文摘

肺癌是世界上最常见的一种癌症。Cylindromatosis (CYLD)是一个deubiquitination酶和有助于RIP1泛素链的降解。本研究的目的是探讨肺癌患者的CYLD水平的分子机制和探索CYLD肺癌发病机制。CYLD的水平被发现在人类肺癌组织和配对paracarcinoma组织通过实时聚合酶链反应和免疫印迹分析。人类肺癌细胞的增殖MTT比色是化验。细胞凋亡和坏死是由流式细胞仪测定。结果表明,低水平的CYLD检测在临床肺癌标本。三对核被用来降低内生CYLD在肺癌细胞。可拆卸的肺癌细胞的CYLD促进细胞增殖。否则过度CYLD诱导肿瘤坏死因子-α全身的细胞A549细胞和H460细胞死亡。此外,CYLD-overexpressed肺癌细胞治疗10μM的z-VAD-fmk 12小时,结果表明TNF -α全身的细胞坏死明显增强。此外,肿瘤坏死因子-α全身的细胞坏死CYLD-overexpressed H460细胞是由receptor-interacting蛋白1 (RIP-1)激酶。我们的研究结果表明CYLD是一个潜在的人类肺癌的治疗目标。

1。介绍

也称为肺癌,肺癌是一种恶性肺肿瘤发病率和死亡率高不仅在中国而且在世界各地(1,2]。有两种主要类型的肺癌:非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞癌(SCLC) (3- - - - - -5]。非小细胞肺癌的常见类型包括鳞状细胞癌、大细胞癌和腺癌(6]。据报道,几个风险因素导致肺癌的发展,增加肺癌的发生。吸烟是肺癌的主要风险因素的发展。特别是在中国,大约有67%的男性和4%的女性吸烟超过15岁,代表全世界超过三分之一的烟民(7]。除此之外,它的发展将会导致肺癌接触二手烟,氡,砷,铬酸盐,镍、和空气污染,以及放射治疗(8,9]。

触发等程序性细胞死亡的细胞凋亡和坏死在肺癌细胞可以治疗有重要影响。deubiquitinase Cylindromatosis (CYLD),原本被确认为一种肿瘤抑制(10]。抑制CYLD抗细胞凋亡增加了激活NF-kappaB,暗示一个机制,通过这个机制失去CYLD导致肿瘤形成在肺癌细胞(11]。CYLD是调节细胞生存和死亡的关键因素,包括caspase-8-mediated细胞凋亡和caspase-8独立细胞坏死。具体来说,CYLD移除赖氨酸63和线性泛素链从RIP1和提升necroptosis TNF受体信号,这是参与不同的细胞过程的监管,包括炎症、纤维化和癌症。四郎等人报道说,CYLD互动和deubiquitinates TAK1的负调节激活下游MKK3/6-p38alpha /β通路抵抗革兰氏阳性细菌的感染链球菌引起的肺炎(12]。CYLD也抑制炎症和血管细胞增殖和代表一种新颖的目标治疗或预防动脉粥样硬化的13]。王等人发现缺失,BAF57 hBRM-associated因素诱导细胞凋亡刺激cylindromatosis肿瘤抑制基因的表达和表达增加CYLD BT549细胞诱导凋亡[14]。

最近,人们已经发现,家族CYLD q12-q13 16日映射是一个常染色体显性遗传易感性的多个肿瘤皮肤附属物(10,15]。Hellerbrand和卢斯•玛索乌米发现突变或破坏活动的动物CYLD加重急性以及慢性肝损伤和促进发展和肝细胞癌的进展16]。删除的外显子9 CYLD会导致CYLD及其失活的羧基末端截断deubiquitinating活动,已与肺的成熟17]。Downregulation CYLD诱导肿瘤细胞增殖,从而导致肝细胞癌的积极增长(18]。Hayashi等人发现,促进乳腺癌转移通过NF-kappaB差别CYLD对这些基因的激活,包括RANKL信号(19]。然而,CYLD在肺癌中的作用不明确澄清。在目前的研究中,我们探讨的作用在人类肺癌标本和CYLD CYLD的分子机制研究的进展和发展人类肺癌。

