文摘

减少Th1 / Th2比率是脓毒症免疫抑制的主要特征之一。两种膜粘附蛋白Annexin-A1 (ANXA1)和转录因子GATA-3已报告在T细胞分化发挥着重要作用。然而,ANXA1之间的关系和GATA-3 Th1 / Th2转变是未知的。我们的研究调查的交互影响ANXA1 GATA-3影响CD4 T细胞分化+T细胞。我们发现GATA-3和ANXA1 coexpressed Th0 / Th1 / Th2细胞质和核。过表达ANXA1显著增加干扰素的表达γ在T细胞和降低il - 4的表达,而ANXA1-silenced T细胞表现出降低干扰素的生产γ和增加il - 4的生产。可拆卸的GATA-3 ANXA1提升更高的表达水平和低水平的T-box转录因子(T-bet / Tbx21)。进一步的研究表明,ANXA1监管GATA-3表达式通过甲酰肽受体1 (FPRL-1)下游信号通路ERK和PKB / Akt。这些结果表明,ANXA1调节GATA-3 / T-bet表达诱导Th0 Th1分化。此外,我们发现GATA-3抑制ANXA1表达式绑定到其首次启动子。提出ANXA1之间的交互和GATA-3可能提供线索了解免疫抑制和有潜力作为新的治疗目标在免疫治疗脓毒症。

1。介绍

最近的临床和实验研究表明,长期影响严重的炎症活动通常包括免疫系统的抑制功能。Th1 / Th2比率的降低脓毒症(免疫抑制的主要特征之一1]。据报道,膜粘附蛋白Annexin-A1 (ANXA1)和转录因子GATA-3,这都降低脓毒症患者(2,3),Th1 / Th2转变[中扮演很重要的角色4]。许多研究者研究了ANXA1 GATA-3,分别,但ANXA1和GATA-3之间的关系仍然是未知的。探索ANXA1之间的交互和GATA-3可能提供线索了解免疫抑制和改善脓毒症患者的治疗效果。

作为一个抗炎蛋白,ANXA1在先天免疫系统具有自我平衡的作用通过调节免疫细胞,如中性粒细胞和巨噬细胞(5]。内源性ANXA1明显减少白细胞粘附postcapillary小静脉通过甲酰肽受体(玻璃钢)途径6]。此外,ANXA1促进炎症细胞凋亡与瞬态细胞内钙的崛起和caspase-3激活。此外,ANXA1最近被确定为“吃我”的信号对凋亡细胞识别和吞噬细胞吸收的7]。研究的表达ANXA1在人类和小鼠白细胞已经表明,这种蛋白质也表达在细胞水平较高的适应性免疫反应,如T和B淋巴细胞(8- - - - - -10]。进一步的研究表明,ANXA1增加T细胞激活和支持他们的Th1细胞分化调节T细胞受体(TCR)信号4]。此外,分析ANXA1的炎症反应−−/老鼠却展现出了精致的ANXA1在识别信号的调制玻璃钢家庭(11]。这些发现表明潜在作用ANXA1 / FPRL-1通路的适应性免疫反应。

在抗原刺激的细胞抗原呈递细胞,天真的CD4细胞+T细胞至少可以区分两种不同类型的T帮手,Th1、Th2细胞,参与适应性免疫记录(12]。期间有选择地调节转录因子GATA-3 Th2分化在体外(13,14]。GATA-3不仅是重要的transactivation Th2细胞因子的基因,但同时也抑制Th1发展(15]。GATA-3-deficient细胞不能产生T细胞谱系的细胞(16]。在活的有机体内实验从ANXA1−−/老鼠表现出ANXA1-deficient T细胞表达Th2扭曲(17]。然而,没有足够的证据来支持GATA-3和ANXA1之间的相互关系。

