性和老鼠。

il - 1的表达β促炎细胞因子,增加SCI后第一个几个小时内(4]在浸润淋巴细胞和白细胞的外观36),和直接注射il - 1β到脊髓增强血管通透性和淋巴细胞招聘(37]。在目前的研究中,有一个倾向降低il - 1β表达老鼠SCI后3天。在il - 1α/β^−−/老鼠、运动活动和损伤面积显著提高SCI后,这一过程被认为是由减少炎症反应,包括降低TNF表达(38]。我们先前已经表明,il - 1β蛋白质含量减少老鼠实验中风后,伴随着减少梗塞卷(12),通过增加表达的天然小胶质细胞产生il - 1受体拮抗剂(IL-1ra),梗死体积可以减少实验中风后(39]。il - 1的毒害神经的效果β对病灶体积,因此其有害影响,依赖于平衡il - 1和IL-1ra急性中枢神经系统损伤后(39),可能在我们的条件下充分增加IL-1ra不发生,因此降低il - 1β表达我们的老鼠不足以提高功能恢复和减少损伤的大小。

il - 10是一种强力抗炎细胞因子,这已经被证明可以减少炎症和组织损伤的发展与科学相关的(40]。il - 10也已被证明能够降低il - 1β(41)和肿瘤坏死因子(42在SCI的鼠模型,进而减少炎症,降低神经损伤,和提高功能恢复。在我们的研究中,我们观察到一个倾向降低il - 10的水平,而TNF和il - 1β是减少,没有改善功能结果SCI后35天。研究由Bethea et al。(42和冷藏室等。41)是在老鼠,老鼠和我们是有可能是物种差异占差异。我们的研究结果符合由亚伯拉罕et al。43]显示更大的破坏在早期时间点(1和7天)在SCI后il - 10^−−/老鼠但没有差异在SCI后14天。明显的早期损伤观察il - 10^−−/老鼠增加了一倍,在外围中性粒细胞(43),建议改变先天免疫反应损伤。尽管增加了il - 10的发现SCI后3天,我们没有看到任何不同浸润的巨噬细胞和中性粒细胞。在SCI后35天,我们没有检测CD45的差异⁺,F4/80⁺,或者Iba1⁺小胶质细胞/巨噬细胞。然而,应该注意的是,这些观察是基于定性免疫组织化学和进一步定量分析应该执行为了达成是否受遗传影响白细胞浸润后solTNF SCI的消融。

总之,我们的研究中,使用转基因小鼠表达只有TNF的膜结合形式,证明没有solTNF并不影响病变大小和功能的结果,但表明mTNF促进损伤脊髓的抗炎环境,可能更有利于功能恢复。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Ditte国务秘书Ellman和凯特吕克Lambertsen构思研究,设计实验,进行统计分析,写论文。Ditte国务秘书Ellman,玛蒂尔达Degn明娜克里斯琴森隆德,贝蒂娜Hjelm克劳森,汉斯克Novrup,西蒙•Bertram Flæng路易丝Helskov Jørgensen, Lujitha Suntharalingam, Asa Fex Svenningsen,和Brambilla罗伯塔进行实验和分析和解释数据。所有作者阅读和批准最终的手稿。玛蒂尔达Degn,明娜克里斯琴森隆德,贝蒂娜Hjelm克劳森同样起到了推波助澜的作用。

确认

这项工作得到了嘉士伯基金会(2007 _01_0176),截瘫的国际基础研究(P128),丹麦截瘫病协会(RYK),西蒙丰纳这样哈特曼的Familiefond(凯特吕克Lambertsen) Overlægeradets Legatudvalg,欧登塞大学医院,Fonden直到Lægevidenskabens Fremme,香港基督教X的喜欢,分子医学研究所信号分配装置,卫生教师信号分配装置(Ditte国务秘书Ellman),国家卫生研究院研究所资助NS084303-01A1 1 r01ns094522-01,迈阿密项目治愈瘫痪(Roberta Brambilla)。作者承认提供的技术援助Dorte Lyholmer,乌拉Damgaard芒克,凯伦有钱,有的符号玛丽安徒生。作者还感谢塞奇威克博士授予使用许可老鼠和Tacchini-Cottier博士(Lusanne大学生物化学系,瑞士)的纯合子的捐赠育种对。

补充材料