2。材料和方法

2.1。病人

这项研究是在一段时间内进行的24个月从2012年5月到2014年5月。共19例(11男8女)被包括在研究年龄中位数为76.53年(范围49 - 76年)。所有患者都得到了精确的非小肺癌的病理诊断。样本来自手术和病人没有给予放疗或化疗。新鲜的组织很快被冻结在液体N₂和保存在冰箱−80°C,这是用于检测CYLD表达式通过实时聚合酶链反应和免疫印迹分析。肺癌标本和配对paracarcinoma组织获得福建省自愿的病人的医院。患者见多识广,签署了相关合同实验前和实验得到福建省医院伦理委员会的批准。

2.2。细胞系和代理

人肺腺癌A549细胞行(猫。TcHu150)和大细胞肺癌细胞系H460(猫。TcHu205)是购自上海生命科学研究院细胞资源中心,中国科学院。肺癌细胞的培养与10%胎牛血清的DMEM培养基,链霉素青霉素1%,和1%。三双CYLD核和消极控制核从反弹道导弹公司购买(里士满,公元前,加拿大)和i505598目录编号。RIP-1 siRNAs设计和变形成岛公司,上海,中国。的序列siRNAs具体RIP-1使用如下:人类RIP1: 5′-UGCUCUUCAUUAUUCAGUUUGCUCCAC-3′;人类RIP1: 5′-UGCAGUCUCUUCAACUUGAAdTdT-3′。麻省理工代理购买从σInc .(σ,圣路易斯,密苏里州)。pcDNA3 (+) / CYLD-flag质粒和消极控制质粒pcDNA3.1(+)保存在我们的实验室。半胱天冬酶抑制剂carbobenzoxy-valyl-alanyl-aspartyl - [O-methyl] -fluoromethylketone (z-VAD-FMK)获得Promega公司G7231目录编号。重组人肿瘤坏死因子-α(猫。10602 - hnae - 10)数量由158个氨基酸分子质量为17.4 kDa,来自中国生物公司(中国,北京)。Necrostatin-1(猫。N9037-10MG)从σ公司购买数量。

2.3。实时PCR测定CYLD检测

从肺癌组织标本和成对paratumor组织准备如上所述。每个样本的总rna提取的RNApure工具包(Bioteke,北京)。所有的RNA样本retrotranscribed MLV-reverse转录酶(美国卡尔斯巴德英杰公司Inc .)。定量实时PCR进行应用生物系统公司7500实时PCR系统(美国ABI,培养)。引物的序列被用于实时PCR扩增如下:CYLD: 5′-TGCCTTCCAACTCTCGTCTTG-3′, 5′-AATCCGCTCTTCCCAGTAGG-3′;beta-actin: 5′-ACTCGTCATACTCCTGCT-3′, 5′-GAAACTACCTTCAACTCC-3′。每个cDNA样品一式三份。的热循环条件40周期12 s在95°C, 12 s在65°C, 5 s在72°C使用SYBR绿色。

2.4。瞬时转染人类肺癌细胞系CYLD-Flag质粒,质粒的控制

由瞬时转染细胞克隆表达CYLD建立使用lipofectamine +(英杰公司)在人类肺癌细胞株A549和H460,分别。转染24小时后,细胞被免疫印迹分析收集和分析。超表达的阳性克隆CYLD筛选。设计简单,越来越集中的G418治疗CYLD-flag-transfected细胞或pcDNA3.1 plasmid-transfected A549和H460细胞。G418的最终浓度是0,200,400,600,800,1000μ分别g / mL。转染细胞治疗和死亡表示G418集中在一个星期,这是确定为适当的筛选浓度稳定的细胞系。接下来,转染细胞被镀成6-well板尽可能少。细胞治疗与适当的G418筛选浓度24小时到负控制细胞的死亡。这里,未经治疗的肺癌细胞A549或H460作为消极的控制。最后,生存克隆数量激增,CYLD表达式被免疫印迹检测分析。稳定转染细胞被保存在我们的实验室。

2.5。流仪结果

CYLD-overexpressing的稳定细胞系A549细胞治疗肿瘤坏死因子- 10 ng / mLα孤独,或TNF - 20 ng / mLα结合10μM pancaspase抑制剂,z-VAD-fmk, 12小时,细胞凋亡率和坏死率测定膜联蛋白v-FITC / PI双染色法分析工具包后协议(圣克鲁斯,美国)。简而言之,这些细胞被洗在PBS缓冲和resuspended绑定缓冲(CaCl HEPES-NaOH 10毫米pH值7.4,25毫米₂和144毫米氯化钠)。然后,染色的染料膜联蛋白V (0.1μ克/μ和π(0.05 L)μ克/μL)添加和孵化为30分钟在黑暗的冰。最后,3×10以上⁵细胞并进行流式细胞仪分析。