在我们之前的研究中,ANXA1的表达式和GATA-3都减少烧鼠标与脓毒症(18]。本研究的目的是调查是否ANXA1和GATA-3相互作用影响T淋巴细胞的免疫反应,以及探索可能的分子机制。我们的结果表明,过表达ANXA1(或GATA-3)压制GATA-3的表达(或ANXA1),而击倒ANXA1(或GATA-3)增加了GATA-3(或ANXA1)表达式。进一步的研究表明,ANXA1调节GATA-3表达式通过ANXA1 / FPRL-1 / ERK和PKB / Akt信号通路,并且GATA-3调节ANXA1 ANXA1启动子转录活动绑定。因此这项研究中,我们一起ANXA1以前的观测,表明ANXA1 / FPRL-1轴和GATA-3的潜在治疗靶点Th1 / Th2-mediated脓毒症的免疫抑制。

2。材料和方法

2.1。试剂

Anti-mouse CD3e(克隆145 - 2 - c11)和Anti-mouse CD28 37.51(克隆)买来BD生物科学(CA)圣何塞。小鼠2、il - 4,干扰素γ、白介素anti-IL-4(克隆11 b11),和anti-IFNγ(克隆XMG1.2)从eBioscience购买(英国温布利)。Anti-mouse GATA-3、道达尔和磷酸化ERK1/2和AKT购买从细胞信号(丹弗斯,MA)。Anti-T-box转录因子(T-bet / Tbx21)从Abcam购买(英国剑桥),anti-FPRL-1购买罗福斯(美国科罗拉多州),并从Proteintech anti-ANXA1购买(英国曼彻斯特)。除非另有规定,所有其他试剂来自Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州)。

2.2。老鼠

公里的雄性老鼠的重量~ g从实验动物部,中南大学(长沙,中国)。动物工作已经执行根据批准的伦理湘雅医院,中南大学。

2.3。细胞培养

老鼠与戊巴比妥钠麻醉(40 - 50毫克/公斤腹腔内(i.p)]。他们的脾是嘲笑做单细胞悬架和沾APC-conjugated anti-CD4。然后CD4+细胞纯化的流式细胞仪(BD咏叹调III)。孤立的天真的CD4细胞+1×10 T细胞(> 95%6/ 6井)培养在RPMI 1640 (GIBCO,大岛,纽约)完全培养基。T细胞的培养条件如下:Th0: anti-CD3 / CD28 (5μ50 g / mL)和2 (U /毫升);Th1: il - 12 (2 ng / mL), 2 (50 U /毫升)和抗il - 4 (20μg / mL)和Th2: il - 4 (1000 U /毫升),2 (50 U /毫升)和anti-IFNγ(10μg / mL)。

2.4。向量构造和慢病毒生产

ANXA1序列和GATA-3超表达是人工合成和克隆到PLV (Exp) Puro-IRES-EGFP向量(Cyagen、广州、中国)。

干扰慢病毒(富裕iX1 Puro-eGFP向量)与ANXA1 GATA-3构造。三个候选人shRNA序列针对ANXA1和GATA-3被Cyagen设计和合成。293年所有病毒包装进行cotransfection后t细胞。慢病毒建筑都使用了脂质转染2000试剂(表达载体)。病毒收获转染48 h后,病毒滴度测定。

2.5。细胞转染

上述构造慢病毒与最优稳定转染到T细胞感染复数(MOI) 100你/毫升刺激后anti-CD3 / CD28 (5μg / mL) 24 h。调节(下调)表达式ANXA1和GATA-3证实了存在和免疫印迹(见补充图 在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/1701059)。shRNA序列的最大效率超过75%击倒被选为进一步稳定ANXA1在T细胞GATA-3沉默。最有效的ANXA1 shRNA序列建立了三如下:(shANXA1-3) 5′-GAGATCTGGCCAAAGACATAA-3′;(anti-shANXA1-3) 5′-TTATGTCTTTGGCCAGATCT-3′。最有效的GATA-3 shRNA序列建立了三如下:(shGATA-3-2) 5′-GCTCAGTATCCGCTGACGGAA-3′;(anti-shGATA-3-2) 5′-TTCCGTCAGCGGATACTGAGC-3′。