在其他治疗,稳定细胞株H460细胞CYLD-flag或消极控制的超表达质粒与TNF -治疗α0 ng / mL,增加浓度的1 ng / mL, 20 ng / mL, 400 ng / mL 20小时。这些细胞被洗在PBS缓冲和resuspended绑定缓冲(CaCl HEPES-NaOH 10毫米pH值7.4,25毫米₂和144毫米氯化钠)。π(0.05μ克/μL)添加和孵化黑暗5分钟在冰和坏死率取决于与PI染色流式细胞仪测定。

2.6。MTT试验

细胞存活率和细胞增殖MTT比色是化验所描述。A549细胞和H460细胞被镀成48-well板和细胞转染CYLD特定核或负控制核24 h, 48 h,分别和72 h。前4小时测试,5毫克/毫升的MTT代理添加到培养基中。在测试之前,紫水晶与100年解散μL (DMSO 10分钟。数据测试的测试波长490纳米。

2.7。免疫印迹

样本由RIPA-buffer(罗氏)和蛋白质浓度由BCA蛋白质测定试剂(皮尔斯,美国)。蛋白质在细胞溶解产物10% sds - page分离和转移到PVDF膜(美国里士满Bio-Rad)在恒定电流400毫安的1 h。膜被封锁在5% BSA / PBS为30分钟,膜是孵化与相关主要抗体在一夜之间在4°C。抗体参与本研究如下:兔多克隆抗体CYLD(产品目录号:11110 - 1 - ap)是获得Proteintech公司(武汉、湖北、中国)。anti-RIP-1抗体(猫。ab2035数量)从Abcam公司获得相应的氨基酸之间的一个地区420年和433年的人类RIPK1兔多克隆抗体。Beta-actin抗体(猫。AM1829B)是一个提供纯化小鼠单克隆抗体在PBS 0.09% (W / V)叠氮化钠和获得Abgent公司。接下来,膜在PBS缓冲洗了三次(每次5分钟)。辣根peroxidase-conjugated山羊anti-rabbit二级抗体在室温下培养了30分钟,这是来自圣克鲁斯生物技术公司开发完成之后,分析了乐队在每个车道。

2.8。统计分析

的数据,采用SPSS软件进行分析。学生的以及用于评估统计学意义。数据显示为平均值±SD。的价值< 0.01被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。检测到低水平的CYLD在临床肺癌标本

为了调查的临床意义CYLD表达式,CYLD基因表达分析在19个肺癌标本和成对paracarcinoma组织实时聚合酶链反应和免疫印迹。在目前的研究中,6例代表如图1。6手术标本的患者诊断为肺腺癌,CYLD表达式被发现在肺腺癌组织和瘤旁组织。paracarcinoma组织相比,相对CYLD表达式在mRNA水平和蛋白质水平显著降低肺癌相比,在成对paracarcinoma组织()。在这里,β肌动蛋白作为内部参考。数据归一化β肌动蛋白和表达为平均值±SD。所有的数据表明,CYLD可能作为肿瘤抑制肺癌的进展和发展。

3.2。击倒的CYLD siRNA A549和H460细胞的促进细胞增殖

为了进一步确定CYLD在肺癌细胞的作用,瞬时CYLD-knockdown A549细胞生成使用特定于CYLD三对核。控制核-(北卡罗来纳州siRNA)转染细胞作为消极的控制。如图2(一个),CYLD-siRNA高效表达下调的水平CYLD肺癌A549细胞免疫印迹。此外,特有的干扰影响siRNAs CYLD分别为71.8%,43.6%,和38.5%,分别为(图2 (b))。接下来,三双CYLD-siRNAs被用来使转染的肺癌细胞系MTT比色和细胞增殖试验。如数据所示2 (c)和2 (d),细胞生存能力显著增加CYLD-knockdown A549细胞和H460细胞相比,在北卡罗来纳州siRNA-transfected细胞转染48小时和72小时后(,,相比之下,北卡罗来纳州siRNA-transfected细胞)暗示击倒CYLD在A549肺癌细胞明显促进细胞增殖和H460细胞。

3.3。转染pcDNA3.1 ()-CYLD质粒增加CYLD肺癌细胞系中表达,促进细胞死亡

此外,肺癌细胞株A549和H460转染与pcDNA3 (+) / CYLD-flag质粒和控制质粒为24小时。CYLD的水平明显增加CYLD-flag质粒转染A549细胞和H460细胞(图3(一个)通过免疫印迹分析。后的相对表达水平CYLD CYLD超表达在A549细胞和H460细胞明显高于(3.37±0.16,2.67±0.17倍),相比之下,在pcDNA3.1质粒转染A549和H460细胞。因此,MTT比色细胞增殖也化验。如数据所示3 (c)和3 (d)A549细胞增殖,细胞或H460细胞显著减少比未经处理的细胞()。所有的结果表明,过度的CYLD促进细胞死亡和CYLD人类肺癌细胞的抗肿瘤活性。

3.4。过度的CYLD-Flag诱发肺癌细胞的细胞坏死

接下来,抗肿瘤机制活动CYLD进一步探索。首先,我们问是否过度CYLD-flag可以诱导细胞凋亡,这可能导致CYLD-induced细胞死亡。如图4(一),A549细胞治疗肿瘤坏死因子- 10 ng / mLα孤独,或TNF - 20 ng / mLα结合10μM的pancaspase抑制剂,z-VAD-fmk 12小时。细胞凋亡率由膜联蛋白v-FITC / PI双染色分析。结果表明,治疗后肿瘤坏死因子- 10 ng / mLα12小时在TNF -细胞凋亡率增加α治疗组相比,在TNF -α加上z-VAD-fmk治疗组()。此外,过度CYLD TNF -增加α在A549细胞诱导细胞凋亡。令人惊讶的是,有趣的是,治疗后与TNF -α或肿瘤坏死因子-α+ z-VAD-fmk CYLD-transfected PI-positive率显著的细胞(,而热。质粒转染细胞),这表明过度的CYLD可能是导致肺癌细胞的细胞坏死。

3.5。过度的CYLD增强TNF -α全身的细胞肺癌细胞的坏死

TAB-TAK1-NF -κ复合诱导B细胞在肿瘤坏死因子-生存α/ TNF-R1信号通路;然而,CYLD NF -的负面调节器κB信号通路导致细胞凋亡和坏死。在这里,肺癌细胞株与CYLD-flag H460细胞转染质粒和处理增加浓度(0 ng / mL, 1 ng / mL, 20 ng / mL,和400 ng / mL)的肿瘤坏死因子-α为24小时。如图5(一个)细胞坏死是由与PI染色和流式细胞仪测定结果表明,坏死率显著增加TNF -浓度增加α。此外,坏死率明显高于CYLD-overexpressed H460细胞比pcDNA3.1质粒转染H460细胞()(图5 (b))。此外,如图5 (c),TNF -坏死率明显增加α和z-VAD-fmk治疗细胞相比,细胞治疗的肿瘤坏死因子-α独自一人()。所有的数据显示,过度的CYLD促进肺癌细胞坏死细胞。

3.6。肿瘤坏死因子-α全身的细胞坏死是由Receptor-Interacting蛋白1 (RIP-1)激酶

RIP-1被认为是一个关键的上游调节器控制炎症信号激活的细胞凋亡和坏死,由ubiquitylation严格控制和deubiquitylation。为了确定TNF -α全身的细胞坏死是依赖RIP-1 CYLD-overexpressed H460细胞,两双可以阻止特定于RIP-1旨在干扰内源性RIP-1 CYLD-flag转染H460细胞。如数据所示6(一)和6 (b),RIP-1表达明显减少和坏死率明显减少RIP-1核转染细胞(,相比之下,北卡罗来纳州siRNA-transfected H460细胞)。

此外,CYLD-overexpressed H460细胞治疗肿瘤坏死因子- 100 ng / mLα结合或没有10μM的z-VAD-fmk 24小时。Necrostatin-1 (Nec-1)抑制细胞坏死allosterical RIP-1激酶活性的抑制。在其他治疗,10μM Nec-1同时添加到细胞,如图6 (c),而细胞坏死率明显降低了价格相比没有z-VAD-fmk(集团)。此外,CYLD-overexpressed H460细胞治疗肿瘤坏死因子- 100 ng / mLα结合不同浓度的Nec-1 24小时,包括0μ0.1米,μ1.0米,μ10 M,μ分别为M(图6 (d))。Nec-1浓度的增加,坏死率明显下降而与细胞没有Nec-1 ()。有趣的是,RIP-1的表达水平没有明显改变Nec-1浓度的增加,这表明Nec-1治疗不影响RIP-1内源性表达的蛋白质(图6 (d))。