2.6。细胞因子ELISA

Th0细胞( /毫升),之后获得感染UPANXA1和培养Th0条件完全RPMI中七天,刺激了佛波醇12-myristate 13-acetate (PMA) 10 ng / mL, ionomycin 1μ为4 h g / mL 6-well板块产生细胞因子(18]。对干扰素文化上层的收集和分析γ和il - 4。他们测量反映Th1 / Th2反应。干扰素的γ和il - 4水平衡量ELISA试剂盒购自Multi-Sciences(中国)。分析是根据制造商的协议。

2.7。RNA提取和实时PCR

执行中存在的表达水平来确定GATA-3, T-bet, ANXA1。总RNA提取使用简单执行P总RNA提取工具包(Bioflux、欧洲)。互补脱氧核糖核酸合成进行了使用一体化™合成第一链cDNA工具包(美国马里兰州GeneCopoeia)。互补脱氧核糖核酸被用来建立一个定量实时PCR (qPCR)反应使用一体化qPCR混合(GeneCopoeia)。GATA-3的表达水平,ANXA1 T-bet规范化肌动蛋白。引物序列如下:鼠标GATA-3正向引物:5′-GCTGGATGGCGGCAAAG-3′,鼠标GATA-3反向引物:5′-GTGGGCGGGAAGGTGAA-3′,鼠标ANXA1正向引物:5′-AAGGTGGTCCTGGGTCAGC-3′,鼠标ANXA1反向引物:5′-TGAGCATTGGTCCTCTTGGT-3′,鼠标Tbx21 / T-bet向前引物:5′-ATGTTCCCATTCCTGTCCTTCA-3′,鼠标Tbx21 / T-bet反向引物:5′-AAATGAAACTTCCTGGCGCATC-3′,鼠标肌动蛋白正向引物:5′-CATCCTGCGTCTGGACCTGG-3′,和鼠标肌动蛋白反向引物:5′-TAATGTCACGCACGATTTCC-3′。所有协议都是根据制造商的说明进行。每个样本一式三份。

2.8。西方墨点法

总蛋白提取使用裂解缓冲。30μg蛋白,sds - page分离转移到PVDF膜,和杂化主要抗体horseradish-conjugated二级抗体紧随其后。检测β肌动蛋白在同一膜用作加载控制。

2.9。免疫荧光染色

Th0 Th1 / Th2细胞洗了冰冷的PBS和4%多聚甲醛固定。与0.1% Triton x - 100细胞permeabilized孵化2%牛血清白蛋白为30分钟,其次是主GATA-3抗体和ANXA1在一夜之间在4°C。幻灯片的细胞随后被孵化与相应的Alexa萤石488 -共轭二次抗体在室温下1 h。核与DAPI染色为3分钟。样本检验分析GATA-3和ANXA1的表达。

2.10。子双荧光素酶报告实验

GATA-3的囚禁(nm - 001002295)和控制郁积的质粒是来自Vigene生物科学(罗克维尔市,医学博士,美国)。PGL3增强器向量和PRL-TK向量获得Promega (WI麦迪逊,美国)。ANXA1 (NM00200.2)启动子区域2000个基点碱基对和萤火虫荧光素酶报告基因被建于PGL-3增强器向量和renilla荧光素酶报告基因建于PRL-TK向量。renilla荧光素酶质粒被用在所有的实验规范化转染的效率。瞬时转染293 t细胞表现如前所述。简单地说,在转染的日子,5×104细胞被镀在100年μL在每个96的脑袋前孵化与VigeneFection(位于马里兰州Rockville Vigene,)复合物根据制造商的指令使用的0.3μ0.9 g DNA和μL VigeneFection。在转染后48 - 72小时,细胞在20个细胞溶解μL记者裂解缓冲(Promega,麦迪逊,WI) 15分钟在冰上。添加100μL荧光素酶检测试剂二世(Promega)和记录萤火虫荧光素酶活性测定。然后添加100μL STOP &如果®试剂(Promega)和阅读renilla荧光素酶活性测定。至少三个独立的实验和数据提出了均值±SEM。

2.11。统计分析

所有数据被当作意味着±SEM和分析学生的 以及。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。ANXA1 CD4和GATA-3表达+T细胞

探索ANXA1的表达和/或GATA-3 Th0, Th1、Th2细胞,免疫荧光法进行了证实ANXA1 GATA-3表达式是位于细胞核和细胞质(图1)。

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图1
ANXA1 Th0 GATA-3表情,Th1、Th2和定位在细胞质和细胞膜。(一)免疫荧光分析ANXA1表情Th0, Th1、Th2。免疫荧光法进行了使用绿色荧光标记辅助anti-ANXA1。细胞核与DAPI染色。(b)免疫荧光分析GATA-3表情Th0, Th1、Th2。免疫荧光法进行了使用绿色荧光标记辅助anti-GATA-3。细胞核与DAPI染色。
3.2。ANXA1调节GATA-3 / T-bet表达式

确定的角色中内源性ANXA1 GATA-3和T-bet表达之间的平衡,两个主要的转录开关Th1 / Th2分化,我们研究了T细胞的分化,这是由过表达ANXA1在Th0条件下的强度。幼稚T细胞从老鼠感染UPANXA1病毒和在Th0培养基培养7天,紧随其后的是接触PMA (10 ng / mL)和ionomycin (1μ为4 h g / mL)刺激Th1 / Th2细胞因子的生产(1]。UPANXA1显著增加干扰素的表达γ和减少在T细胞表达il - 4,相比之下,那些感染了放弃你的控制( ,图2)。ANXA1-silenced T细胞表现出降低干扰素的生产γ和增加大约50%更高的il - 4的生产,而T细胞感染down-control ( ,图2)。这些结果表明,ANXA1诱导Th0 / Th1细胞分化,而细胞感染沉默ANXA1提升Th0 / Th2细胞分化。

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图2
ANXA1调节CD4细胞的分化+T细胞在Th0条件。CD4+T细胞被感染ANXA1 ANXA1下来慢病毒Th0条件和重振PMA 10 ng / mL, ionomycin 1μ为4 h g / mL。然后Th1(干扰素γ)或Th2细胞因子(il - 4)产量来衡量。值意味着±SEM 。 。 。

的重要角色GATA-3 / T-bet影响T细胞谱系分化的成Th1、Th2效应细胞被广泛接受(19,20.]。我们假设ANXA1可以调节GATA-3 / T-bet表达影响Th1 / Th2分化。如图3,结果表明,ANXA1-silenced T细胞表达高水平的GATA-3 T-bet水平低,与控制和UPANXA1组( )。

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图3
ANXA1调节GATA-3和T-bet Th0条件表达式。CD4+T细胞被感染ANXA1 ANXA1下来慢病毒状况Th0然后刺激anti-CD3 / CD28 (5.0μg / mL) 8 h分析T-bet和GATA-3表达的实时PCR (a, b)和西方螺栓(c)。 。
3.3。ANXA1通过FPRL-1信号通路调节GATA-3表达式

FPRL-1是ANXA1受体之一。考虑到ERK和PKB / Akt FPRL-1两大下游转录因子,我们进一步研究了FPRL-1信号通路的作用在GATA-3 ANXA1的规定。结果表明,ANXA1显著磷酸化ERK和PKB / Akt,而击倒ANXA1减少ERK和Akt激活。FRRL-1的表达水平在所有的群体,不管ANXA1状态,没有明显不同(图4)。

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图4
ANXA1调节GATA-3表达式通过ERK和AKT通路。CD4+T细胞被感染ANXA1 ANXA1下来慢病毒状况Th0然后刺激anti-CD3 / CD28 (5.0μg / mL) 8 h分析FPRL-1, ERK和Akt表达式通过免疫印迹。
3.4。GATA-3调节ANXA1 CD4的表达+T细胞

调查的影响GATA-3在CD4 ANXA1表达式+T细胞CD4+细胞与不同GATA-3表达水平。如数据所示5(一个)和5 (b),过表达GATA-3抑制ANXA1蛋白质和mRNA表达,而沉默GATA-3 ANXA1的表达增加。

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图5
GATA-3调节ANXA1在Th0条件表达式。CD4+T细胞被感染GATA-3 GATA-3下来慢病毒状况Th0然后刺激anti-CD3 / CD28 (5.0μg / mL) 8 h ANXA1表达式分析实时PCR (a)和西方螺栓(b)。双荧光素酶检测后显示增加的GATA-3转染293 t细胞(c)。 。 。
3.5。GATA-3调节ANXA1表达式通过绑定ANXA1在293年启动子t细胞