4所示。讨论

肺癌是世界上最常见的一种癌症。当前可用的治疗先进或者转移肺癌的效果和副作用有限总体存活率(20.,21]。因此,重要的是要明确清晰,潜在的发病和进展的确切分子机制和信号通路的肺癌。此外,新的潜在治疗肺癌治疗的策略探索。一般来说,肺癌的发病机理是参与一个复杂和多步过程,特别是pro-oncogenes的激活和肿瘤抑制基因的失活。报道,CYLD是一个肿瘤抑制,调节细胞凋亡和necroptosis充当deubiquitinating酶(22]。它也与其他信号通路,比如NF-kappaB通路(11,23,24)、物/ AP1信号通路(25),toll样受体2信号[26],notch信号(27]。或损失CYLD差别先前的研究发现,对这些基因在人类乳腺癌[19)和慢性淋巴细胞白血病(28)和突变引起的CYLD两个临床不同癌症综合症(29日]。邓等人发现,在人类肺癌细胞,overexpressing CYLD增强抗肿瘤活性跟踪通过抑制NF-kappaB生存信号(30.]。本研究的目的是探讨是否以及如何CYLD调节细胞坏死在肺癌细胞和分子机制的进一步阐明了CYLD在肺癌的发展。

首先,我们发现CYLD表达式通过实时聚合酶链反应和免疫印迹分析39肺癌标本和配对paracarcinoma组织。结果很明显的差别表明对这些CYLD在肺癌标本观察,我们认为CYLD可能作为肿瘤抑制癌症发展和进展(11,31日]。这是一致的结果中et al。32),他们证明了四种基因,包括cylindromatosis, CD9,激活转录因子3,和催产素受体,主要由组蛋白脱乙酰作用,在肺肿瘤也经常表达下调。接下来,三双CYLD特定siRNAs旨在降低内生CYLD在人类肺癌细胞株A549和H460。MTT测定结果表明,干扰CYLD的表达显著增加A549和H460细胞的增殖(,而北卡罗来纳州siRNA-transfected细胞)。相反,我们构造了一个表达载体pcDNA3.1 (+) -CYLD质粒和肺癌细胞转染pcDNA3.1 (+) -CYLD增加CYLD在肺癌细胞的水平。正如我们所料,MTT测定结果表明,过度的CYLD明显减少或H460细胞A549细胞的增殖与未经处理的细胞()。这是一致的结果CYLD upregulation导致泛素链的降解RIP1和随后caspase-8活化和细胞凋亡33]。

我们发现,过度CYLD导致肺癌细胞的细胞死亡。我们想进一步确定细胞死亡是由于细胞凋亡或坏死。正如我们知道的,复杂的花絮,包括RIP1 TRADD, FADD (FAS-associated死域),RIP3, pro-caspase-8,和FLICE抑制蛋白(翻转),是重要的细胞凋亡,而形成的复杂的IIb,包括caspase-8 FADD、RIP1, RIP3,和混合血统激酶域(MLKL)蛋白质,导致necroptosis [34]。在目前的研究中,治疗与肿瘤坏死因子-半胱天冬酶抑制剂zVAD-fmk明显增加α全身的细胞坏死。我们还发现,过度的CYLD TNF -增加α全身的细胞程序性细胞凋亡和坏死。CYLD Polyubiquitinated RIP1是一个已知的衬底,deubiquitinase涉及细胞凋亡和坏死的过程信号。重要的是,预处理与z-VAD-fmk显著增加依赖于RIP1激酶的细胞坏死。此外,Nec-1 RIP-1抑制剂,抑制肿瘤坏死因子的细胞凋亡率α全身的细胞坏死,但这并不影响在CYLD-overexpressed RIP-1肺癌细胞的表达。因此,CYLD的调整可能是一个有效的和有前途的人类肺癌的治疗方法。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突的存在。

确认

支持的工作是福建的科技项目(批准号:2015 y004 2016 y0012]。