作为转录因子,GATA-3介导ANXA1通过ANXA1子表达式。ANXA1启动子区域约2000英国石油公司被发现在真核生物启动子数据库和UCSC基因组生物信息学。JASPAR数据库被用来预测绑定域与GATA-3 ANXA1启动子。结果建议GATA-3可以结合ANXA1发起人AGATAAGA(开始- 281结束- 274)地区的核酸序列。面积与锌指GATA-3壁橱的C末端结合共识DNA序列区(A / T)叫(A / G) (21]。来验证这个假设,ANXA1启动子区域(2000个基点)和荧光素酶报告基因被建于PGL-3增强器向量和renilla荧光素酶报告基因建于PRL-TK。三质粒GATA-3囚禁,ANXA1子PGL3 PRL-TK转染293 t细胞。如图5 (c)荧光素酶活性显著增加,相比之下,up-controls cotransfected UPGATA-3时。这些结果说明GATA-3 ANXA1启动子结合抑制其表达在293 t细胞。

4所示。讨论

脓毒症的定义是一个系统性感染的炎症反应。过度炎症反应包括释放细胞因子风暴和大量T细胞的活化是早期脓毒症的特点(22]。尽管他们杀死病原体的能力,但他们同样有效地诱导细胞和组织损伤23]。一方面,可以保护细胞激素风暴通过激活宿主抗炎proresolving响应(24]。另一方面,在脓毒症中,T细胞激素风暴引发过度激活诱导细胞死亡(上市);上市的原因是细胞周期的异常项目(25]。增强抗炎反应,表现为大量的T细胞凋亡和减少响应性抗原或有丝分裂原,导致免疫抑制。

免疫抑制后严重脓毒症仍然是死亡的主要原因(26]。更多的病人死在免疫抑制阶段,继发感染的风险增加。抗炎治疗可以提高患者的生存率hyperinflammatory地位,尽管它可能更糟糕的是如果在sepsis-induced应用免疫抑制27]。免疫反应的传统理解post-sepsis涉及一个远离Th1反应转向Th2反应(1]。低比例的Th1 / Th2免疫抑制的特征(28]。促进低比率的Th1 / Th2免疫反应Th1扭曲可能是一个治疗免疫抑制。

研究表明,ANXA1在先天免疫系统是一种内源性抗炎因子(6,29日]。越来越多的证据表明,ANXA1在监管中扮演一个重要的角色的适应性免疫反应。ANXA1可以调节Th1 / Th2分化通过激活细胞信号(4,30.]。符合上面的研究,我们发现过表达ANXA1诱导分化的Th1 / Th2 Th1扭曲与增加干扰素γ并降低il - 4细胞因子表达。Th1 / Th2细胞分化的过程中,另一个重要因素是GATA-3。作为一个特定转录因子的Th2 [14在pre-T], GATA-3激活细胞信号和促进CD4细胞+T细胞谱系分化后积极的选择(31日]。

许多研究和我们先前的研究已经发现,兔子ANXA1等离子体水平下降和严重脓毒症患者(2,32]。另一项研究表明低表达水平的GATA-3在脓毒性休克3]。然而,报告ANXA1之间的相关性和GATA-3是有限的。我们之前的动物模型观察到ANXA1在老鼠和GATA-3都呈现相同的下降趋势严重脓毒症(18,33];这种现象可能与大量T细胞凋亡有关。但它们之间的具体调控机制还不清楚。本研究的主要发现是转录因子的发现小说角色GATA-3监管ANXA1在适应性免疫反应和相互调节的分子机制导致免疫抑制炎症过程。

我们的研究结果表明,表达ANXA1和GATA-3都位于Th0 Th1、Th2细胞细胞核和细胞质。Oliani等人也发现ANXA1嗜酸性粒细胞胞质中表达和核34]。进一步研究显示,过表达内源性ANXA1施加影响的衰落GATA-3表达和增加T-bet表达,这可能是原因之一ANXA1诱导分化的Th1 / Th2 Th1扭曲。一个观点认为ANXA1调节Th1 / Th2分化促进T细胞激活(4,30.]。但是另一个研究发现T cell-expressed ANXA1抑制T细胞的激活适应性免疫反应(35]。我们的观点是,T细胞分化成各种亚型根据环境信号(36],ANXA1调节通过调节T细胞分化转录因子。

众所周知,ANXA1是FPRL-1内源性配体之一,属于G protein-coupled受体家族的成员。外生ANXA1蛋白质,其n端肽Ac2-26激活ERK演示在体外和在体外(37]。

据报道,ERK抑制许多T细胞分化相关的转录因子,包括GATA-3和FOXP3在T细胞(33,38]。有趣的是,一些研究表明,ERK-MAPK级联控制GATA-3稳定通过泛素/ proteasome-dependent通路。这些研究进一步验证激活的重要角色ERK-MAPK GATA-3磷酸化级联,其ubiquitin-mediated通过26 S蛋白酶体降解[39]。所以ERK-MAPK GATA-3激活与稳定是至关重要的,以避免GATA-3刺激T细胞过度表达。同时,ERK通路也是必不可少的T细胞增殖和Th1扭曲诱导Tbx21表达式(33]。Akt是GATA-3磷酸化酶激酶的活化Akt1诱发脱抑制Tbx21和干扰素γTh2细胞中表达。一种蛋白激酶磷酸化GATA-3和诱发Hdac2的离解GATA-3复杂,导致失败的镇压干扰素γTh2细胞中表达。这些发现强调GATA-3的关键作用的转录后的修改,这是一种负反馈调节机制的Th2时避免过度差异化Th2细胞(40]。因此,提出增强ANXA1调节GATA-3表达诱导Th1 / Th2转变ERK和PKB / Akt影响炎症反应和平衡早期促炎作用。

在这项研究中另一个有趣的发现是,GATA-3也下调ANXA1 CD4的表达+T细胞。进一步的研究表明,GATA-3施加transcriptional-level控制结合的启动子ANXA1在293 t细胞。这在CD4实验需要验证结论+T细胞,决定进一步通过电泳迁移率改变分析或染色质免疫沉淀反应。

在脓毒症早期阶段,细胞触发GATA-3 upregulation通过PI3K-mTOR依赖途径(41]。此外,GATA-3建议调解notch信号是重要的促进T细胞的发展和扩散42]。在我们的研究中,如果我们表达下调GATA-3表达式,ANXA1表达水平增加。一方面,它可以汇Th1 / Th2向Th2扭曲,防止免疫抑制。另一方面,作为抗炎蛋白,ANXA1可以平衡早期促炎作用。

在免疫抑制阶段,GATA-3是一个潜在的复苏的标志(3]。如果我们移植GATA-3表达式,ANXA1减少的表达水平。GATA-3可以加强细胞活化提高适应性免疫(43)和减少ANXA1在一定程度上可以减少抗炎反应更好的照顾病人。

总之,我们的研究结果表明,GATA-3结合ANXA1启动子区域抑制ANXA1表达式和函数。ANXA1-mediated GATA-3 T-bet可能有利于Th1分化通过ERK和AKT通路,扭转趋势表现为Th2免疫抑制的扭曲。基于Th1 / Th2中介,我们的发现可能会提供一个潜在的治疗脓毒症后免疫抑制。

缩写

ANXA1: Annexin-A1
T-bet (Tbx21): T-box转录因子
识别: T细胞受体
玻璃钢: 甲酰肽受体
FPRL-1: 甲酰肽受体1
PMA: 佛波醇12-myristate 13-acetate
Th0/1/2: 辅助T 0/1/2类型。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金的资助中国没有。81272091)。

补充材料

上调和下调表达的GATA-3 (ANXA1)是由慢病毒,经免疫印迹(A, B)和存在(C, D)。最有效的GATA-3 shRNA序列三GATA-3 2和最有效的ANXA1 shRNA序列三还ANXA1胜任。

  1. 补充材料